Estrazione e rilevamento di geosmina e 2-metilisoborneolo in acqua e pesci utilizzando sonde di estrazione assorbente ad alta capacità e GC-MS

Sommario

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro completamente automatizzato per l'estrazione di geosmina e 2-metilisoborneolo da acqua e tessuti di pesci ricchi di lipidi. Il metodo consente il rilevamento precoce di queste molecole prima che raggiungano le soglie di odore. Vengono forniti dati rappresentativi provenienti da un ambiente di acquacoltura.

Abstract

La geosmina e il 2-metilisoborneolo sono composti organici volatili di origine microbica che si trovano frequentemente nei sistemi di acquacoltura a ricircolo e conferiscono odori e sapori sgradevoli ai pesci al loro interno, anche a concentrazioni estremamente basse. I metodi analitici esistenti per questi composti nei pesci faticano a raggiungere una produzione di campioni sufficiente e spesso non sono automatizzati, richiedendo un'ampia preparazione pratica. Abbiamo sviluppato metodi per analizzare la geosmina e il 2-metilisoborneolo rispettivamente dall'acqua e dai tessuti dei pesci, utilizzando una sonda metallica con una fase di estrazione assorbente ad alta capacità. È stata ottenuta una rilevazione robusta e quantitativa sia dall'acqua che dai tessuti dei pesci, con limiti minimi di rilevamento di 1,2 ng/L per la geosmina e di 1,1 ng/L per il 2-metilisoborneolo dall'acqua e di 18,1 ng/kg e 13,6 ng/kg, rispettivamente, dai tessuti dei pesci. Queste concentrazioni erano ben al di sotto delle soglie di rilevamento per l'uomo. Quindi, abbiamo concluso che questi metodi potrebbero rilevare la geosmina e il 2-metilisoborneolo prima che diventino percepibili dall'uomo. A differenza di altre tecniche di estrazione con sorbimento ad alta capacità, come l'estrazione con assorbente a barra di agitazione, questa tecnica è completamente automatizzabile, migliorando notevolmente la produttività e precludendo gli errori di manipolazione manuale, mentre il design durevole della sonda preclude la rottura, come è comune con la fibra di microestrazione in fase solida (SPME). Questo metodo è adatto per il monitoraggio degli odori in tutti i contesti di qualità dell'acqua, nonché per il rilevamento di composti dal sapore sgradevole in matrici solide e semisolide.

Introduzione

La geosmina (GSM) e il 2-metilisoborneolo (MIB) sono presenti naturalmente nell'acqua e nel suolo come sottoprodotti del metabolismo microbico ^1,2. Sebbene non siano generalmente pericolosi per l'ambiente o la salute umana, conferiscono all'acqua odori e sapori sgradevoli "terrosi" e "fangosi", che sono percepibili anche a concentrazioni estremamente basse, fino a 10 e 20 ng/L per GSM e MIB, rispettivamente ^3,4. Pertanto, la presenza di questi odoranti riduce la qualità percepita dell'acqua ed è altamente indesiderabile nella maggior parte dei contesti. Nelle vie navigabili interne, gli odori riducono l'attrattiva per i visitatori e possono suscitare reclami alle autorità ambientali⁵, mentre nell'acqua potabile gli odori conferiscono un odore e un sapore sgradevoli che i consumatori trovano inaccettabili⁶. In effetti, molti paesi hanno imposto limiti normativi sui livelli di odorizzanti nell'acqua potabile, con la Cina che stabilisce 10 ng/L come concentrazione massima di GSM consentita⁷.

I sistemi di acquacoltura a ricircolo (RAS) stanno diventando sempre più importanti nell'industria dell'acquacoltura come mezzo per la produzione ittica. Questi sistemi operano a terra e riutilizzano continuamente l'acqua, riducendo così l'impatto ambientale, ma è necessario un filtraggio esteso dell'acqua RAS per mantenere le condizioni ottimali per l'allevamento ittico. I biofiltri a letto mobile vengono colonizzati dai microbi a causa dell'abbondanza di sostanze nutritive nelle feci dei pesci e nel mangime non consumato⁸. Questi microbi sono utili per la rimozione delle scorie azotate e dei nutrienti in eccesso; tuttavia, alcune specie possono produrre GSM, MIB e altri odoranti⁴. Questi odori poi penetrano nell'acqua e vengono assorbiti dalla carne del pesce, dove possono conferire odori e sapori sgradevoli che i consumatori trovano discutibili. I valori soglia di odore nella carne di pesce dipendono dalla specie, ma i valori per il salmone atlantico, una specie comune nei RAS, sono 44-500 ng/kg per il GSM e >900 ng/kg per il MIB⁴. Pertanto, gli operatori RAS dovrebbero monitorare regolarmente le concentrazioni di GSM e MIB nei loro sistemi per garantire che non raggiungano livelli problematici⁴. I pesci colpiti possono essere eliminati dai composti sgradevoli prima della raccolta per recuperare la qualità del filetto; Tuttavia, si tratta di un processo costoso che richiede all'impianto di interrompere il ricircolo dell'acqua e di far scorrere invece nuova acqua attraverso il sistema per 10-14^giorni. Dato che il GSM e il MIB rappresentano un problema persistente ed economicamente costoso in un'ampia gamma di settori, ha senso rivalutare e migliorare i metodi analitici per il rilevamento. Idealmente, gli operatori RAS dovrebbero essere in grado di monitorare sia l'acqua RAS per identificare l'aumento delle concentrazioni di GSM e MIB prima che diventino problematiche, sia i tessuti dei pesci per determinare se e in che misura i livelli di GSM e MIB hanno influenzato la qualità del prodotto.

