Qui, forniamo dettagli sull'esecuzione della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) attraverso la perfusione attraverso il sistema vascolare del topo con un pancreas intatto come tecnica aggiuntiva per valutare la funzione endocrina del pancreas con riduzione di possibili fattori confondenti.
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Articolo metodologico
Secrezione di insulina stimolata dal glucosio attraverso la perfusione attraverso il sistema vascolare dei topi con un pancreas intatto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli attuali metodi per la secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) nei roditori prevedono la perifusione ex vivo o l'incubazione statica di isole pancreatiche e fette pancreatiche. La perfusione ex vivo e l'incubazione statica consentono di prelevare più campioni in modo rapido ed efficiente. Tuttavia, queste procedure sottopongono le isole a traumi, ipossia intermittente e riduzione della segnalazione dell'insulina paracrina, che possono influenzare la GSIS. Questi effetti negativi possono essere minimizzati attraverso la perfusione attraverso il sistema vascolare del topo con un pancreas intatto, il che fornisce un altro metodo di confronto per i diversi modelli GSIS. La spina dorsale di questa procedura di perfusione prevedeva i) la legatura dei vasi per isolare il pancreas e ii) l'incannulamento del sistema vascolare pancreatico. Questo modello prevedeva sette punti di legatura e due incannulazioni. La vascolarizzazione perfusa risultante includeva l'aorta addominale inferiore, l'arteria celiaca e mesenterica superiore, gli affluenti ramificati e la vena porta.
Il perfusato è stato introdotto nel sistema vascolare a ~2 mL/min tramite una pompa peristaltica al tubo PE-50 che incannula l'aorta addominale inferiore. I perfusati scorrevano attraverso il sistema vascolare isolato e venivano raccolti attraverso la vena porta tramite una cannulamento con tubo in PE-30. Il perfusato è stato raccolto a intervalli di 3 minuti in cicli di 30 minuti per ciascuna soluzione di perfusato di 2,6 mM di glucosio, 16,8 mM di glucosio e 2,6 mM di glucosio con 3-isobutilil-1-metilxantina (IBMX) nel tampone bicarbonato di Krebs-Ringer (KRB, 16 mM HEPES e 0,1% BSA, pH 7,4). La soluzione IBMX è stata preceduta da una normale soluzione di glucosio da 2,6 mM come ciclo di lavaggio. Il tempo totale è stato di ~1 ora per la procedura chirurgica e 2 ore per la raccolta del perfusato. I perfusi sono stati congelati fino a quando non è stato eseguito un test ELISA per misurare la secrezione di insulina.
Questo elenco di metodi spera di fornire una base procedurale dettagliata per la misurazione della secrezione di insulina attraverso la perfusione del pancreas attraverso il sistema vascolare, che consentirà ai ricercatori di eseguire con successo la perfusione del pancreas intatto nei loro laboratori.
Introduzione
La quantificazione e la comprensione della funzione delle cellule beta sono state realizzate principalmente tramite perifusione ex vivo, incubazione statica e, più recentemente, tramite fette pancreatiche. Sebbene queste procedure consentano la valutazione di isole isolate, le prime due possono sottoporre le isole a fattori di stress che influiscono sulla loro capacità di funzionare. In uno studio di Rosenberg et al., le isole canine isolate con metodi standard hanno mostrato un aumento dell'apoptosi delle cellule beta, che è stata evidenziata dalla perdita della membrana basale, dalla comparsa di nuclei picnotici e dai corpi apoptotici1. Questo studio coincide con un altro rapporto sull'isolamento delle isole pancreatiche umane in cui i cambiamenti morfologici che descrivono l'apoptosi sono stati dimostrati subito dopo l'isolamento delle isole 2,3. L'aumento dell'apoptosi delle cellule beta ha portato a una riduzione del rilascio di insulina da queste isole, supportando l'idea che l'isolamento delle isole le predisponga a danni e compromissione funzionale.
