Lo sbiancamento iterativo estende la molteplicità con l'uso dell'automazione della colorazione per le strutture principali

Sommario

Qui, descriviamo l'applicazione del metodo IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplicity) utilizzando coloratori tissutali automatizzati disponibili in commercio e considerazioni di ottimizzazione per l'uso di reagenti basati sull'amplificazione del segnale tiramidico.

Abstract

Lo sbiancamento iterativo estende la molteplicità (IBEX) è una tecnica di imaging a fluorescenza multi-round basata sull'amplificazione del segnale della tiramide (TSA) altamente sensibile che consente l'esame dettagliato di numerose biomolecole proteiche in un singolo campione di tessuto attraverso lo sbiancamento ripetuto, la ricolorazione e la co-registrazione dell'immagine. Nonostante la sua crescente adozione per la generazione di immunocolorazione altamente multiplexata, l'implementazione di IBEX in modo automatizzato attraverso l'implementazione nelle strutture principali offre numerosi vantaggi, tra cui una maggiore produttività, riproducibilità ed efficienza complessiva del personale di laboratorio. In questo articolo, dimostriamo il successo dell'applicazione di IBEX su due piattaforme di autocoloranti ampiamente utilizzate e discutiamo importanti considerazioni di ottimizzazione per la progettazione di pannelli utilizzando reazioni basate su TSA per campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Ciò include la metodologia per testare la sensibilità al recupero dell'antigene anticorpo, una considerazione importante per la progettazione del pannello IBEX quando si determina la sequenza di sviluppo degli anticorpi. Inoltre, mostriamo gli approcci di imaging a valle che utilizzano scanner per vetrini interi disponibili in commercio e illustriamo l'allineamento e l'analisi della qualità utilizzando il software di fenotipizzazione cellulare disponibile in commercio. Attraverso descrizioni dettagliate di queste metodologie e video di accompagnamento, miriamo a evidenziare la versatilità e la facilità di IBEX, offrendo una guida pratica per le strutture di patologia di base per integrare IBEX nelle loro piattaforme di colorazione automatizzate esistenti.

Introduzione

Lo sbiancamento iterativo estende la molteplicità (IBEX) è un progresso significativo nell'immunoistochimica fluorescente multi-round altamente sensibile basata su TSA, che consente la visualizzazione e la quantificazione dettagliate di numerose biomolecole all'interno di un singolo campione di tessuto. Utilizzando cicli ripetuti di sbiancamento e ricolorazione, IBEX consente l'esame di ambienti cellulari complessi con una profondità e una chiarezza senza pari, rendendolo uno strumento potente nel campo dell'immunocolorazione e dell'imaging multiplex ^1,2.

Molti enti accademici, governativi e industriali ospitano strutture di patologia di base dedicate al supporto di una vasta gamma di metodologie di ricerca basate sui tessuti volte a generare set di dati morfomolecolari qualitativi e quantitativi. Questi nuclei sono risorse critiche, in quanto forniscono servizi specializzati basati sui tessuti che consentono ai laboratori di ricerca di esternalizzare processi di patologia molecolare complessi e laboriosi e di consultarsi direttamente con i patologi nella progettazione dello studio, nello sviluppo di saggi e nell'interpretazione dei dati. Per garantire la coerenza e ridurre la variabilità tra gli esperimenti, queste strutture principali si affidano abitualmente a strumenti automatizzati per autocoloranti disponibili in commercio, progettati per eseguire protocolli di colorazione standardizzati con elevata riproducibilità ed efficienza³.

Sebbene gli autocoloratori siano diventati la spina dorsale dell'immunocolorazione nelle strutture principali, consentendo un'elevata produttività e risultati coerenti, non sono ancora stati adattati per accogliere progressi più recenti come IBEX. Inoltre, la necessità di conoscenze specialistiche nella progettazione di pannelli, in particolare quando si utilizzano reagenti basati sull'amplificazione del segnale tiramide (TSA)⁴, aggiunge un ulteriore livello di complessità, limitando la più ampia adozione di IBEX nei flussi di lavoro di ricerca di routine. Di conseguenza, i ricercatori che desiderano sfruttare le capacità di imaging multiplex ad alta risoluzione di IBEX possono spesso essere limitati dalle apparecchiature esistenti delle loro strutture principali. Questo divario tra le tecniche di imaging innovative e le realtà pratiche delle operazioni di base delle strutture evidenzia un ostacolo alla più ampia adozione dell'IBEX nella ricerca accademica. Questo lavoro mira ad affrontare questa barriera dimostrando il successo dell'applicazione di IBEX su piattaforme di autocoloranti comuni, concentrandosi sull'uso di reagenti basati su TSA utilizzando tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Per prima cosa discutiamo i passaggi necessari per costruire un pannello IBEX utilizzando coloranti a base TSA e l'applicazione della copertura di questi pannelli a due diversi autocoloratori disponibili in commercio. Insieme, questo offre una guida pratica sui test di sensibilità al recupero di anticorpi-antigeni, discutendo le considerazioni chiave per ottimizzare la progettazione del pannello e fornendo un metodo alternativo per l'allineamento del pannello utilizzando software commerciali che potrebbero essere disponibili e attraverso i principali laboratori di patologia.