La maggior parte dei metodi per il rilevamento di GSM e MIB utilizza la gascromatografia (GC) con uno spettrometro di massa (MS) o un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) per la separazione e il rilevamento, ma il modo in cui gli odorizzanti vengono inizialmente estratti dalla matrice d'acqua varia notevolmente, con molti metodi pubblicati¹⁰. Il fatto che una tale varietà di metodi sia stata sperimentata e, in effetti, sia ancora in uso di routine parla del fatto che ognuno di essi presenta svantaggi significativi. Questi inconvenienti includono la necessità di campioni di grandi dimensioni e grandi volumi di solvente come nell'estrazione liquido-liquido (LLE), bassa sensibilità e interferenza dell'acqua come nei metodi basati sullo spazio di testa, o problemi estesi con il carryover e la contaminazione del sistema come nel purge e trap (P e T).

L'estrazione ad assorbimento copre una gamma di tecniche di estrazione in cui una fase di assorbimento solido può essere utilizzata per estrarre gli odorizzanti dallo spazio di testa sopra un campione o dal campione stesso tramite immersione diretta¹⁰. Queste tecniche sono compatibili con volumi di campione inferiori rispetto ad altre tecniche, non richiedono solventi e non sono in genere gravemente influenzate dall'interferenza dell'acqua. Tuttavia, la forma più comune di estrazione per assorbimento, la microestrazione in fase solida (SPME), utilizza solo un piccolo volume di fase assorbente con bassa capacità per gli analiti, il che limita l'efficienza dell'estrazione. Inoltre, le fibre fragili coinvolte possono danneggiarsi o rompersi¹¹, interrompendo i flussi di lavoro. L'estrazione con agitatore assorbente (SBSE) supera queste difficoltà con un volume di fase maggiore e un design più durevole, ma non è facilmente automatizzabile, richiedendo il trasferimento manuale degli ancor nei campioni e dai campioni ai tubi di desorbimento termico¹². Nel contesto della grigliatura dell'acqua di routine, in cui un'elevata produttività è fondamentale, questa mancanza di automazione è un ostacolo significativo.

L'obiettivo del nostro metodo è quello di migliorare i metodi sopra menzionati per quanto riguarda la produttività del campione e la capacità complessiva di estrazione dell'assorbente. Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnica che utilizza sonde di estrazione assorbente ad alta capacità (HCSE), combinando l'elevata capacità e robustezza dell'analita di SBSE con la selezione di fase e l'automazione di SPME per l'analisi quantitativa e ad alto rendimento di GSM e MIB. Con alcune modifiche, la tecnica può essere applicata sia a campioni d'acqua che a campioni di tessuto ittico omogeneizzato. Qui, descriviamo il protocollo in modo completo e presentiamo i dati di convalida che dimostrano che è riproducibile, lineare e altamente sensibile. Sebbene i campioni di acquacoltura siano utilizzati a scopo dimostrativo, il protocollo è adatto per il monitoraggio degli odorizzanti in un'ampia gamma di tipi di campioni, tra cui acque, terreni e vari alimenti. Grazie all'automazione completa, il protocollo è particolarmente vantaggioso quando si prevede che il numero di campioni sia elevato.

Protocollo

I campioni di pesce sono stati raccolti da animali che erano già stati macellati per il consumo umano. Pertanto, non è stata richiesta alcuna autorizzazione etica.

1. Preparazione della taratura e degli standard interni

1. Preparazione dello standard di taratura
   1. Preparare la soluzione madre C1 aggiungendo 10 μL di geosmina e una soluzione di 2-metilisoborneolo (100 μg/mL) a un matraccio tarato da 100 mL e riempiendo a volume con metanolo di grado LC-MS. La soluzione risultante conterrà ciascun analita a 10 μg/L (ppb).
   2. Preparare gli standard di taratura aggiungendo la soluzione madre C1 nel volume indicato nella Tabella 1 a un matraccio tarato da 100 mL e riempirlo a volume con acqua deionizzata.
   3. Prepara nuovi standard di calibrazione ogni giorno, poiché sono estremamente deperibili.
      NOTA: È importante preparare queste soluzioni stock fresche ogni giorno.
2. Preparazione interna degli standard
   1. Preparare la soluzione madre (I1) aggiungendo 10 mg di 2-isopropil-3-metossipirazina (IPMP) (pura al >98%) a un matraccio tarato da 1 L riempito in volume con metanolo di grado LC-MS per ottenere una consistenza di 10 mg/L.
   2. Pipettare 100 μl di soluzione I1 in un matraccio tarato da 100 mL e riempire a volume con acqua deionizzata per ottenere la soluzione I2 (10 μg/L). Versare 50 μl in ogni fiala del campione per raggiungere una concentrazione finale di 100 ng/l.