Oltre all'apoptosi, la vascolarizzazione viene persa con l'isolamento delle isole, portando a un trasporto alterato di nutrienti, metaboliti e ormoni 4,5. Questa limitazione ha portato ad alternative come il trapianto delle cellule insulari nell'occhio per mantenere una qualche forma di vascolarizzazione e innervazione6. Il cambiamento nell'architettura vascolare durante l'isolamento delle isole crea anche un'isola più compatta, diversa da quella che ci si aspetta in vivo 7,8.
Per aumentare le differenze anatomiche, il comportamento delle isole incubate staticamente differisce dal pancreas isolato perfuso. Per le isole incubate staticamente a basso glucosio, il 77% dell'insulina totale rilasciata (3,31 ng su 4,34 ng totali) sembrava essere presente entro i primi 30 minuti e poco nel periodo di tempo successivo. Ciò è in netto contrasto con il pancreas isolato perfuso a basse concentrazioni di glucosio, dove il rilascio di insulina è praticamente nullo in tutti i punti temporali (<1,8 ng in totale)9. Sebbene siano necessarie ulteriori ricerche per chiarire completamente questa differenza a basse concentrazioni di glucosio, questa differenza nei dati può rappresentare una perdita da cellule morenti ipossiche, che è stata ulteriormente esaminata tramite incubazione statica di monostrati di cellule insulari. Tuttavia, queste differenze tra i metodi attuali e gli ambienti in vivo possono causare una ridotta validità esterna (Tabella 1).
Oltre a causare ipossia, sia la perifusione ex vivo che l'incubazione statica comportano la coltura e la separazione delle isole dal pancreas in piastre di coltura tissutale per mantenerle in uno stato sospeso. Durante questo processo, la collagenasi viene tipicamente perfusa attraverso il dotto pancreatico per consentire la dissociazione del tessuto pancreatico. La collagenasi si lega alle fibrille di collagene e le scioglie con l'aiuto di proteasi neutre, gelatinasi e proteasi pancreatiche endogene. Insieme, queste proteasi continuano a digerire fino a quando le isole non vengono rilasciate dalla loro matrice extracellulare e dagli attacchi delle cellule acinose. Il bilanciamento di questa miscela di proteasi produce risultati variabili sia nella purezza che nella funzionalità delle isole isolate10. L'efficacia della collagenasi si basa anche su caratteristiche animali come il ceppo, l'età, il peso e lo stato del diabete. L'uso di queste proteasi in combinazione con tratti specifici dell'animale può danneggiare le isole pancreatiche durante il processo di isolamento. Durante la somministrazione di collagenasi, queste proteasi attivano anche enzimi proteolitici pancreatici endogeni che aiutano la digestione della membrana basale. Tuttavia, il controllo dell'attivazione degli enzimi pancreatici endogeni non è ancora possibile; Pertanto, questo può svolgere un ruolo nel danno alle isole durante il processo di coltivazione 11,12,13. Un rapporto di Edmonton ha mostrato che l'attività della proteasi endogena influisce sulla resa dell'isolamento delle isole una volta raggiunto un livello di attività enzimatica sufficiente per l'isolamento14,15.
È stato dimostrato che le attuali tecniche di infusione della collagenasi (intraduttale) penetrano anche all'interno dell'isola, portando a una possibile frammentazione dell'isola e, quindi, a basse rese insulari16. In uno studio di Balamurugan et al., la collagenasi era stata vista localizzarsi nelle isole e nel tessuto acinare all'interno del pancreas di topo infuso con acqua, portando a un'intensa infiammazione e all'attivazione delle vie apoptotiche17. Anche le isole che sono sopravvissute alla fase di isolamento hanno mostrato una ridotta capacità di rilasciare insulina.
Inoltre, altri fattori come lo stress meccanico durante la preparazione delle isole e la necrosi indotta dall'ipossia durante la coltura giocano tutti un ruolo nel funzionamento delle isole18. Questi tratti possono influenzare la vitalità dell'isola durante l'isolamento del pancreas e, quindi, la funzione risultante.