Protocollo

1. Costruzione di pannelli IBEX con coloranti a base TSA

NOTA: Utilizzare sempre un preparato fresco di anticorpi e coloranti e conservare a 4 °C quando non viene utilizzato.

1. Test di sensibilità al recupero dell'antigene
   1. Preparazione delle diapositive
      1. Utilizzare un microtomo per raccogliere tre sezioni seriali per ciascun anticorpo da testare dallo stesso tessuto incluso in FFPE su tre vetrini separati caricati positivamente.
      2. Etichettare i vetrini con l'anticorpo da testare, insieme al numero di cicli di recupero dell'antigene da testare: 1 ciclo, 3 cicli e 6 cicli.
      3. Asciugare i vetrini per una notte a temperatura ambiente. Se si lavora solo con pennarelli di superficie, cuocere le diapositive a 60 ^oC per almeno 20 minuti per ammorbidire la cera. Se si lavora con pennarelli nucleari, cuocere i vetrini a 60 ^oC durante la notte.
   2. Prepara il programma sull'autostainer per il diverso numero di cicli, assicurandoti che ci siano tre fasi di lavaggio tra ogni fase. Vedere la Tabella 1 per esempi di protocolli per test a 1, 3 e 6 cicli.
      NOTA: Per ogni singolo anticorpo, assicurarsi che il tempo sia costante per la fase dell'anticorpo e l'applicazione del colorante TSA.
      Per l'applicazione del colorante a base di TSA, un'alternativa al lasciare riposare il colorante per 3-10 minuti a temperatura ambiente è quella di lasciare che il colorante incubi per 20 minuti a 37 °C.
   3. Caricare i campioni sull'autocoloratore ed eseguire il protocollo per il numero di cicli associato.
   4. Ripetere questo processo dai passaggi 1.1.1 a 1.1.3 per ogni singolo anticorpo da convalidare e testare.
   5. Rimuovere i vetrini dall'autostainer e posizionarli in PBS.
   6. Montare i vetrini con un mezzo di montaggio acquoso (come per un proiettile IBEX) e un vetrino coprioggetti #1,5 per un imaging ottimale.
   7. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza per visualizzare il vetrino a 1 ciclo per il colorante TSA e il DAPI, prendendo nota del tempo di esposizione necessario per visualizzare il segnale.
   8. Ripetere l'operazione per i vetrini da 3 e 6 cicli, annotando il tempo di esposizione necessario per visualizzare il colorante TSA.
   9. Confronta i tempi di esposizione tra i diversi numeri di ciclo. Vedere la Figura 1 per esempi. Assicurarsi tre cicli di lavaggio tra tutti i passaggi.
      1. Se il tempo di esposizione diminuisce con l'aumentare dei cicli, posizionare questo anticorpo e colorare in un passaggio successivo.
      2. Se il tempo di esposizione aumenta con l'aumentare dei cicli, posizionare questo anticorpo in una fase precedente.
      3. Se non si verifica un grande cambiamento nel tempo di esposizione, posizionare questo anticorpo in qualsiasi fase.
      4. Raggruppare gli anticorpi in base ai requisiti del ciclo per il passaggio iniziale presso i pannelli IBEX.
         NOTA: Per ottenere i migliori risultati, eseguire questa convalida su tutti i marcatori desiderati per un determinato pannello IBEX. Eseguire questa convalida ogni volta che si modificano i tipi di tessuto o quando si lavora con anticorpi primari policlonali con numeri di lotto univoci.
2. Affrontare il bleedthrough del segnale proveniente da un colorante spettrale vicino valutando la potenza del segnale.
   1. Raggruppare gli anticorpi in potenziali pannelli IBEX in base al numero ottimale di cicli di recupero, come è stato determinato dall'alto in gruppi di 1, 3 o 6 cicli.
   2. Preparazione delle diapositive
      1. Utilizzare un microtomo per creare sezioni seriali da un campione FFPE, una per ogni anticorpo da utilizzare in un singolo pannello IBEX.
      2. Etichettare ogni vetrino con uno degli anticorpi da utilizzare nel pannello IBEX.
