Articolo metodologico

Preparazione di Mycobacterium abscessus incluso nella perla di agar per inoculare topi immunocompetenti per via intratracheale

DOI:

10.3791/67602

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25 aprile 2025

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1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I topi sono generalmente resistenti alle infezioni da Mycobacterium abscessus, il che complica la scoperta e lo sviluppo di antibiotici tanto necessari contro le infezioni polmonari. Qui, descriviamo un metodo di preparazione dell'inoculo e dell'infezione intratracheale che ha dimostrato di fornire un'infezione prolungata nei topi immunocompetenti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono assolutamente necessari robusti modelli murini di infezione cronica da Mycobacterium abscessus, un patogeno ambientale che infetta preferibilmente i polmoni. Le terapie multifarmacologiche della durata di un anno offrono tassi di guarigione inaccettabilmente bassi nei pazienti, circa il 50%, da qui la necessità di strumenti preclinici predittivi per sviluppare antibiotici migliori. Tuttavia, i topi immunocompetenti sono generalmente resistenti all'infezione polmonare da M. abscessus. In letteratura sono stati riportati numerosi tentativi di stabilire un'infezione prolungata da M. abscessus in topi immunocompetenti. Tra questi, i metodi che si basano su batteri incorporati in perline di agar inoculati in topi C57BL/6 per via intratracheale si sono dimostrati i più promettenti. Il principale limite di questo approccio è la sfida tecnica associata alla preparazione di perle di agar di dimensioni e numeri batterici riproducibili, seguita dall'inoculazione intratracheale. Qui, forniamo innanzitutto una descrizione dettagliata di un protocollo ottimizzato che rilascia perle di agar caricate con M. abscessus di diametro ottimale e carica batterica riproducibile. Successivamente, forniamo un protocollo dettagliato di inoculazione intratracheale, ottimizzato per evitare perdite di perle e batteri dovute all'aderenza alle superfici dei dispositivi di inoculazione e per ottenere una deposizione polmonare riproducibile di M. abscessus incluso nell'agar. L'obiettivo è garantire la facilità di implementazione e l'eccellente riproducibilità da laboratorio a laboratorio.

Introduzione

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Le opzioni di trattamento per la malattia polmonare da Mycobacterium abscessus (Mab) sono limitate e prevedono regimi multifarmaco della durata di un anno con antibiotici per via orale, parenterale e occasionalmente per via inalatoria, la maggior parte dei quali manca di attività battericida ottimale e sono associati a una tossicità significativa 1,2,3,4,5 . Sono urgentemente necessarie terapie più brevi, più sicure e più efficaci. I modelli murini di infezioni micobatteriche sono stati determinanti per la scoperta e l'ottimizzazione di farmaci e regimi farmacologici efficaci 6,7. Tuttavia, la valutazione preclinica degli antibiotici contro le infezioni da Mab si è rivelata impegnativa a causa della difficoltà di stabilire infezioni polmonari progressive e sostenute nei topi 8,9.

L'infezione di ceppi di topo immunocompetenti con Mab provoca in gran parte una colonizzazione transitoria seguita da una rapida eliminazione del patogeno10,11. Per ottenere l'infezione cronica osservata clinicamente, sono stati utilizzati agenti immobilizzanti come l'agarosio o l'agar per promuovere la persistenza e le risposte immunopatologiche a patogeni opportunisti come Pseudomonas aeruginosa o Haemophilus influenza in topi immunocompetenti 12,13,14. Questo modello è stato recentemente adattato per ottenere l'infezione respiratoria cronica mediante Mab ATCC 19977 in topi immunocompetenti C57BL/6N 15,16,17,18. Il metodo ha indotto un'infezione persistente fino a 45 giorni dopo l'inoculazione intratracheale con ~1 × 104 a 1 × 106 unità formanti colonie (CFU), con un'incidenza di infezione cronica tra i topi infetti del 90%-100%19 e la formazione di granulomi organizzati attorno alla perlina di agar18 disintegrante. Sembra che l'inclusione di Mab nelle perle protegga dalla rapida eliminazione da parte del sistema immunitario innato e che le perle cariche di batteri costituiscano focolai per il reclutamento di cellule immunitarie che portano alla formazione di granulomi e all'instaurazione di infezioni croniche18. Le perle di agar/agarosio costituiscono un biomateriale relativamente inerte che induce risposte infiammatorie minime. Inoltre, le perle si disintegrano lentamente, evitando problemi di reazioni allergiche da corpo estraneo o fibrosi indotta. L'infezione intratracheale con o senza un dispositivo di microspruzzatura garantisce un'efficace deposizione dell'inoculo nei polmoni 8,20,21 e riproduce l'esposizione clinica e l'infezione meglio dell'inoculazione endovenosa o intranasale.