Oltre all'isolamento e alla valutazione delle isole tramite perifusione ex vivo e incubazione statica, le isole in fette di pancreas viventi sono un altro metodo ex vivo utilizzato per misurare le risposte delle cellule endocrine19. In questo sistema, si evita lo stress chimico derivante dalle procedure di isolamento delle isole. Inoltre, il microambiente delle isole rimane intatto, consentendo lo studio della fisiologia delle isole più vicino al suo stato in vivo 20. Simile alla perifusione ex vivo e all'incubazione statica, questo è un metodo che continuerà a svolgere un ruolo importante nell'acquisizione della conoscenza del pancreas. Tuttavia, alcune limitazioni includono lo stress meccanico durante la generazione della fetta, nonché la mancanza di una visione olistica complessiva di un pancreas intatto per patologia e fisiologia. La fetta rappresenta una particolare regione all'interno del pancreas, che diminuisce la sua generalizzabilità a causa della ridotta dimensione del campione e della visione limitata21.
Questo isolamento delle isole e altri metodi sono accompagnati da vari punti di fattori di stress che possono essere imposti alle isole. Lo stress meccanico, l'ipossia, l'iperattività della proteasi e la vista limitata giocano tutti un ruolo nella resa risultante delle isole e nella validità esterna complessiva. Questi fattori possono essere ridotti attraverso la perfusione del pancreas attraverso la vascolarizzazione dei topi, che riduce al minimo tutti i fattori di stress di cui sopra, consentendo anche l'esame degli effetti di altri secretagoghi e agenti farmacologici presenti nel corpo a causa del mantenimento dell'integrità cellulare22. Studi precedenti hanno dimostrato l'impatto del flusso sanguigno delle isole sui livelli plasmatici di insulina23; A loro volta, molecole vasoattive come i peptidi dell'angiotensina e gli agonisti simpatici, che modificano il flusso sanguigno delle isole, altererebbero la funzione delle isole e il rilascio di insulina24,25. La perfusione del pancreas consentirebbe un'ulteriore valutazione di come queste e altre diverse molecole possano influenzare la risposta delle cellule endocrine. Questo sistema spera di consentire un ulteriore avanzamento concettuale della nostra comprensione della biologia del pancreas endocrino in presenza di cross-talk nel suo microambiente naturale con una vascolarizzazione e un'innervazione intatte. Inoltre, la perfusione del pancreas intatto in questo protocollo consente l'isolamento dell'organo, riducendo i potenziali fattori confondenti di altri organi come il fegato, che elimina l'insulina dalla circolazione, rispetto alla perfusione dell'intero topo. La perfusione dell'intero topo consentirebbe di ridurre la tecnica chirurgica; Tuttavia, richiederebbe ancora la raccolta del perfusato attraverso un vaso dopo il pancreas e prima di raggiungere il fegato, probabilmente la vena porta. La raccolta della vena porta continuerebbe a richiedere l'incannulamento. Mentre la perfusione dell'intero topo fornirebbe il vantaggio di ridurre le fasi chirurgiche, ci sarebbero limitazioni dovute ai fattori confondenti creati da organi come i reni e i polmoni che producono peptidi di angiotensina. Tuttavia, questo sarebbe un nuovo approccio che potrebbe rivelarsi utile quando si esaminano gli effetti delle molecole vasoattive prodotte da altri organi sulle isole pancreatiche, che è la priorità primaria.
La perfusione dell'intero pancreas è stata eseguita con successo in passato da altri 7,22,26. In questo protocollo aggiornato, l'uso dei topi rappresenta una maggiore sfida tecnica a causa della loro anatomia più piccola rispetto ai ratti. Tuttavia, questa procedura dimostra con successo la fattibilità di questo protocollo dimostrando un profilo secretorio di insulina ben caratterizzato dal pancreas intatto di 3 topi indipendenti.
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Protocollo
Tutte le ricerche eseguite sui roditori sono conformi alle linee guida del Joslin Diabetes Research Center (numero di approvazione 22-01).
1. Inizio
- Somministrare l'anestesia.