2. Analisi dell'acqua

1. Preparazione del campione
   1. Inserire una fiala da 20 ml per ogni campione d'acqua da analizzare nel vassoio del campione.
   2. Utilizzando una bilancia calibrata, pesare e inserire 2,5 g di NaCl in ogni fiala di campione da 20 mL.
      NOTA: L'aggiunta di sale migliora il trasferimento del MIB e della geosmina dall'acqua allo spazio di testa.
   3. Utilizzando una pipetta o un dispenser per flaconi, aggiungere 5 ml di acqua campione a ciascuna fiala da 20 mL di campione con tappo a crimpare.
   4. Pipettare 50 μl della soluzione standard interna I2 per ciascun campione, standard di calibrazione e qualsiasi campione QA/QC, compresi i bianchi.
   5. Posizionare il tappo sulla parte superiore della fiala e sigillarlo con una pinza a crimpare per fiale per ridurre al minimo la perdita di analita.
   6. Processa solo 1-2 campioni alla volta e sigilla rapidamente ogni fiala una volta completata per ridurre al minimo la perdita di analiti volatili.
2. Estrazione dell'analita (acqua)
   1. Posizionare il vassoio del campione sul supporto del vassoio dell'autocampionatore.
   2. Per preparare un metodo dello strumento, aprire il programma dello strumento e fare clic sull'Editor dei metodi.
      1. Creare un nuovo metodo inserendo i seguenti parametri nell'editor dei metodi (lasciando gli altri parametri ai valori predefiniti):
      2. In "Pre-campionamento", impostare il tempo di agitazione della fiala su 10 minuti per consentire agli analiti di separarsi dall'acqua allo spazio di testa.
      3. In "Campionamento", impostare la temperatura di incubazione su 65 °C, il tempo di incubazione su 30 minuti e la velocità dell'agitatore su 400 giri/min.
      4. Assicurarsi che la sonda HiSorb di lavaggio sia abilitata; In caso contrario, la matrice del campione residuo potrebbe contaminare il sistema.
      5. In 'Desorbimento della sonda', impostare il tempo di desorbimento su 15 min e latemperatura di assorbimento D su 270 °C.
      6. Nelle impostazioni della trappola, impostare la bassa temperatura della trappola su 25 °C e il "flusso diviso" su 8 ml/min.
   3. Eseguire il metodo dell'autocampionatore insieme al metodo GC-MS premendo il pulsante Start su ciascuno dei rispettivi programmi.

3. Analisi dei tessuti ittici

1. Preparazione del campione
   1. Inserire una fiala da 20 ml per ogni campione di pesce da analizzare nel vassoio del campione.
   2. Omogeneizzare il tessuto del pesce utilizzando un robot da cucina disponibile in commercio.
   3. Utilizzando una bilancia calibrata, pesare 1,00 g di tessuto di pesce omogeneizzato in ciascuna fiala.
   4. Pipettare 5 mL di soluzione satura di NaCl in ciascun flaconcino.
   5. Pipettare 100 μl della soluzione standard interna I2 per ciascun campione, campione di calibrazione ed eventuali campioni QA/QC.
   6. Posizionare un tappo sulla parte superiore della fiala e sigillare con la pinza a crimpare per fiale.
   7. Preparare solo 1-2 campioni alla volta per ridurre la perdita di composti semivolatili e volatili.
2. Estrazione dell'analita (pesce)
   1. Posizionare il vassoio del campione sul supporto del vassoio dell'autocampionatore.
   2. Preparare un metodo dello strumento come segue (lasciando gli altri parametri ai valori predefiniti).
      NOTA: il tempo di agitazione della fiala prima del campionamento e la temperatura di incubazione differiscono dalla Sezione 2.2.2.
      1. In "Pre-campionamento", impostare il tempo di agitazione della fiala su 20 min.
      2. In "Campionamento", impostare la temperatura di incubazione a 80 °C, il tempo di incubazione a 30 minuti e la velocità dell'agitatore a 400 giri/min.
      3. Assicurarsi che l'opzione "Wash HiSorb probe" sia abilitata, altrimenti la matrice del campione residuo potrebbe contaminare il sistema.
      4. In 'Desorbimento della sonda', impostare il tempo di desorbimento su 15 min e la temperatura di desorbimento su 270 °C.
      5. Nelle impostazioni della trappola, impostare la bassa temperatura della trappola a 25 °C e dividere il flusso a 8 mL/min.
         NOTA: In questo caso è necessaria una fase di precampionamento più lunga e più calda a causa della maggiore affinità di MIB e GSM per i tessuti dei pesci ricchi di lipidi rispetto all'acqua.
   3. Eseguire il metodo dell'autocampionatore insieme al metodo GC-MS premendo il pulsante Start su ciascuno dei rispettivi programmi.