Il modello, quindi, offre molti vantaggi. Tuttavia, comporta anche alcune sfide di natura tecnica, vale a dire (i) ottenere una dimensione riproducibile del microsfone, (ii) ottenere una carica batterica riproducibile del perlato e (iii) garantire una somministrazione intratracheale costante dell'inoculo. In questo caso, forniamo protocolli dettagliati per raggiungere in modo affidabile questi obiettivi e garantire la riproducibilità da laboratorio a laboratorio.

Protocollo

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Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del NIAID (NIH), Bethesda, MD. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali. Tutti gli studi che hanno coinvolto M. abscessus sono stati condotti in un laboratorio con livello di contenimento di biosicurezza 2.

1. Preparazione dell'inoculo di M. abscessus incorporato in perle di agar

  1. Preparare una pre-coltura di M. abscessus ATCC 19977 inoculando 1,5 mL di coltura a densità ottica (OD600) 1 (utilizzando uno spettrofotometro) in 200 mL di terreno Middlebrook 7H9 integrato con 0,05% (v/v) Tween 80, 0,5% (v/v) glicerolo e 10% (v/v) di albumina-destrosio-catalasi (ADC) di Middlebrook.
  2. Incubare le colture in una bottiglia a rullo a 37 °C per 24 ore fino a raggiungere la fase di metà log (OD600 = 0,4-0,6).
  3. Sospendere 1,2 g di Brodo di Soia Trittico (TSB) in 40 ml di acqua ultrapura e aggiungere 0,6 g di Difco Agar a una concentrazione finale dell'1,5%.
  4. Trasferire 60 ml di olio minerale pesante in un pallone di Erlenmeyer da 500 ml e sterilizzare sia l'olio minerale che il triptico di soia agar (TSA) a 121 °C per 15 minuti, quindi equilibrare a 50 °C in forno.
  5. Campionare 1 mL di coltura e misurare l'OD600.
  6. Raccogliere le celle per centrifugazione a 3700 g per 15 min a 4 °C. Risospendere le cellule in 4 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) per ottenere un OD600 di circa 30.
  7. Miscelare 3 mL di sospensione batterica con 27 mL di TSA fuso pre-bilanciato a 50 °C in una provetta da centrifuga da 50 mL. Miscelare rapidamente mediante vortex o pipettaggio.
  8. Versare con cautela la miscela batterio-agar (30 mL) in 60 mL di olio minerale e porre il pallone in un contenitore secondario. Impostare rapidamente la miscela in modo che centrifughi a velocità media (420 giri/min) su un agitatore magnetico impostato a 50 °C, utilizzando una barra di agitazione magnetica. Assicurarsi che si formi un vortice visibile nella miscela di olio e agar. Mescolare per 6 minuti a temperatura ambiente (RT).
  9. Raffreddare il composto mettendo il ghiaccio nel contenitore secondario e continuare a mescolare per 35 minuti.
  10. Smettere di mescolare e lasciare riposare l'impasto di perline di agar per 20 minuti (reintegrare il ghiaccio se necessario).
  11. Trasferire la miscela di impasto liquido in due provette da centrifuga da 50 mL e lavare 10 volte con un volume di DPBS per rimuovere olio e batteri liberi (3700 g, 6 min, 4 °C, per i primi 5 cicli).
    1. Combinare le sospensioni di perle di agar in un unico tubo al terzo lavaggio. Durante i primi 5 cicli di lavaggio, utilizzare una pipetta sierologica per risospendere delicatamente le perle.
    2. Per i successivi 5 cicli di lavaggio, utilizzare i seguenti parametri di centrifugazione: 2000 g per 5 minuti, seguiti da 1000 g per 4, 3, 2 e 2 minuti, rispettivamente.
  12. Risospendere le perle di agar in DPBS fino a un volume finale di 40 mL, trasferirle in un flacone sterile da 125 mL e diluire 4 volte aggiungendo 120 mL di DPBS.
  13. Far passare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 200 μm.
    1. Collegare il colino a una provetta da centrifuga sterile da 50 ml. Quindi, aggiungere il materiale campione sul filtro e filtrare la sospensione del cordone.
    2. Per facilitare il processo di filtrazione, combinare un filtro cellulare, un imbuto, un anello di collegamento e una provetta da 50 ml in un'unità. Assemblare le parti nell'ordine dell'imbuto, del filtro cellulare, dell'anello di connessione e della provetta da 50 ml e tirare lentamente il pistone di una siringa da 30 ml collegata all'anello di connessione.
  14. Se necessario, sciacquare il colino dal lato opposto con DPBS per lavare via le perle più grandi trattenute. Concentrare la sospensione diluita centrifugando a 1000 g per 2 min o lasciando che le perle si depositino per gravità. Dopo la raccolta, conservare le perle di agar a 4 °C per un massimo di 1 settimana. Si consiglia una preparazione fresca per ogni lotto di esperimenti.
  15. Pipettare 5 μl di sospensione di perle su un vetrino, coprirlo con un vetrino coprioggetti e scattare immagini in alcune posizioni casuali utilizzando un microscopio ottico o a fluorescenza con una lente obiettivo da 10×. Salvare le immagini e misurare il diametro del cordone con ImageJ (intervallo di dimensioni desiderato: 200 ± 50 μm).