      3. Lasciare asciugare i vetrini per una notte a temperatura ambiente. Se si lavora solo con pennarelli di superficie, lasciare cuocere i vetrini a 60 ^oC per almeno 20 minuti per ammorbidire la cera. Se si lavora con i marcatori nucleari, lasciare cuocere i vetrini a 60 ^oC per una notte.
   3. Per il gruppo di cicli 1, 3 e 6, utilizzare l'impostazione di un ciclo dalla Tabella 1. Assicurati tre lavaggi tra tutti i passaggi
      1. Modificare il protocollo per ogni anticorpo da utilizzare con il tempo di colorazione ottimale.
      2. Utilizzare lo stesso tempo TSA per tutti gli anticorpi.
   4. Colorare i campioni sull'autostainer.
   5. Rimuovere i campioni e posizionare i vetrini in PBS.
   6. Montare i vetrini con un mezzo di montaggio acquoso (come per un proiettile IBEX) e un vetrino coprioggetti #1,5 per un imaging ottimale.
   7. Visualizzare i vetrini su un microscopio a epifluorescenza utilizzando il tempo di esposizione ottimale per ciascuna immagine.
   8. Determina la potenza del segnale. Le diapositive con tempi di esposizione brevi hanno una potenza del segnale molto elevata, mentre le diapositive con un tempo di esposizione lungo hanno una potenza del segnale bassa.
   9. Utilizzare la potenza del segnale insieme al numero di ciclo per sviluppare pannelli IBEX.
      1. Raggruppare gli anticorpi in base al numero di ciclo.
      2. Per un dato gruppo di anticorpi con un numero di ciclo specifico, assicurarsi che un segnale forte non sia otticamente vicino a un segnale debole per ridurre al minimo lo spillover del segnale.
3. Convalida i singoli pannelli IBEX per assicurarti che ogni pannello possa generare il risultato desiderato.
   1. Prepara le diapositive.
      1. Utilizzare un microtomo per creare sezioni seriali, una per ogni pannello IBEX multiplex, ed etichettare con l'ordine del pannello IBEX da utilizzare.
      2. Lasciare asciugare i vetrini per una notte a temperatura ambiente. Se si lavora solo con pennarelli di superficie, lasciare cuocere i vetrini a 60 ^oC per almeno 20 minuti per ammorbidire la cera. Se si lavora con i marcatori nucleari, lasciare cuocere i vetrini a 60 ^oC per una notte.
   2. Configura l'autostainer.
      1. Per il primo pannello, impostare il programma autostainer senza ulteriori passaggi di recupero dell'antigene.
      2. Per il secondo pannello, introdurre ulteriori fasi di denaturazione prima del primo anticorpo pari al numero di fasi di denaturazione nel primo pannello. Vedere la Tabella 2 per un esempio di pannello 1 con cinque anticorpi e la Tabella 3 per un esempio di pannello 2 con quattro anticorpi. Assicurarsi tre passaggi di lavaggio tra tutti i passaggi.
      3. Ripetere l'operazione in base alle esigenze per ulteriori pannelli IBEX, aggiungendo ulteriori passaggi di denaturazione.
   3. Rimuovere i vetrini dall'autostainer e posizionarli nel PBS fino al momento del montaggio.
   4. Montare i vetrini con un mezzo di montaggio acquoso (come per un proiettile IBEX) e un vetrino coprioggetti #1,5 per un imaging ottimale.
   5. Visualizzare i vetrini su un microscopio a epifluorescenza utilizzando il tempo di esposizione ottimale per ogni immagine e per ogni colorante TSA.
   6. Valuta se tutti i pannelli vengono visualizzati correttamente. In tal caso, passa all'imaging IBEX. In caso contrario, reindirizzare i cicli di bilanciamento e recupero del segnale.
      NOTA: Alcune regolazioni possono essere effettuate all'interno di un singolo pannello per ottimizzare il segnale e prevenire l'"effetto ombrello". Alcuni segnali molto abbondanti possono bloccare la colorazione dei segnali a valle. Guarda all'interno di un dato pannello per utilizzare prima le macchie più scarsamente presenti (vedi Figura 2).