4. Separazione e rilevamento mediante GC-MS

1. Utilizzare gli stessi parametri GC-MS per i metodi dell'acqua e dei tessuti dei pesci.
2. Assicurarsi che il GC sia dotato di una colonna da 5 MS, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm e che sia alimentato con gas di trasporto elio ultrapuro. Impostare la portata del vettore su 2 mL/min.
3. Preparare un programma del forno GC come segue: una temperatura iniziale di 60 °C, mantenuta per 3 minuti, quindi una rampa di temperatura da 10 °C/min a 100 °C, quindi da 20 °C/min a 190 °C, quindi da 30 °C/min a 280 °C, con un tempo di mantenimento finale di 2 minuti. Il tempo di esecuzione totale è impostato su 16,5 min.
4. Impostare la linea di trasferimento tra GC e MS a 280 °C e la sorgente di ioni e il quadruplo rispettivamente a 250 °C e 200 °C.
5. Per il rilevamento MS in modalità di scansione, utilizzare un intervallo di scansione di m/z 50-350.
6. Per il funzionamento di monitoraggio degli ioni selezionati (SIM), utilizzare ioni di quantificazione e conferma rispettivamente di m/z 95 e 107 per MIB, m/z 137 e 152 per IPMP e m/z 112 e 55 per GSM.
   NOTA: Molti pacchetti software per cromatografia includono la selezione automatica dei picchi, ma si consiglia vivamente di rivedere manualmente la selezione dei picchi per individuare eventuali errori.

Risultati

Ottimizzazione del metodo

Sono stati condotti vari esperimenti per garantire l'ottimizzazione del metodo, tra cui una valutazione del carryover, l'ottimizzazione del tempo di desorbimento della sonda, una valutazione standard interna, una valutazione della fase della sonda, una valutazione della linearità e della ripetibilità e il calcolo del limite di rilevamento del metodo.

Valutazione del riporto

Abbiamo iniziato il nostro esperimento con una temperatura di desorbimento della sonda di 250 °C. Sono stati preparati gli standard di calibrazione, come mostrato nella Tabella 1. Per valutare il carryover, abbiamo analizzato gli standard GSM e MIB a 20 ng/L e poi abbiamo proceduto, nell'ordine, con un run dei parametri GC-MS senza iniettare nulla nella colonna (colonna in bianco), un desorbimento della trappola di focalizzazione senza trasferire nulla dall'iniettore (trappola in bianco), un riscaldamento dell'iniettore senza inserire una sonda (iniettore in bianco), e un desorbimento della sonda senza campionamento preliminare (sonda in bianco). È stato osservato un carryover inferiore all'1% nel bianco della colonna, nel bianco della trappola e nel bianco dell'iniettore, ma nel bianco della sonda, il carryover è stato del 9,35% e del 3,77% rispettivamente per GSM e MIB (Tabella 2). Pertanto, abbiamo stabilito che c'era un significativo riporto di GSM sulla sonda PDMS nelle condizioni utilizzate.

Ottimizzazione del tempo di desorbimento

Dopo aver identificato il carryover sulla sonda PDMS, abbiamo cercato di risolvere il problema regolando la temperatura di desorbimento della sonda. Ci si aspetterebbe che una temperatura di desorbimento della sonda più elevata aumenti il tasso di desorbimento dell'analita dalla sonda in modo tale che il desorbimento sia più completo entro la fine del tempo di desorbimento della sonda di 15 minuti. Tuttavia, una temperatura più elevata potrebbe anche favorire la rottura dell'analita e, quindi, influire negativamente sulla sensibilità. Temperature più elevate possono anche danneggiare i materiali assorbenti, quindi è necessario evitare temperature superiori a 280 °C. Il carryover di GSM era significativo alla temperatura di desorbimento della sonda di 250 °C, ma si è ridotto sostanzialmente al di sotto della soglia di accettabilità del 5% quando invece si è utilizzato 270 °C (Figura 1). Questo miglioramento è stato ottenuto senza perdita di sensibilità, con aree di picco prodotte per l'analisi iniziale non più piccole a 270 °C rispetto a temperature di desorbimento della sonda più basse (Figura 1). Ciò indica che qualsiasi aumento della degradazione dell'analita è trascurabile.

Utilizzo di standard interni

Il composto 2-isopropil-3-metossipirozina è stato ampiamente impiegato come standard interno durante la rilevazione di GSM e MIB¹³. Abbiamo confrontato le concentrazioni calcolate di GSM e MIB con le concentrazioni spiked note, sia con che senza correzione standard interna. Il recupero senza correzione standard interna è stato scarso, con concentrazioni calcolate nel 60% delle concentrazioni spiked note (Figura 2). Al contrario, con l'applicazione della correzione standard interna, il recupero è stato molto buono, nell'ordine del 100%. Pertanto, abbiamo applicato la correzione standard interna in tutte le analisi future.