2. Titolazione dell'inoculo di M. abscessus incorporato in perle di agar

  1. Aggiungere 1 mL della sospensione di perle in una provetta M e omogeneizzare asetticamente per rilasciare i batteri incorporati nelle perle utilizzando un dissociatore impostato sul programma predefinito RNA.02.01.
  2. Prelevare 100 μl di omogeneizzato e diluire in serie 1:10 a 1 × diluizione 10-5 . Diluizioni spalmabili su agar 7H10 integrato con acido oleico-albumina-destrosio-catalasi (OADC) al 10% e glicerolo al 2%. Enumerare le CFU dopo 3-5 giorni di incubazione.
  3. Regolare il titolo dell'inoculo secondo necessità. Ad esempio, se ogni topo riceve 100 μL di sospensione di perline contenente 1 × 105 CFU a 10 topi, viene preparato un totale di 2 mL di sospensione contenente 1 × 106 CFU/mL più ~25% per tenere conto delle perdite nelle siringhe.

3. Test dell'erogazione delle microsfere attraverso la siringa e l'ago

NOTA: Sono stati inclusi i seguenti passaggi per garantire che le perle non aderiscano alle superfici della siringa o dell'ago. Si è riscontrato che è importante utilizzare una siringa di vetro e un ago di alimentazione in metallo da 24 G per evitare la perdita di perline dovuta all'aderenza alle superfici in plastica.

  1. Preparare la PBST aggiungendo 1,25 mL di Tween sterile da 80 a 500 mL di PBS sterile.
  2. Aggiungere 900 μl di PBST in cinque provette M per testare le perle di agar che passano attraverso l'ago di alimentazione, nonché 900 μl di PBST in provette sterili da 2 mL per preparare da -2 a -6 diluizioni di ciascun campione push-through.
  3. Mescolare il microscesso di agar incorporato in M . abscessus preparato in precedenza utilizzando una pipetta P1000 per assicurarsi che tutte le perle siano disperse uniformemente.
  4. Collegare un ago di alimentazione in metallo da 24 G alla siringa di vetro e aspirare la sospensione di perle di agar, facendo attenzione a evitare la formazione di bolle d'aria.
  5. Una volta che la siringa è piena senza bolle d'aria, posizionare clip o tappi di nylon sullo stantuffo della siringa, senza spazio tra le clip. I tappi consentono un'erogazione accurata di 50-100 μL. È possibile inserire fino a 6 clip lungo lo stantuffo.
  6. Erogare 100 μl di perle ("push-through") nelle provette M nel rispettivo ordine.
  7. Una volta raccolti 5 push-through, omogeneizzare le perle utilizzando il dissociatore tissutale regolato all'impostazione RNA.02.01, adeguato per la preparazione di RNA da organi congelati e che è risultato in grado di rilasciare efficacemente M. abscessus dalle perle senza compromettere la vitalità cellulare.
  8. Eseguire la diluizione in serie per gli omogeneizzati nell'intervallo da -1 a -6. Piastra le diluizioni su piastre di agar 7H11 integrate con OADC. Contare i CFU dopo 5 giorni.