2. Adattamento IBEX con autocoloratori utilizzando reagenti TSA e piattaforme di imaging di vetrini interi (Figura 3)

NOTA: Per il confronto tra i due autocoloranti convalidati utilizzati e discussi in questo protocollo, vedere la Tabella 4.

1. Preparare tutti i vetrini per la corsa IBEX.
   1. Usa un microtomo per creare sezioni FFPE su un vetrino caricato positivamente. Assicurarsi di includere un vetrino per ogni campione sperimentale, vetrini di controllo positivi di sezioni di tessuto note per contenere gli antigeni da sottoporre a imaging e un vetrino di controllo negativo in cui il PBS viene utilizzato al posto di tutti gli anticorpi primari.
      NOTA: Se si lavora in lotti, includere un campione di controllo in lotti. Un campione di controllo del lotto è un singolo blocco di tessuto FFPE che viene sezionato e incluso in ogni lotto di campioni sperimentali per l'uso nella normalizzazione e nel controllo della variazione sperimentale tra lotti di campioni di colorazione. Ciò è necessario solo se non tutti i campioni verranno elaborati insieme.
   2. Lasciare asciugare i vetrini per una notte a temperatura ambiente. Se si lavora solo con pennarelli di superficie, lasciare cuocere i vetrini a 60 ^oC per almeno 20 minuti per ammorbidire la cera. Se si lavora con i marcatori nucleari, lasciare cuocere i vetrini a 60 ^oC per una notte.
2. Preparare gli anticorpi e i coloranti per il primo pannello IBEX da visualizzare.
3. Impostare il programma di autocolorazione. Vedere la Tabella 2 per un esempio di pannello a 5 marcatori. Assicurati tre lavaggi tra ogni passaggio.
4. Caricare i campioni e gli anticorpi nell'autocoloratore ed eseguire il programma per colorare i campioni.
5. Rimuovere i vetrini dall'autostainer e applicare un vetrino coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio acquoso appropriato per l'imaging multispettrale e un vetrino coprioggetti #1.5.
6. Visualizzare i vetrini entro 2 giorni dalla colorazione
7. Imaging a fluorescenza su scanner a epifluorescenza o a fluorescenza
   1. Iniziando con il campione di controllo positivo ben controllato, caricare il campione di controllo positivo nel microscopio.
      1. Individuare un segnale positivo nel campione per ciascuno dei diversi antigeni da sottoporre a ripresa.
      2. Impostare il tempo di esposizione per garantire l'acquisizione della gamma dinamica della macchia riducendo al minimo lo sfondo iniziando da un'esposizione bassa e aumentando gradualmente il tempo di esposizione fino a quando il segnale è presente. Fallo per ogni colorante individualmente.
         NOTA: Verificare la presenza di un'espressione sia alta che bassa dei marcatori per garantire l'acquisizione dell'intera gamma dinamica.
   2. Salvare le impostazioni utilizzate per il campione di controllo positivo e utilizzarle per tutte le ulteriori fasi di imaging.
   3. Caricare e visualizzare il campione di controllo negativo e tutti i campioni sperimentali utilizzando le impostazioni determinate dal campione di controllo positivo.
   4. Verificare che le immagini siano di qualità ottimale prima di procedere con i passaggi successivi.
8. Rimozione vetrino coprioggetti
   1. Immergere i vetrini in un barattolo Coplin con acqua deionizzata. Mettere il barattolo Coplin a bagnomaria a 65 °C per 15-20 minuti per facilitare la rimozione naturale del vetrino. In alternativa, se si utilizza un mezzo di montaggio a base acquosa o se il mezzo di montaggio si è completamente indurito, rimuovere i vetrini immergendoli in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o acqua deionizzata durante la notte per consentire ai vetrini coprioggetti di cadere naturalmente.
9. Decolorazione con LiBH₄
   1. In una cappa aspirante, preparare una soluzione fresca di LiBH₄ a una concentrazione di 1 mg/mL in acqua deionizzata. Prepara abbastanza per coprire ogni campione 3 volte.
      NOTA: Non preparare più di 10 ml alla volta a causa della reazione di LiBH₄ con l'acqua. Utilizzare acqua deionizzata e non acqua Millipore/nanopura per un'attività di sbiancamento ottimale.
   2. Lasciare riposare la soluzione per 20 min. Si formeranno delle bolle.
   3. Pipettare 1 mL di soluzione di LiBH₄ su ciascun vetrino in una camera di colorazione in una cappa aspirante. Lasciare riposare la soluzione sul vetrino per 10-15 min.
   4. Rimuovere il LiBH₄ pipettandolo dal vetrino e sostituirlo con un nuovo 1 mL di LiBH_4. Lasciare riposare la soluzione per 10-15 min.
   5. Rimuovere il LiBH₄ pipettandolo dal vetrino e sostituirlo con un nuovo 1 mL di LiBH_4. Lasciare riposare la soluzione per 10-15 min.
   6. Rimuovere il LiBH₄ dai vetrini mediante pipettaggio e immergere i vetrini in acqua deionizzata o PBS per una conservazione a breve termine (non più di 1 giorno).
   7. Entro un giorno, passa al successivo giro di colorazione IBEX.
   8. Opzionale: monta i vetrini a umido ed esegue una visualizzazione rapida su un endoscopio a epifluorescenza per verificare il successo dello sbiancamento.
10. Montaggio a umido del vetrino nell'autostainer e seconda corsa di colorazione IBEX
    1. Preparare tutti gli anticorpi e le soluzioni coloranti TSA per l'autocolorante.
    2. Per l'autostainer Ventana:
       1. Quando si è pronti per iniziare la colorazione automatica, pipettare circa 1 mL di tampone di lavaggio per autostainer sul vetrino per evitare che si secchi dal supporto bagnato.
       2. Caricare i vetrini montati a umido nell'autostainer.
    3. Per il Bond Rx:
       1. Posiziona le tessere di copertina sulle diapositive.
       2. Nella parte superiore del coperchio, pipettare 300 μL di tampone di lavaggio per consentire alla soluzione di fluire nello spazio tra il campione e il coperchio.
       3. Caricare i campioni sull'autostainer.
    4. Impostare il programma autostainer seguendo l'esempio nella Tabella 2 con N impostato sul numero di anticorpi nel pannello.
    5. Rimuovere i vetrini dall'autostainer e applicare un vetrino coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio acquoso appropriato per l'imaging multispettrale e un vetrino coprioggetti #1.5.
    6. Acquisire l'immagine dei vetrini entro 2 giorni dalla colorazione seguendo la procedura di campionamento descritta al passaggio 2.7 per l'impostazione della sessione di imaging e la raccolta delle immagini.
    7. Dopo l'imaging, sbiancare i campioni come descritto nei passaggi 2.8-2.9.
11. Ripetere l'operazione per tutti i pannelli IBEX desiderati.