Selezione della fase

Nelle analisi SPME, il carbonio ad ampio intervallo (CWR) e/o il divinilbenzene (DVB) vengono spesso aggiunti al PDMS per migliorare la sensibilità, ma ciò aumenta i costi. Abbiamo cercato di confrontare le sonde solo PDMS con le sonde a tripla fase (DVB/CWR/PDMS), considerando che l'aumento del volume di fase della sonda è probabile che migliori la sensibilità rispetto alle fibre SPME. I dati di recupero per le sonde PDMS e trifase (Figura 3) illustrano prestazioni sostanzialmente simili tra i due tipi di sonde, con recuperi leggermente più vicini al 100% con le sonde PDMS. Pertanto, date le prestazioni leggermente superiori e i costi ridotti, abbiamo eseguito tutte le analisi future con le sonde PDMS. Va notato che, poiché la sonda raccoglie gli analiti dallo spazio di testa e non tramite contatto diretto con la matrice del campione, la cinetica del partizionamento GSM/MIB al materiale di fase non dovrebbe differire tra i campioni di acqua e quelli di pesce.

Convalida del metodo

È stata analizzata una serie di tarature che copre sei concentrazioni di analiti in acqua da 1 a 100 ng/L (Figura 4). È stata raggiunta un'eccellente linearità, con r² di 0,9999 per GSM e 0,9999 per MIB. L'errore standard di regressione era 0,43 e 0,37 rispettivamente per GSM e MIB. Ciò indica che il metodo è adatto per analisi quantitative nell'intervallo valutato. Abbiamo determinato la ripetibilità da otto repliche di standard di laboratorio contenenti GSM e MIB a 40 ng/L in acqua. I valori di RSD sono stati del 6,3% per il GSM e del 4,8% per il MIB, dimostrando una notevole riproducibilità dei risultati. Queste repliche sono state analizzate in tre lotti separati in giorni diversi, dimostrando ulteriormente la precisione del metodo. Pertanto, l'HCSE con l'analisi GC-MS è un metodo quantitativo e affidabile.

Limiti minimi di rilevamento (MDL)

L'MDL è stato calcolato secondo il protocollo¹⁴ dell'EPA degli Stati Uniti utilizzando acqua addizionata (n=10) o campioni di pesce addizionati (n=11). Il metodo per l'estrazione e la rilevazione di GSM e MIB nell'acqua ha prodotto limiti di rilevamento di 1,2 ng/L per GSM e 1,1 ng/L per MIB. Questi MDL erano molto al di sotto dei valori soglia dell'odore umano di circa 10 e 20 ng/L, rispettivamente. Pertanto, il metodo proposto può rilevare con sicurezza e quantità l'accumulo di queste molecole odorose prima che raggiungano le soglie sensoriali umane. Limiti di rilevamento per l'estrazione e la rilevazione di GSM e MIB dal pesce prodotto Limiti di 18,1 ng/kg per il GSM e di 13,6 ng/kg per il MIB.

Analisi di campioni di acqua proveniente dall'acquacoltura

Abbiamo analizzato campioni d'acqua prelevati da sette sistemi di acquacoltura a ricircolo, con cinque repliche (sistema 3) o tre repliche (tutti gli altri sistemi) valutate per ciascuno. Tutti i sistemi di acquacoltura a ricircolo analizzati, tranne uno, contenevano geosmina e MIB a concentrazioni superiori al nostro MDL (Figura 5), indicando un potenziale problema con la qualità dell'acqua. Tuttavia, abbiamo notato che in tutti i casi, il MIB era ben al di sotto della soglia di odore umano di 20 ng/L, mentre solo un sistema ha superato la soglia di odore GSM di 10 ng/L (sistema 1, concentrazione GSM = 12,69 ng/L). Sebbene abbiamo rilevato GSM e MIB nel sistema 3, notiamo che la concentrazione per MIB scende al di sotto dei nostri MDL calcolati e, pertanto, la concentrazione non può essere quantificata con sicurezza. Il metodo ha dimostrato una precisione impressionante in tutti i sistemi, nonostante l'uso di campioni d'acqua del mondo reale, con una variazione molto ridotta nella concentrazione calcolata tra i campioni replicati in ciascun sistema (Figura 5).

Analisi dei tessuti ittici

Il tessuto di pesce, ricco di lipidi, conferisce un forte effetto matrice che impedisce l'estrazione di GSM e MIB durante questo metodo. Per questo motivo, vengono apportate sottili modifiche al metodo per aumentare l'efficienza di estrazione, tra cui una temperatura di incubazione più elevata (80 °C) e un tempo di incubazione più lungo (20 minuti) rispetto al metodo di estrazione con acqua. I tessuti dei pesci sono stati precedentemente analizzati per determinare le concentrazioni di fondo GSM e MIB. Quegli stessi campioni sono stati poi addizionati con una quantità nota di GSM e MIB e analizzati in triplicato per determinare la percentuale di recupero e la precisione (Figura 6).