4. Inoculazione intratracheale di topi

  1. Prepara topi CD-1 di età compresa tra 6 e 8 settimane.
  2. Sedare i topi utilizzando un sistema di esposizione all'aerosol di isoflurano, a una velocità di flusso dell'1-5%, come precedentemente descritto1.
  3. Trattieni i topi utilizzando un supporto inclinato tridimensionale (stampato in 3D) (progettato e prodotto su misura). L'asta al centro del supporto ha una corda di sutura che tiene il topo verticalmente per gli incisivi, ponendo il topo in una posizione sdraiata ventrale con la testa sollevata.
  4. Collegare un ago metallico da 24 G per l'alimentazione degli animali a una siringa di vetro riempita con perline di agar incorporate in M . abscessus. Posizionare clip o tappi di nylon sullo stantuffo della siringa per infettare ciascun topo con 50 μL di inoculo.
  5. Una volta che il topo sedato è trattenuto sulla puntura di sutura, sposta la lingua sul lato della bocca usando un applicatore di batuffolo di cotone.
  6. Visualizza la parte posteriore della bocca del topo per identificare chiaramente la sezione bianca nella parte posteriore della bocca e mirare alla trachea del topo.
  7. Inclinare verticalmente l'ago della sonda magnetica sopra il topo e inserirlo nella parte superiore della trachea. Potrebbe esserci una leggera resistenza durante il passaggio attraverso l'epiglottide.
  8. Far scorrere l'ago della sonda gastrica nella trachea, rimuovere la clip di nylon o il tappo ed erogare 50 μL di M. abscessus incorporato in perline di agar.
  9. Lascia riposare il mouse per 5 minuti e ripeti i passaggi 4.2-4.8 una seconda volta. Lo scopo di una procedura di inoculazione in due fasi è quello di garantire una deposizione riproducibile e profonda dell'intero inoculo nel polmone.
  10. Lasciare che l'infezione progredisca per 24 ore, dopodiché il topo viene soppresso per enumerare la deposizione batterica nei polmoni.

Risultati

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Dimensione e carico del tallone
Per visualizzare le perle di agar e la loro carica batterica, la proteina fluorescente rosso mCherry è stata espressa sotto il promotore costitutivo Hsp60 nel ceppo di tipo Mab ATCC 19977 e ha incorporato questo ceppo nelle perle di agar come descritto sopra. La Figura 1A mostra l'intervallo di dimensione del cordone (barra della scala = 200 μm). La Figura 1B mostra il carico di 6 preparazioni indipendenti di perline, dimostrando la riproducibilità della procedura come descritto.

Placcatura del push-through della siringa e impianto batterico dopo inoculazione intratracheale
L'inoculazione intratracheale è stata ottimizzata in due fasi. Le CFU/mL sono state enumerate nell'inoculo prima e dopo il passaggio attraverso la siringa di vetro per garantire che non si verificassero perdite di perline o batteri mentre le perle passavano attraverso la siringa e il tubo collegato. La Tabella 1 mostra il titolo batterico iniziale di due preparazioni di microsfere indipendenti (prove 1 e 2) e il numero di CFU recuperate per 100 mL di campioni "spinti" da un singolo carico di siringa. Per evitare perdite di microsfere e batteri, è necessaria una siringa di vetro collegata a un tubo metallico. Le perle di agar tendono ad aderire alle superfici plastiche.

L'enumerazione delle CFU nel tempo nella preparazione delle microsfere ha mostrato che la carica batterica delle perle è rimasta stabile a 4 °C per 1 settimana, con una perdita di ~2 volte della carica batterica ogni 2 settimane e una deposizione polmonare non compromessa. Successivamente, gruppi di 5-8 topi sono stati infettati con tre preparati di perline indipendenti per testare la riproducibilità della procedura di inoculazione intratracheale. La Tabella 2 mostra il numero di CFU polmonari per topo, enumerato 24 ore dopo l'infezione come descritto.