3. Analisi dei campioni con software disponibili in commercio

1. Completare le scansioni di tutti i vetrini colorati prima di procedere all'allineamento.
2. Se il software lo consente, eseguire l'unmixing spettrale attraverso la funzione di unmixing automatizzata integrata nelle funzioni di scansione, inclusa la rimozione degli spettri di autofluorescenza. Se questa è una funzione del software in uso, selezionare l'opzione di smescolamento ed eseguire utilizzando le impostazioni standard e i coloranti preimpostati
   NOTA: L'unmixing personalizzato può essere generato nella maggior parte dei software che consentono l'unmixing. Per creare una libreria, alle misurazioni del software vengono aggiunte singole sezioni di tessuto colorate con un singolo fluoroforo. Viene anche scansionata una regione di tessuto non colorato o autofluorescente per caratterizzare lo spettro di autofluorescenza, che viene selezionata con lo strumento di autofluorescenza. Questi spettri vengono compilati all'interno del programma premendo "prepara immagine" e quindi esportati in una libreria di unmixing specifica per il progetto. Questa libreria viene quindi selezionata come libreria di unmixing nell'opzione di unmixing.
3. Importa i vetrini scansionati in un software di analisi delle immagini disponibile in commercio per l'allineamento.
4. Registrazione dei vetrini di più round IBEX
   1. Seleziona due iterazioni di arrotondamenti IBEX da registrare.
   2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui due e selezionare l'opzione Registra .
   3. Selezionare la registrazione predefinita con registrazione ad alta risoluzione per un primo tentativo di registrazione.
   4. In alternativa, selezionare Registrazione canale singolo dalle opzioni e selezionare un singolo canale che sia coerente in tutte le esecuzioni IBEX.
      NOTA: Questa opzione è utile per i coloranti resistenti allo sbiancamento (vedere i materiali per i quali i coloranti non candeggiano).
5. Allineamento dell'immagine
   1. Aprire una delle immagini registrate.
   2. Nella scheda Strumenti , in Registrazione immagini, selezionare Strumenti di registrazione per aprire tutte le immagini registrate.
   3. Nella scheda Strumenti di registrazione , selezionare la funzione di punto di riferimento.
   4. Usa la funzione punto di riferimento per regolare con precisione l'allineamento di intere diapositive.
      1. Contrassegna manualmente i punti di riferimento su un'immagine della diapositiva.
      2. Sulle altre immagini IBEX, segna lo stesso punto di riferimento. Il programma perfezionerà l'allineamento utilizzando il punto di riferimento identificato. Ripetere per la regolazione fine dell'allineamento.
   5. Una volta soddisfatti dell'allineamento, fondere le slitte utilizzando il Fuse | Funzione Serial Stain.
   6. Ripetere questo processo con eventuali cicli di imaging IBEX aggiuntivi fino a completare una composizione finale di tutte le immagini.
6. Analisi delle immagini
   1. Segmentazione delle cellule
      1. Nella scheda Analisi , selezionare e aprire il modulo HighPlex, quindi selezionare il modulo di fenotipizzazione per l'identificazione delle celle.
         1. Carica tutti i marcatori e inizia trovando tutti i nuclei utilizzando la scheda Rilevamento nucleare nel modulo Highplex . Caricare i marker nella scheda Selezione colorante . Identificare le cellule utilizzando la colorazione DAPI.
         2. Nella scheda Analizza , attiva lo strumento di sintonizzazione in tempo reale utilizzando i seguenti parametri chiave: Intensità nucleare minima impostata per filtrare il segnale di fondo; Luminosità massima dell'immagine impostata per controllare la visibilità complessiva del segnale; Segmentazione nucleare Aggressività impostata per affinare i confini dei nuclei rilevati.
         3. Ottimizza attentamente ogni parametro per garantire una segmentazione accurata.
   2. Rilevare il citoplasma e i marcatori di membrana.
      1. Passare alla scheda Rilevamento membrana e citoplasma .
      2. Impostare il raggio minimo del citoplasma su un valore appropriato per il campione per la dimensione prevista delle cellule.
      3. Nell'opzione Coloranti a membrana , specificare quali canali sono marcatori di membrana.
         NOTA: Ciò dovrebbe comportare una migliore segmentazione delle singole cellule per ulteriori analisi.
   3. Soglia del marcatore e assegnazione del fenotipo
      1. Per ogni indicatore, imposta le soglie per i segnali positivi rispetto a quelli negativi. Fallo nelle schede generate per ogni marcatore.
      2. Esegui la soglia manuale per ogni marcatore per identificare le popolazioni.
      3. In alternativa, utilizzare un approccio automatizzato al thresholding basato sulla bioinformatica. Nella sezione Avanzate | Memorizza dati oggetto (cella), sposta l'opzione su True. In Esportazione | Dati oggetto, esporta il set di dati per ottenere informazioni sull'espressione del marcatore per ogni cella identificata.
      4. Importa questi dati in un software aggiuntivo per un'analisi ulteriore e personalizzata. Le opzioni per il software per ulteriori analisi si trovano nella Tabella 5.

Risultati

Forniamo un esempio di un pannello IBEX che utilizza reagenti basati su TSA su Autostainer 2 (Figura 4). Ogni marcatore può essere delineato in modo chiaro e c'è una minima sbavatura tra i marcatori. L'immagine è stata raccolta attraverso due cicli di colorazione. Il campione è costituito da tessuto polmonare a seguito di infezione da Mycobacterium tuberculosis. I due pannelli di colorazione IBEX sono stati allineati utilizzando un software di esempio disponibile in commercio. Utilizzando l'approccio IBEX con reagenti TSA ottimizzati (come descritto qui), è possibile vedere e apprezzare l'organizzazione spaziale delle cellule immunitarie, dei marcatori infiammatori e delle cellule polmonari specializzate. Una corretta ottimizzazione consente di visualizzare facilmente i marcatori con uno sfondo minimo.