- Iniettare topi normoglicemici a digiuno (Flox/Cre 53-74 settimane M/F utilizzato negli esperimenti) con una miscela di ketamina/xilazina (~75 mg/kg di miscela di ketamina HCl) somministrata per via intramuscolare attraverso una delle cosce posteriori tramite ago da 28 G per l'eutanasia.
NOTA: L'uso di topi normoglicemici a digiuno è importante per ridurre gli effetti della ketamina; Tuttavia, un anestetico può essere sostituito. - Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente anestetizzato pizzicando il piede posteriore con una pinza per verificare la presenza di riflessi.
NOTA: La mancanza di riflesso è denotata dalla mancanza di movimento della gamba pizzicata. - Somministrare unguento oftalmico sterile agli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia e prevenire le ulcere corneali.
- Iniettare topi normoglicemici a digiuno (Flox/Cre 53-74 settimane M/F utilizzato negli esperimenti) con una miscela di ketamina/xilazina (~75 mg/kg di miscela di ketamina HCl) somministrata per via intramuscolare attraverso una delle cosce posteriori tramite ago da 28 G per l'eutanasia.
- Metti al sicuro il soggetto.
- Assicurati che il mouse sia sicuro e rimanga in posizione durante la procedura, che questo esperimento completa tramite magneti attaccati a elastici che si collegano agli arti con i magneti attaccati a una lavagna magnetica.
- Pulire il sito dell'incisione.
- Assicurarsi che il topo sia spruzzato con etanolo al 70% per evitare la contaminazione dai peli del topo,
NOTA: La rasatura del topo consentirebbe meno possibilità di contaminazione dal pelo.
- Assicurarsi che il topo sia spruzzato con etanolo al 70% per evitare la contaminazione dai peli del topo,
- Eseguire l'incisione.
- Usando una pinza/pinzetta, pizzicare a 2-3 cm dall'ano e tagliare verso l'alto mentre si perfora il peritoneo con le forbici curve.
- Crea un'incisione diagonale dalla linea mediana alle costole e alla parte laterale del topo.
- Crea un'incisione identica sul lato opposto.
NOTA: L'obiettivo è quello di creare una visione adeguata della cavità addominale da vicino al retto al diaframma
2. Legatura
- Legare l'arteria gastrica.
- Sposta l'intestino alla destra dell'animale con una pinza/dita smussate. Sollevare lo stomaco per localizzare l'arteria gastrica e la vena.
NOTA: Arteria e vena gastrica identificate attraverso la visualizzazione dei vasi che vanno dall'esofago inferiore alla parte superiore dello stomaco. - Prendi una sutura 7-0 (senza ago) e posizionala sotto l'arteria gastrica usando una pinza smussata in preparazione per la legatura.
- Crea un nodo da chirurgo e assicurati un'adeguata legatura attraverso un nodo solido.
NOTA: Il tipo di nodo non è importante; La prevenzione del flusso sanguigno può essere determinata attraverso un cambiamento di colore dell'organo legato in un aspetto più pallido o la rimozione dell'organo e il monitoraggio dell'espulsione del sangue dal punto di legatura. La legatura dell'arteria gastrica garantisce l'assenza di influenze dal contenuto gastrico. Ciò riduce anche le perdite nei vasi gastrici e dirige il perfusato attraverso l'arteria celiaca.
- Sposta l'intestino alla destra dell'animale con una pinza/dita smussate. Sollevare lo stomaco per localizzare l'arteria gastrica e la vena.
- Ligate vasi renali sinistri.
- Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3 per i vasi renali sinistri.
- Identificare i vasi renali sinistri visualizzando i vasi rosso vivo e viola scuro che si collegano al rene sinistro. Questo passaggio impedisce la fuoriuscita nei vasi renali e reindirizza il perfusato all'arteria celiaca.
- Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3 per i vasi renali sinistri.
- Legare l'aorta addominale superiore.
- Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3.