Figura 1: Effetto della temperatura di desorbimento della sonda sul carryover. (A) Uno standard di laboratorio contenente GSM e MIB a 20 ng/L è stato analizzato a una delle tre temperature di desorbimento della sonda in triplice copia, con aree di picco medie. Ogni sonda è stata successivamente desorbita altre due volte alla temperatura iniziale per valutare il carryover con risultati in (B) (GSM) e (C) (MIB). Il carryover è espresso come area di picco come percentuale dell'area di picco iniziale. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard in tre repliche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Utilizzo standard interno. Confronto tra i dati di recupero dati corretti e non corretti per standard analitici a 15 o 40 ng/L, con estrazione solo con sonde PDMS. Le concentrazioni dei campioni sono state corrette con l'uso dell'IPMP come standard interno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 3: Recupero dell'analita. Dati di recupero per standard analitici di GSM (a sinistra) e MIB (a destra) a 15 ng/L, con estrazione tramite sonde solo PDMS o a tripla fase (PDMS, DVB, CWR). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Curve di taratura analitica. Regressioni lineari di curve di calibrazione per GSM (linea continua, r² di 0,9999; S=0,37) e MIB (linea tratteggiata, r² di 0,9999; S=0,37). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Applicazione dell'acqua per acquacoltura. Concentrazioni di (A) GSM e (B) MIB in campioni di acqua prelevati da sette sistemi di acquacoltura (n ≥ 3 per ciascun sistema). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 6:  Applicazione di tessuti di pesce. Concentrazioni di GSM e MIB da due campioni di pesce addizionati con GSM e MIB (F1 e F2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome della soluzione	Aggiunto volume C1 di serie	Volume totale	Concentrazione risultante
Calcio C1	10ul	100 ml	10 ug/ml
Cal 1	10 ul	Confezione da 100 ml	1 ng/L
Cal 2	20 ul	Confezione da 100 ml	2ng/L
Cal 5	50 ul	Confezione da 100 ml	5 ng/L
Cal 10	100 ul	Confezione da 100 ml	10 ng/L
Cal 20	200 ul	Confezione da 100 ml	20 ng/L
Cal 50	500 ul	Confezione da 100 ml	50 ng/L
Cal 100	1000 ul	Confezione da 100 ml	100 ng/L
Cal 200	2000 ul	100 ml	200 ng/L

Tabella 1: Standard di taratura. Gli standard di geosmina e 2-MIB sono tutti costituiti da CRM47525 soluzione di geosmina e 2-metilisoborneolo (100 μg/mL) in metanolo diluito in una soluzione madre C1 (10 μg/ml) in metanolo.

Analisi	Riporto (%)
	GSM	MIB
Corsa GC	0.04	0.08
Desorbimento della trappola	0.09	0
Desorbimento in ingresso	0	0
Risorbimento della sonda	9.35	3.77

Tabella 2: Valutazione del carryover della sonda. Carryover dopo l'estrazione, il desorbimento e l'analisi GC-MS di uno standard di laboratorio contenente GSM e MIB a 20 ng/L, con IPMP standard interno a 30 ng/L. Le descrizioni delle analisi sono riportate al punto 2.2.1.

Discussione

GSM e MIB sono composti di sapore sgradevole che si verificano in un'ampia gamma di impostazioni di monitoraggio dell'acqua e la domanda di capacità di test è elevata. Inoltre, GSM e MIB sono percepibili dall'uomo a livello di tracce. Un sistema analitico ideale deve, quindi, combinare un'elevata sensibilità con un'elevata produttività per produrre elevati volumi di dati di qualità. Abbiamo dimostrato nelle sezioni precedenti che l'estrazione con le sonde HCSE fornisce una sensibilità superiore a quella richiesta.

Il design robusto delle sonde HCSE impedisce qualsiasi rottura, un problema che può interrompere i flussi di lavoro SPME. Dopo l'ottimizzazione del metodo, non abbiamo riscontrato difficoltà con la contaminazione o il carryover del sistema, che sono problemi comuni con le metodologie P e T. Il contributo maggiore all'elevata produttività di questo metodo, tuttavia, è venuto senza dubbio dalla piattaforma di autocampionatore utilizzata. Con questo sistema, l'analisi continuava 24 ore su 24, con l'intervento manuale necessario per fornire i campioni solo al vassoio dei campioni. Ciò è in contrasto con altri metodi di estrazione con assorbente ad alta capacità, come SBSE, che richiedono un funzionamento manuale. Sebbene SPME sia comunemente completamente automatizzato, la produttività è limitata in quanto l'incubazione del campione successivo può, in genere, iniziare solo una volta che il campione precedente è stato iniettato nella colonna GC. Supponendo che il tempo di ciclo del GC sia breve, il GC potrebbe, quindi, rimanere inattivo mentre il campione successivo completa l'estrazione. Con il nostro metodo, più campioni possono essere sottoposti contemporaneamente al pre-campionamento e all'estrazione, in modo da ridurre al minimo i tempi di inattività della GC. Pertanto, siamo stati in grado di elaborare 1,8 campioni all'ora per sistema.