Figura 1: Test di recupero dell'antigene con un fluoroforo con un'emissione di 520 nm di due antigeni diversi. RAGE e CD3e sono stati ripresi utilizzando tempi di esposizione conservati. L'epitopo di questo anticorpo RAGE è altamente sensibile e suscettibile al recupero ripetuto dell'antigene con un rapido calo della sensibilità del test con successivi recuperi dell'antigene. Al contrario, la sensibilità del dosaggio CD3e migliora con più cicli di recupero dell'antigene. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazione: RAGE = Recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempio dell'importanza dello sviluppo della sequenza rispetto all'effetto ombrello. RAGE è un marcatore altamente espresso nelle cellule AT1 e, in combinazione con CD31, blocca efficacemente l'immunoreattività di SARS-CoV-2. Tuttavia, quando l'IHC SARS-CoV-2 viene eseguito per primo, tutti i segnali possono essere visualizzati. Barre di scala = 25 μm. Abbreviazioni: RAGE = Recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata; AT1 = Alveolare Tipo 1; SARS-CoV-2 = Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2; IHC = Immunoistochimica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Panoramica del processo che utilizza apparecchiature di colorazione automatizzate per il protocollo IBEX. Montaggio a umido per il round 2 o superiore del processo di colorazione per evitare che il tessuto si secchi. Abbreviazione: IBEX = Lo sbiancamento iterativo estende la molteplicità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempio di IBEX con coloranti a base di TSA dell'autostainer 2 su un polmone infetto da Mycobacterium tuberculosis. Il pannello 1 contiene tutti i coloranti e il pannello 2 contiene i coloranti che erano suscettibili di sbiancamento. Viene presentata un'immagine unita di tutti i canali nell'IBEX completo dell'immagine polmonare. Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: IBEX = lo sbiancamento iterativo estende la molteplicità; TSA = Amplificazione del segnale della tiramide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Un esempio di protocollo per convalidare gli effetti del numero di ciclo sugli anticorpi per i test a 1, 3 e 6 cicli. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Un esempio di pannello 1 con cinque anticorpi per l'autostainer IBEX per la validazione del pannello. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Un esempio di pannello 2 con quattro anticorpi per l'autostainer IBEX per la convalida del pannello. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Confronto tra due autocoloranti. Tabella che riassume i pro e i contro dell'Autostainer Ventana e del Bond Rx. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Riepilogo del software per l'analisi delle immagini. Tabella riassuntiva di alcuni degli approcci di analisi e degli strumenti software disponibili per l'analisi delle immagini post-segmentazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

In questo articolo, forniamo considerazioni per l'adattamento del protocollo IBEX nelle strutture di patologia di base con l'applicazione di apparecchiature di colorazione automatizzate e l'ottimizzazione dei reagenti basati su TSA nel protocollo IBEX. Dimostriamo come ottimizzare al meglio i cicli ripetuti di recupero dell'antigene e il corretto caricamento nel round 2 o superiore sull'apparecchiatura automatizzata. Inoltre, viene illustrato un metodo aggiuntivo per eseguire l'allineamento utilizzando il software Halo che potrebbe essere disponibile nelle strutture principali. Questi approcci si sono dimostrati utili per determinare le differenze negli ambienti polmonari nel tessuto di primati non umani a seguito di infezioni da SARS-CoV-2⁵.

Una componente chiave di questo lavoro è evidenziare la necessità di un'ampia ottimizzazione del design del pannello IBEX prima della colorazione dei tessuti sperimentali. In particolare, con l'uso di reagenti basati su TSA, devono essere prese in considerazione alcune considerazioni non osservate nei metodi IBEX di base. Il primo è l'impatto di più cicli di recupero dell'antigene sulla sensibilità anticorpale. Con i reagenti a base di TSA, ogni nuovo sviluppo di anticorpi è preceduto dalla denaturazione degli anticorpi. Alcune coppie anticorpi/antigene saranno suscettibili a ulteriori cicli di recupero dell'antigene e diminuiranno la sensibilità del test, mentre altre otterranno una maggiore sensibilità con la denaturazione/recupero ripetitivo dell'antigene. Un attento test di ciascun anticorpo nel tessuto bersaglio prima di progettare i pannelli è importante per garantire le migliori pratiche di colorazione e informare l'ordine di sequenza sia degli anticorpi che dei coloranti fluorescenti. I tamponi, sia a base di citrato (pH 6,0) che a base di Tris-EDTA (pH 9,0), vengono testati per tutti gli anticorpi per determinare le condizioni ottimali di recupero dell'antigene. Ciò comporta la valutazione sistematica di ciascun tampone per identificare quale massimizza l'esposizione all'antigene per un determinato anticorpo. Inoltre, la temperatura (ad esempio, 20-37 °C), il tempo di incubazione (in genere 30-60 minuti) e le condizioni di blocco sono ottimizzate per ridurre la colorazione di fondo non specifica e garantire il legame specifico degli anticorpi primari e secondari, se necessario. Il blocco prima degli anticorpi primari e secondari può includere l'uso di reagenti bloccanti disponibili in commercio per tenere conto dell'autofluorescenza tessuto-specifica o delle interazioni non specifiche. Altre considerazioni importanti che devono essere ottimizzate prima di finalizzare i pannelli IBEX includono l'effetto ombrello, in cui la schermatura degli epitopi può verificarsi se l'ordine non è adattato alla specifica domanda di ricerca posta⁶. Per evitare il bleedthrough fluorescente, è tipico inserire bersagli antigenici ad alta espressione in canali rossi lontani che hanno il minor bleedthrough e marcatori più deboli nell'intervallo 480-520 nm, che avranno il miglior rapporto segnale/rumore dato che questi coloranti fluorescenti sono i⁷ più luminosi. Tuttavia, è necessario prestare attenzione ai campioni di tessuto altamente autofluorescenti che possono essere più luminosi in questo intervallo; Si consiglia di affrontare questo problema con l'imaging dei tessuti senza coloranti per affrontare i potenziali livelli di autofluoroesenza. Insieme, queste fasi di ottimizzazione, eseguite con tutte le normali ottimizzazioni e controlli tipicamente eseguiti con IBEX, possono informare la corretta progettazione del pannello per IBEX con reagenti TSA.