Infine, la riproducibilità inter-operatore dell'infezione è stata valutata infettando tre gruppi di 10 topi CD-1, ciascuno eseguito da un operatore diverso. Le CFU polmonari enumerate 24 ore dopo l'infezione sono mostrate nella Figura 2.

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Figura 1: Esperimento pilota per valutare le dimensioni delle perle, visualizzare e quantificare la carica batterica di M. abscessus . (A) Perle di agar contenenti il ceppo ATCC 19977 di M. abscessus , ingegnerizzate per esprimere la proteina fluorescente rosso mCherry sotto il promotore costitutivo hsp60. Cinque μl di sospensione di perle sono stati sparsi su un vetrino e analizzati con un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera (obiettivo 10x). Ogni punto rosso è una cellula batterica fluorescente, racchiusa all'interno di perle di agar di diametro compreso tra ~70 e 250 μm. (B) Carica batterica, in CFU/mL, di 6 singole preparazioni di perle che dimostrano la riproducibilità del metodo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Riproducibilità interoperatoria dell'infezione. Gruppi di 10 topi femmina CD-1 sono stati infettati intratrachealmente da tre operatori indipendenti come descritto, utilizzando la stessa preparazione di perline. Vengono mostrate le CFU polmonari enumerate 24 ore dopo l'infezione. O1, O2, O3: operatori 1, 2 e 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

UFC/100 μL
Preparazione delle perlineProva 1Prova 2
1.13E+052.40E+05
Campione push-through con siringa
11.14E+055.10E+05
21.36E+054.10E+05
39.30E+043.90E+05
49.80E+043.60E+05
51.14E+05
Nella media1.11E+054.18E+05
SD1.69E+04 (15%)6.50E+04 (16%)

Tabella 1: Unità formanti colonie (CFU) per campione da 100 μL dopo il passaggio attraverso la siringa di vetro e l'ago di alimentazione in metallo.

Prova 1Prova 2Prova 3
Mouse IDUFC polmonare/topoMouse IDUFC polmonare/topoMouse IDUFC polmonare/topo
M-16.50E+03M-62.20E+05M-116.80E+04
M-21.10E+04M-72.70E+05M-121.70E+05
M-31.40E+04M-88.10E+04M-132.10E+05
M-43.20E+03M-91.40E+05M-144.40E+04
M-54.50E+03M-101.30E+05M-157.50E+04
M-161.01E+05
M-177.00E+04
M-185.80E+03
Nella media7.84E+03Nella media1.68E+05Nella media9.30E+04
SD4.54E+03 (58%)SD7.57E+04 (45%)SD6.67E+04 (72%)

Tabella 2: Impianto di M. abscessus incorporato in perline di agar nei polmoni di topo 24 ore dopo l'inoculazione

Discussione

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Per garantire la distribuzione uniforme dei batteri nelle perle di agar, è importante sospendere uniformemente la miscela di agar e batteri fusi prima di aggiungerla alla fase oleosa. Il rapporto in volume olio-agar-batteri è fondamentale per controllare le dimensioni delle perle. Un rapporto olio/agar più elevato porta alla formazione di perle di agar più piccole. Quando si mescola la sospensione di agarbatteri con la fase oleosa, il controllo della temperatura è fondamentale. La miscela di olio e agar deve essere abbastanza calda da consentire l'emulsione e la formazione di goccioline, ma abbastanza fredda da non danneggiare i batteri. L'agitazione continua durante il raffreddamento della miscela a temperatura ambiente o inferiore consente la formazione e la solidificazione delle goccioline di agar.