Abbiamo dimostrato MDL di 1,2 e 1,1 ng/L rispettivamente per GSM e MIB, superando di gran lunga la sensibilità richiesta. Mentre altre tecniche come P e T, LLE, SBSE e SPME possono essere in grado di raggiungere MDL più bassi in determinate circostanze¹¹, questi aumenti di sensibilità hanno un valore pratico limitato e non giustificano la perdita dei vantaggi delle sonde HCSE descritti sopra. Inoltre, alcune di queste tecniche richiedono grandi volumi di campione, con conseguente aumento della produzione di rifiuti e dei costi di trasporto. Per LLE, i volumi di campione sono tipicamente compresi tra 200 e 500 mL ^15,16,17, mentre per SPME, SBSE e P e T, i valori tipici sono 10 - 100 mL 18,19,20,21,22. Un'eccellente riproducibilità è stata osservata con valori di RSD del 6,34% e del 4,82% rispettivamente per GSM e MIB. Questi valori sono sostanzialmente simili a quelli riscontrati in altri metodi¹¹ e, in particolare, superano gli RSD nei metodi SPME pubblicati^23,24. Anche in questo caso, i nostri bassi valori di RSD sono stati raggiunti con volumi di campione di soli 5 ml, inferiori alla stragrande maggioranza delle tecniche di estrazione pubblicate. Pertanto, siamo fiduciosi che le sonde HCSE forniscano una sensibilità e una riproducibilità sufficienti, insieme a un'ampia gamma di vantaggi che combinano gli aspetti migliori di tutte le principali alternative in un unico metodo semplice, completamente automatizzato e sostenibile.

La geosmina e il 2-metilisoborneolo sono composti lipofili, il che rappresenta una sfida per gli scienziati che cercano di estrarre tali composti dal tessuto ricco di lipidi per l'analisi. Pertanto, abbiamo regolato le nostre condizioni di precampionamento, utilizzando una procedura di precampionamento più lunga e più calda, per guidare più analiti dalla matrice del campione allo spazio di testa. Dopo aver apportato queste modifiche, abbiamo stabilito che il metodo funzionava bene per l'analisi di GSM e MIB nei tessuti dei pesci. Va notato che per campioni con un contenuto lipidico molto elevato, potrebbe essere necessario ridurre la massa del campione utilizzato, ad esempio a 0,50 g. Questo per evitare che i lipidi formino una tenuta completa sulla parte superiore dell'acqua che impedisce agli analiti di raggiungere lo spazio di testa.

Questo metodo utilizza i principi dell'equilibrio per estrarre gli analiti dallo spazio di testa di un campione. Sebbene qui utilizziamo campioni di acqua e pesce provenienti dall'acquacoltura, riteniamo che il metodo sia applicabile all'estrazione di odorizzanti da qualsiasi matrice solida o liquida che può essere omogeneizzata e alloggiata all'interno di una fiala di campionamento da 20 ml. Esempi di applicazioni includono il monitoraggio delle acque e dei suoli ambientali, l'analisi dell'acqua potabile e l'analisi di alimenti come frutta e verdura o di vita acquatica non coltivata in fattoria. In agricoltura, GSM e MIB si trovano spesso in terreni umidi e possono conferire sapori sgradevoli alle colture in essi coltivate², quindi sia i terreni che le colture potrebbero essere testati tramite il nostro metodo per monitorare i livelli di odori come forma di controllo di qualità e/o per diagnosticare la fonte di disturbi maleodoranti. Molte acque ambientali, come fiumi e laghi, sperimentano picchi stagionali nella concentrazione di odorizzanti a causa delle fioriture algali²⁵, e questo metodo offre un mezzo ad alto rendimento e altamente sensibile per monitorare l'entità di questi picchi. Questo metodo è adatto anche per la ricerca accademica, ad esempio per misurare il tasso di produzione di odorizzanti da parte di microrganismi²⁶ o per esaminare la relazione tra le concentrazioni di odorizzanti nell'acqua e nei tessuti animali²⁷. Altri gruppi di ricerca hanno utilizzato il processo HCSE per estrarre da una serie di tipi di campioni come bevande alcoliche²⁸, carne di montone²⁹, olio d'oliva³⁰, terreni di coltura cellulare umana³¹ e pistacchi³². Questi studi hanno preso di mira altri analiti o sono studi di profilazione non mirati e quindi non sono stati ottimizzati per l'analisi di GSM e MIB, ma sono presentati qui in quanto offrono approfondimenti generali sulla preparazione di vari tipi di campioni per l'estrazione delle sonde HCSE.