In questo metodo, abbiamo dimostrato l'uso di due autocoloranti comuni. Tuttavia, questi approcci potrebbero essere applicati anche ad altri metodi di autocolorazione. La parte fondamentale qui è la rimozione ottimale dei vetrini coprioggetti e il carico umido per ulteriori giri di colorazione. Inoltre, non specifichiamo alcuna configurazione specifica del microscopio. Sebbene i kit possano consigliare l'uso con determinati sistemi di imaging per una scansione ottimale dei vetrini, qualsiasi configurazione del microscopio, in particolare un microscopio a epifluorescenza con cubi filtranti compatibili e una sorgente luminosa a LED ad ampio spettro, dovrebbe funzionare. Alcuni coloranti richiedono rivelatori multispettrali o cubi filtranti specializzati, che potrebbero non essere disponibili in tutti i laboratori e possono presentare sfide se utilizzati con cubi filtranti standard a causa della loro sovrapposizione spettrale. Questi coloranti vengono separati meglio utilizzando sistemi di imaging multispettrale o filtri altamente specifici. Alcuni fluorofori non rientrano nell'intervallo dei filtri rossi lontani convenzionali (tipicamente ~700 nm) e richiedono un cubo di filtro o un rivelatore specializzato in grado di catturare segnali nel vicino infrarosso. I microscopi specializzati sono costruiti con questi filtri, ma sono disponibili alternative. Questi richiederanno un'ulteriore ottimizzazione per determinare come si comportano i coloranti in una data configurazione del microscopio.

L'unmixing multispettrale è altamente raccomandato per gli IHC fluorescenti multiplex, in particolare quando si lavora con tessuti inclini all'autofluorescenza, in quanto separa efficacemente il segnale reale dal rumore di fondo. L'autofluorescenza, che spesso si sovrappone agli spettri di emissione dei fluorofori comunemente usati (in particolare nei canali a lunghezza d'onda più elevata), può oscurare o interferire con segnali specifici, riducendo l'accuratezza. L'unmixing spettrale districa matematicamente gli spettri di emissione sovrapposti, isolando i segnali fluorescenti reali e "ripulendo" l'autofluorescenza indesiderata. L'unmixing spettrale è particolarmente utile nei flussi di lavoro IBEX, dove ottenere i segnali più puliti possibili è fondamentale a causa della natura iterativa del processo di colorazione e imaging. In IBEX, i segnali provenienti da più cicli di colorazione vengono visualizzati, sbiancati e impilati uno sopra l'altro per creare un'immagine composita. Qualsiasi autofluorescenza o sanguinamento che rimane irrisolto in un ciclo può propagarsi attraverso le immagini impilate, complicando l'analisi a valle e riducendo la fiducia nella localizzazione dei marcatori. L'unmixing spettrale isola efficacemente i segnali di fluorescenza reale dall'autofluorescenza di fondo, garantendo un rilevamento del segnale più pulito e accurato in ogni singolo round. Questa chiarezza del segnale è essenziale per generare immagini composite affidabili in cui più marcatori vengono analizzati insieme durante i round, consentendo una fenotipizzazione e un'analisi spaziale sicure. La piattaforma di imaging utilizzata per questo protocollo dispone di funzionalità di unmixing integrate, ma sono necessarie più opzioni di unmixing per la compatibilità con altre piattaforme di imaging fluorescenti per vetrini interi.

Inoltre, un limite di questo lavoro è la natura proprietaria degli autocoloranti, poiché i reagenti e i tamponi di lavaggio associati sono ottimizzati per questi sistemi, ma le formulazioni specifiche rimangono non divulgate. Inoltre, ci siamo concentrati esclusivamente su un software di analisi delle immagini disponibile in commercio per l'analisi delle immagini dell'intero vetrino e riconosciamo che il costo delle licenze software può rappresentare un ostacolo finanziario per alcuni laboratori. Il software di analisi aggiuntivo ^8,9 e le opzioni in R sembrano promettenti; in particolare, il Bodenmiller Group¹⁰, che ha creato un set di pacchetti che sembra ottimale per i core, in quanto IMCDataAnalysis¹¹ è destinato a un flusso di lavoro riproducibile sull'analisi a valle di immagini multiplex in R. Tuttavia, sono necessari sforzi futuri per sviluppare e caratterizzare alternative accessibili ed economiche per l'analisi IBEX dell'intero vetrino, al fine di garantire un'adozione più ampia in contesti con risorse limitate. Inoltre, questo approccio con l'uso degli autocoloranti per IBEX può essere adattato per colorazioni più tradizionali in IBEX, anche con anticorpi primari coniugati fluorescenti, o con anticorpi secondari standard senza coloranti a base di TSA se il tessuto è di qualità sufficientemente elevata e tempo di fissazione ottimale per consentire un buon segnale.