- Identificare l'aorta addominale superiore visualizzando il vaso rosso vivo della linea mediana con i vasi ramificati dell'arteria celiaca, dell'arteria mesenterica superiore e dei vasi renali sinistri. Eseguire la legatura superiore all'arteria celiaca per ridurre le perdite attraverso l'aorta addominale superiore e garantire il flusso all'arteria celiaca e, infine, al pancreas.
- Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3.
- Legare i vasi renali destri.
- Sposta l'intestino alla sinistra dell'animale. Pizzica il tessuto/grasso che circonda il rene destro come leva per identificare i vasi renali giusti.
- Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3.
- Identificare i vasi renali destri visualizzando i vasi viola/rosso scuro (entrambe le vene renali destre con un'arteria sottostante che non è visibile) collegati al rene destro con connessione sia alla vena cava inferiore che all'aorta addominale. Questo passaggio è parallelo al passaggio 2.2 con i vasi renali sinistri, consentendo un ulteriore isolamento del pancreas; Tuttavia, fai attenzione alla vicinanza di questo vaso alla vena cava inferiore.
- Legare la porzione addominale della vena cava inferiore.
- Identificare la porzione addominale della vena cava inferiore attraverso la visualizzazione di un vaso viola più grande con una connessione ramificata alla vena renale destra.
- Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3.
NOTA: Questo passaggio riduce i potenziali fattori confondenti dal sangue che passa attraverso la vena porta, dove verrà raccolto il perfusato.
- Legare l'aorta addominale inferiore, prima della biforcazione (Figura 1)
- Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3.
- Dopo la legatura appena prima della biforcazione, posizionare un filo di sutura sotto l'aorta circa 0,5 cm sopra il primo nodo. Utilizzare questo filo di sutura per legare l'incannulamento in posizione.
- Utilizzare lo spazio tra il filo di sutura e la sutura legata per inserire il tubo per l'incannulamento. Questa legatura assicura che il perfusato scorra attraverso l'aorta addominale inferiore verso l'arteria celiaca.
- Legare la vena porta (Figura 2)
- Spostare l'intestino alla sinistra dell'animale per consentire una corretta visualizzazione della vena porta.
- Creare un'incisione nel diaframma e nelle costole per creare più spazio, se necessario, per visualizzare la vena porta e per una trazione appropriata per la legatura e l'incannulamento.
- Legare il vaso il più in alto possibile (più vicino al fegato) per garantire lo spazio per l'incannulamento successivo.
- Posizionare una seconda sutura inferiore alla prima ma sopra il pancreas. Il passaggio 2.7.2 causerà la morte del soggetto. Inoltre, questo passaggio è importante per consentire la raccolta del perfusato e prevenire un potenziale riflusso superiore al punto di incannulamento.
3. Incannulamento
- Incannulare l'aorta addominale inferiore.
- Creare un'incisione di 0,5-1,5 mm con le forbici nell'aorta addominale inferiore tra il nodo inferiore e la sutura superiore.
- Usando il nodo più basso come leva, inserire il tubo nell'aorta attraverso la tacca fino a raggiungere la sutura più superiore; Fare attenzione a non strappare.
- Legare la sutura più superiore in un nodo per bloccare il tubo in posizione.
NOTA: Questo passaggio consente al perfusato di entrare nel sistema chiuso. Con le legature in posizione, il perfusato dovrebbe viaggiare dal punto di ingresso nell'aorta addominale inferiore attraverso l'arteria celiaca, quindi i vasi pancreatici, terminando con la vena porta epatica dove il perfusato può essere raccolto.
- Incannulare la vena porta.
- Creare un'incisione di 0,5-1 mm nella vena porta subito dopo che la vena porta lascia il pancreas.
- Tenendo il nodo superiore come leva con una pinza smussata in una mano, inserire il tubo nella vena porta usando una pinza per afferrare il tubo con l'altra mano.
- Utilizzare la seconda sutura per legare il tubo in posizione, se possibile.
NOTA: Questo passaggio è il punto finale del sistema chiuso dove il perfusato deve uscire con l'impatto del pancreas sul fluido presente.
4. Raccolta
- Eseguire la perfusione.