Mentre il metodo dell'acqua descritto è probabilmente applicabile a tutti i campioni d'acqua o a base d'acqua con modifiche minime, l'applicazione ad altri campioni solidi o semisolidi può richiedere alcune modifiche specifiche della matrice alla preparazione del campione (sezione 3.1) e all'estrazione dell'analita (sezione 3.2). Anche se non sarebbe possibile coprire tutti gli scenari di campionamento qui, offriamo le seguenti considerazioni. (1) I campioni solidi devono essere omogeneizzati in polvere fine mediante grattugiatura, macinazione o miscelazione per garantire la rappresentatività e fornire la massima superficie possibile per l'uscita degli analiti. (2) I campioni solidi con un basso contenuto di lipidi possono non richiedere l'aggiunta di acqua o sale, cioè può essere sufficiente pesare 1,00 g in una fiala e in un tappo. Ciò consentirà un trasferimento più diretto degli analiti dal campione allo spazio di testa, senza un trasferimento intermedio dalla matrice del campione all'acqua aggiunta. Tuttavia, questo ridurrà l'efficacia dell'agitazione. Gli analisti dovrebbero eseguire esperimenti per determinare la tecnica di preparazione del campione ottimale per la loro matrice di campioni. (3) Matrici diverse avranno affinità diverse per GSM e MIB. Pertanto, saranno necessarie diverse temperature di incubazione per raggiungere l'equilibrio dell'analita in modo tempestivo. Tuttavia, alcune matrici possono essere alterate chimicamente dal calore in modo tale che le interferenze siano prodotte da reazioni chimiche ad alte temperature. Anche in questo caso, sono necessari esperimenti per determinare la temperatura di incubazione ottimale per un particolare tipo di campione (nota: i campioni con un alto contenuto di umidità non devono mai essere incubati oltre i 90 °C per evitare che le fiale si frantumino a causa della pressione di vapore dell'acqua bollente).

Abbiamo sviluppato metodi per la rilevazione della geosmina e del 2-metilisoborneolo nell'acqua e nei tessuti dei pesci. I test sugli standard di laboratorio confermano che i metodi sono quantitativi e riproducibili, mentre l'applicazione a campioni del mondo reale (acqua proveniente da sistemi di acquacoltura a ricircolo, tessuti ittici derivati da tali sistemi) dimostra prestazioni anche nel contesto di campioni complessi e sporchi. Sebbene abbiamo applicato i nostri metodi a campioni provenienti dall'acquacoltura, suggeriamo che siano adatti per il monitoraggio GSM e MIB in un'ampia gamma di tipi di campioni, tra cui acqua e materiali solidi o semisolidi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pipetta 0,5-10uL	Nichipet Air	A21405581
1000uL puntali per pipette	VWR	76322-154
100-1000uL pipetta	eppendorf	285612
100mL pallone di vetro	VWR	76008-704
10-100uL pipetta	Nichipet Air	A20814031
10-100uL Puntali per pipette	mega	24502-18
10xL Puntali per pipette	VWR	76322-132
20mL Becher in vetro	VWR	10754-698
2-Isopropil-3-metossipirazina	TCI	I0577	Standard interno
40 ml Ambra tipo-1 (borosilicato) Fiala in vetro	Azienda di campionamento ambientale	0040-0400-QC	Fiala per campionamento dell'acqua
5mL Puntale per pipette	VistaLab tecnologie	4058-5102
Bilancia	VWR	VWR-124B2
Centri 360	Markes	U-CENTRI-1691	Autocampionatore
Chromeleon Versione 7.3	Thermo Scientific		GC-MS Software
Trappola di focalizzazione	Markes	U-T12ME-2S
Gascromatografo, Trace 1310	Thermo Scientific	14800403
Colonna GC	Thermo Scientific	26098-1420	TG-5MS
Soluzione di geosmina e 2-metilisoborneolo	SIGMA-ALDRICH o MilliporeFiala	CRM47525
, 20 mL	Markes	C-VCC20
Impugnatura HiSorb	Markes	C-HH-6
Tappo iniettore HiSorb	Markes	C-HSPCCS
HiSorb rivestimento dell'iniettore	Markes	U-LINER-HISORB
Sonda HiSorb, PDMS, versione corta	Markes	H1-XXABC
Tappi per fiale HiSorb	Markes	C-HSPCCS
a paletta
, ISQ 7000	Thermo Scientific	ISQ7K-NOVPI
Metanolo	VWR prodotti chimici	BDH1135-4LP
Metanolo, grado Optima LC-MS	Fisher-scientific	A456-4
O-ring misura 201	Markes	U-COV201	Per tappo iniettore HiSorb e stoccaggio HiSorb
Pipettatore automatico Ovation (100-5000uL)	Tecnologie VistaLab	213626
Guanti da esame viola in nitrile-Xtra senza polvere	Kimtech	50602-54
Cloruro di sodio ( Sostanze	chimiche VWR	BDH9286-2.5K
Adattatore di commutazione (pipettatore automatico)	CUI INC	SMI10-5
Strumento di crimpatura per fiale	Markes	U-HSVCR
Decapsulatore per fiale	Markes	U-HSVDC
Pesare barche	Grainger	8AG69