La corretta calibrazione della piastra di agitazione, le dimensioni della barra di agitazione e la forma e le dimensioni del pallone sono fattori determinanti per un vortice uniforme. Un'ancoretta posizionata al centro del pallone crea un vortice simmetrico, garantendo una miscelazione uniforme. Un'ancoretta decentrata può portare a un vortice instabile, con conseguente formazione di perle di forma irregolare e l'introduzione di bolle d'aria nelle perline. Si consiglia il monitoraggio e la regolazione in tempo reale della posizione dell'ancoretta di agitazione. Il volume del pallone deve essere proporzionale al volume della miscela olio-agar. Un pallone da 500 ml è ideale per far girare una miscela di olio e agar da 90 ml, producendo un vortice visibile. Quando si utilizzano matracci più grandi, è importante regolare il volume della miscela olio-agar, le dimensioni dell'agitatore e la velocità di vortice per ottenere un equilibrio tra miscelazione efficace e vortice stabile. Mantenere una velocità di vortice costante durante il processo e tra le preparazioni delle perle è fondamentale per la riproducibilità da lotto a lotto.

Il processo di preparazione delle perle di agar, in particolare la velocità di vortice e il rapporto olio-agar, sono adattati da16,22, con piccole modifiche. Le forze di taglio all'interno del vortice rotante producono intrinsecamente perline di diverse dimensioni. Per ridurre al minimo questa variabilità dimensionale, la fase di raccolta delle perle è stata modificata introducendo diverse fasi di lavaggio, impiegando un gradiente di velocità e tempo di centrifugazione decrescenti per garantire la rimozione delle perle di piccole dimensioni (e dei batteri liberi). Un filtro a micro-maglie è stato impiegato per arricchire le perle della dimensione desiderata, filtrando efficacemente le perle più grandi e quelle che potrebbero essersi formate attraverso la coalescenza casuale. Per evitare perdite di perline o batteri quando il liquame di perline passa attraverso la siringa e il tubo collegato per l'inoculazione intratracheale del topo, è fondamentale utilizzare una siringa di vetro, aghi di alimentazione in metallo da 24 g e un tubo collegato in metallo.

Il principale limite del metodo è la complessità tecnica della preparazione del microscotto e dell'inoculazione intratracheale per ottenere un carico di perline e un impianto polmonare riproducibili. Sono necessarie attenzione ai dettagli e capacità di risoluzione dei problemi. Inoltre, il modello non è stato completamente convalidato testando l'efficacia degli antibiotici standard di cura e delle combinazioni di antibiotici più frequenti somministrate ai pazienti con Mab.

Attualmente, nessun modello murino di infezione cronica da Mab è stato convalidato nella misura in cui l'efficacia di singoli agenti e combinazioni di farmaci nei pazienti possa essere ragionevolmente prevista dal modello9. Il sistema di topi C57BL/6 incorporato in perline di agar è stato sfruttato per testare l'efficacia dei trattamenti antimicrobici 15,19,23. L'alternativa più vicina al sistema di topi C57BL/6 incorporati in perline di agar è il modello murino C3HeB/FeJ, che si basa sull'immunosoppressione del desametasone per ottenere un'infezione cronica duratura24,25. I vantaggi del protocollo qui descritto sono che (i) possono essere utilizzati topi C57BL/6 completamente immunocompetenti e più convenienti, (ii) un'infezione produttiva e cronica può essere ottenuta con il ceppo di tipo ATCC 19977 ben caratterizzato e (iii) non vi è alcun requisito di immunosoppressione indotta chimicamente, eludendo la necessità di iniezioni giornaliere di desametasone, evitando così potenziali interazioni farmacologiche e l'impatto sull'immunopatologia polmonare.