Nel complesso, speriamo che questo lavoro possa aiutare con l'applicazione di IHC fluorescenti multiplex basati su TSA utilizzando apparecchiature di base per la patologia utilizzate di routine per adattare più ampiamente IBEX in questi ambienti. Questo tipo di applicazione evidenzia veramente la versatilità del protocollo IBEX e dimostra la sua utilità anche in campioni di tessuto difficili o in approcci di grandi lotti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit TSA Alexa per reagenti per colorazioni	ThermoFisher		Coloranti TSA alternativi se non sono disponibili filtri per microscopia a opale. Questi includono Alexa Fluor 488 (canale blu/verde), Alexa Fluor 555 o 568 (canale rosso), Alexa Fluor 647 (canale rosso lontano), Alexa Fluor 750 (infrarossi vicini, se dotati di filtri appropriati).
Anticorpi Arg1	Segnalazione cellulare	93668	Usato nella Figura 4 al minuto 1:100
Material Blades	Leica Biosystems		Oppure, un profilo alto o basso dipenderà dal tipo di tessuto
Anticorpi CD11b	Abcam	ab133357	Utilizzato nella Figura 4 al 1:2000
Anticorpi CD163	Abcam	ab182422	Utilizzato nella Figura 4 al minuto 1:500
Anticorpi CD31	Segnalazione cellulare	77699S	Usato nella Figura 2 al minuto 1:100
Anticorpi CD3e	Dako	A045201-2	Utilizzato nella Figura 1 al minuto 1:100
Tool Coplin Jar	Fischer Scientific	01-816-21	O simili
Copertine materiali	VWR	v48393-026	O simili
Antibody CX3CR1	Abcam	ab308613	Usato nella Figura 4 al minuto 1:450
Stain DAPI	Akoya	FP1490
Software FIJI			Utilizzato per misurare l'intensità del segnale
Slide Fisher Superfront Slides	Fisher Scientific	22-037-246	O simili
Software HALO	Indica Labs		Esempio di software di analisi delle immagini commercialmente disponibile. Usato per allineare e analizzare immagini.
Anticorpi Iba1	Segnalazione cellulare	17191	Utilizzato nella Figura 4 al minuto 1:800
Software inForm	Akoya		Utilizzato per misurare l'intensità del segnale
Anticorpi iNOS	Abcam	ab283655	Usato nella Figura 4 al minuto 1:400
Strumento Leica Bond Rx (o RXm)	Leica Biosystems	21.2201	Viene chiamato "Autostainer 1" nel testo. Assicurarsi che tutti i reagenti associati siano disponibili anche tra cui scatole per la colorazione e soluzioni sfuse.
Reagent LiBH4	Sigma-Aldrich	62460-5G-F	Conserva in un ambiente anidro
Strument Mantra Snap	Akoya		È necessario un microscopio multispettrale a fluorescenza per rimuovere i coloranti. Esempio di microscopio che può essere usato per rilevare coloranti opali.
Microtomo Tool	Leica Biosystems		O simili con accessori preferiti come pennelli
Reagente per la colorazione Kit Opal IHC 480	Akoya	FP1500001KT	Utilizzato nella Figura 4
Reagente per la colorazione Kit Plex Opal IHC 6-plex	Akoya	NEL821001KT	520 e 620 non sbiancano, usate nelle Figure 1, 2 e 4
Reagente per la colorazione Kit Opal IHC 780	Akoya	FP1501001KT	Utilizzato nella Figura 4
Forno Tool	Millipore Sigma	Z683329	O simili, si può fare anche su autostainer
Anticorpi Pancitocheratina	Abcam	ab9377	Utilizzato nella Figura 4 al minuto 1:50
Reagent PBS (opzionale)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	Akoya		Imaging multispettrale a vetrata intera con unmixing spettrale integrato nel software
Reagent ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	O supporti di montaggio acquosi simili
Anticorpi ProSP-C n-terminale (ProSPC)	Bioreagenti delle Sette Colline	WRAB-9337	Utilizzato nella Figura 4 al 1:250
Antibody RAGE	R& D	MAB1179	Usate nelle Figure 1 e 2 al minuto 1:50
Reagente Buffer di reazione	Roche	NC1895692	Per l'uso con l'autotintore Ventana
Anticorpi SARS-CoV-2-N	Segnalazione cellulare	68344	Utilizzato nella Figura 2 al 1:1000
Lamelle TOMO Adhesion CC Braci del microscopio WH	Avantik	SKUSL6519-1	Se l'aderenza tissutale è preoccupante
Instrument Ventana Discovery Ultra	Roche		Viene chiamato "Autostainer 2" nel testo. Assicurarsi che tutti i reagenti associati siano disponibili anche tra cui scatole per la colorazione e soluzioni sfuse.
Tampone di lavaggio reagente	Leica Biosystems	AR9590	Per l'uso con autocoloratore Leica Bond
Reagente Acqua	Fisher Scientific	15-230-147	La DI è la migliore, non il millipore
Bagno d'acqua Tool	Leica Biosystems	140607020C1	O simili