- Prima di posizionare il tubo dell'aorta addominale inferiore, assicurarsi che il sistema di perfusione sia iniziato con il perfusato che scorre alla velocità desiderata (~2 mL/min).
NOTA: Il perfusato deve defluire dall'incannulamento della vena porta e in una provetta di raccolta. Per una più facile conservazione, è possibile utilizzare una provetta con reazione a catena della polimerasi (PCR). Le soluzioni di perfusato utilizzate qui sono 2,6 mM di glucosio con 1,2 mM di 3-isobutile-1-metilxantina (IBMX), 16,8 mM di glucosio e 2,6 mM di glucosio con 3-isobutile-1-metilxantina (IBMX) nel tampone bicarbonato Krebs-Ringer (KRB, 16 mM HEPES e 0,1% BSA, pH 7,4). La soluzione di perfusato è iniziata con una soluzione a basso contenuto di glucosio ad alto glucosio, è tornata a basso glucosio e si è conclusa con una soluzione IBX per il controllo.
- Prima di posizionare il tubo dell'aorta addominale inferiore, assicurarsi che il sistema di perfusione sia iniziato con il perfusato che scorre alla velocità desiderata (~2 mL/min).
- Raccogli il perfusato.
- Raccogliere il perfusato a intervalli di 30 minuti in provette PCR (provette sostituite ogni 3 minuti).
- Dopo ogni intervallo di 30 minuti, cambiare la soluzione.
- Eseguire un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) con i campioni. Questa operazione può essere eseguita in un secondo momento, se conservata in modo appropriato.
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Risultati
I risultati dopo l'ELISA dovrebbero dimostrare la secrezione di insulina dal pancreas del topo in misura dipendente dai livelli di glucosio perfusi. A causa della novità di questa procedura nei topi, l'analisi del risultato e del suo successo dipende dal confronto con molteplici altri studi su un pancreas di topi perfusi. Una risposta insulinica bifasica ad alte concentrazioni di glucosio è considerata fisiologica, come valutato in soggetti umani e con metodi di perifusione delle isole ce...
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Discussione
Il protocollo sopra descritto mira a creare un sistema chiuso composto dal pancreas intatto, due ingressi (celiaca e arteria mesenterica superiore) e uno sbocco (vena porta epatica). Tutti gli altri vasi sono legati per evitare perdite quando il perfusato viene fatto passare, nonché per garantire l'isolamento del pancreas stesso con il suo microambiente. Le fasi di legatura in questo protocollo consentono anche il flusso del perfusato attraverso il pancreas senza viaggiare verso altri or...
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Dichiarazioni
Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Christopher Cahill, Jennifer Hollister-Lock, i dottori Susan Bonner-Weir, Kanako Iwasaki, Francesko Hela e Priscila Carapeto per l'utile consultazione, l'assistenza tecnica e il tutoraggio durante questo progetto. Questa ricerca è stata supportata dalla sovvenzione NIDDK R01 DK132535.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ossigenatore a membrana in fibra | Apparato di Harvard | 73-3757 | Permette all'ossigeno di entrare nel perfusato |
| Termoforo | Braintree scientifico | 39OM | |
| Ketamina/xilazina | Veterinario di Patterson | 78908598 | |
| Lavagna magnetica | Braintree scientifico | 39OM | |
| Magneti con elastici | Braintree scientifico | 39OM | |
| Microscopia | N/A | N/A | Nessuna azienda specifica |
| Bombola di ossigeno | N/A | N/A | Nessuna azienda specifica |
| Provette per PCR | ThermoFisher/Invitrogen | AM12225 | Utilizzato per la raccolta del perfusato |
| Tubo in PE-30 | Braintree scientifico | PE30 | |
| Tubo in PE-50 | Braintree scientifico | PE50 | |
| Pompa peristaltica | N/A | N/A | Nessuna azienda specifica |
| Strumenti chirurgici | N/A | N/A | Nessuna azienda specifica |
| Sutura | N/A | N/A | Nessuna azienda specifica |
Riferimenti
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