Data la mancanza di modelli murini convalidati di infezione cronica da Mab per valutare nuovi farmaci candidati e regimi farmacologici 8,9, la tecnica qui descritta ha il potenziale per far progredire il campo, migliorare il valore predittivo dei dati preclinici di efficacia, aiutare a dare priorità ai regimi farmacologici con il più alto potenziale per fornire una cura duratura e accelerare complessivamente la scoperta e lo sviluppo di farmaci per la malattia polmonare Mab. Il metodo può essere applicato ad altri patogeni polmonari e ha una comprovata esperienza per P. aeruginosa o Haemophilus influenza. L'obiettivo principale del protocollo qui descritto è quello di fornire dettagli e raccomandazioni sufficienti per garantire la facilità di implementazione e l'eccellente riproducibilità da laboratorio a laboratorio.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato dalla Cystic Fibrosis Foundation, assegna DICK24XX0, a TD e VD, e R01-AI132374 da NIH-NIAID a TD e VD.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Flacone da 125 mlCorning8388Rack sterile
per il supporto di provette 3 x 3Fisher5972-0030PKDisinfettato prima dell'uso
Supporto per mouse stampato in 3DTransworld Marketing progettato e prodotto su misuraDisinfettato prima dell'uso Piastra di
diluizione a 48 pozzettiCelltreat 229192Provette da
centrifuga sterili da 50 mlGreiner Bio-One227261Macchina sterile
per anesteaSistemiEZ-AF9000 SISTEMAn/a
Avanti J-15R Beckman Coulter  B99517
Puntali per pipette a barriera per centrifuga in rack con coperchio sollevabile 1000GThermo Scientific ART 21-236-2ASacca sterile
per rischi biologiciFisherbrand22-044561
Anello connettore pluriSelect41-50000-03
Applicatori con punta in cotonePuritan 22-029-571
Passanti di inoculazione monouso sterili gialli sterili 100 in busta a chiusura lampoCole-Parmer Essentials 03-391-562sterile
monouso per asciugamani polifoderatiDynarex19-310-671
salina tamponata con fosfato sterile di DulbeccoThomas Scientific21-031-CM
ImbutopluriSelect42-50000
Spettrofotometrosterile GE Ultrospec 10Sigma-AldrichGE80211630
Gentlemacs Dissociatore tissutaleMiltenyi Biotec130-096-427non attivata a caldo
 Hamilton80801Disinfettato prima dell'uso
Olio minerale pesanteSigma-Aldrich330760-1Lsterile
isoflurano Flacone da 250 mlCovetrus29405Corrosione/irritazione cutanea: Categoria 2, Gravi lesioni oculari/Irritazione oculare: Categoria 2A, Tossicità sistemica specifica per organi bersaglio (esposizione singola): Categoria 3
Può causare sonnolenza e vertigini, Provoca grave irritazione oculare, Provoca irritazione cutanea. Non inalare, utilizzare in un'area ben ventilata.
M Tubes (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335Agitatore magnetico sterile
MR Hei-Connect Heidolph505-40000-13-1
Barra di agitazione magneticaThomas Scientific  1181L08Pipetta
meccanica sterile 100– 1000 µ L Gilson PIPETMAN L FA10006MDisinfettato prima dell'uso
Pipetta meccanica 20... 200 µ L Gilson PIPETMAN L FA10003MGDisinfettato prima dell'uso
Ago per l'alimentazione degli animali in metallo 24 GBraintree ScientificN-VP 24G-1SDeve essere sterilizzato (sterilizzato in autoclave)
Middlebrook 7H10 AgarSigma-AldrichM0303-500GSterilizzato (in autoclave)
Middlebrook 7H11 AgarThermo FisherR4554002Sterilizzato (in autoclave)
Middlebrook 7H9 medioBeckton Dickinson271310sterilizzate (autoclavate)
Soluzioni TriMech SRV-AMS-FDMDisinfettato prima dell'uso
Sutura di seta non assorbibileFisher Scientific18020-50n/a
OADC Arricchimento liquido per l'uso con Middlebrook Media 500 mlThermo Scientific Remel R450605PBS sterile
(10x), pH 7,4 Filtrato sterile 500 mLGibco70-011-044Salviette sterili
in peroxiguardiaPeroxigard29221n/a
Piastre Petri con coperchio trasparente Rotondo 100mmx 15mmFisherbrand FB0875712
Sterile PluriStrainer 200 mmpluriSelect43-50200-03Sterile; filtro cellulare
Flaconi a rulloCorning430165Pipetta
sierologicaCorning4489Cuvette sterili
spettrofotometro 1,5 mLFisher Scientific14955127Sterilizzato (autoclavato)
Tappi per siringhe o clip (nylon)Trimech SRV-AMS-MJFDisinfettato prima dell'uso
Brodo di soia tripticoSigma-AldrichT8907-500G
Tween sterile 80 FiltroFisher 170793sterilizzato 
Puntali per pipette filtrati a foro largo Rack per coperchio sollevabile 200G Thermo Scientific ART21-236-1ASterile
Telo Soluzione sterile Siringa Hamilton Soluzione di Parti del supporto per mouse sterile per

Riferimenti

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