Method Article

Separazione e caratterizzazione differenziale delle vescicole extracellulari microbiche intestinali in ratti sensibili al sale in condizioni di dieta ad alto contenuto di sale

DOI:

10.3791/68279

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Pathology Department, Suining Central Hospital, 3School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy, Affiliated Sport Hospital of CDSU, 5Department of Neck, Shoulder, Waist, and Leg Pain, Sichuan Province Orthopedic Hospital, 6Neijiang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descrive l'isolamento di vescicole extracellulari microbiche intestinali da ratti sensibili al sale alimentati con HSD utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità. Le vescicole extracellulari sono state caratterizzate mediante tracciamento di nanoparticelle, TEM, saggi LPS/BCA e sequenziamento di rRNA 16S per analizzare le dimensioni, la morfologia, la composizione e l'origine del microbiota.

Abstract

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Un'elevata assunzione di sale è un importante fattore di rischio per l'ipertensione e il suo meccanismo sottostante può essere strettamente legato alle vescicole extracellulari (EV) secrete dal microbiota intestinale. Queste vescicole extracellulari, prodotte dal microbiota intestinale, trasportano vari componenti bioattivi che possono svolgere un ruolo cruciale nello sviluppo dell'ipertensione indotta da una dieta ricca di sale (HSD). Per studiare questo meccanismo, abbiamo sviluppato un metodo di estrazione efficiente basato sulla centrifugazione in gradiente di densità per isolare le vescicole extracellulari dal microbiota intestinale di ratti sensibili al sale alimentati con un HSD. Attraverso l'analisi delle dimensioni delle particelle, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e il rilevamento dei lipopolisaccaridi (LPS), abbiamo identificato la distribuzione a gradiente delle vescicole extracellulari del microbiota intestinale e abbiamo ottenuto un'estrazione precisa. Inoltre, il sequenziamento genico dell'rRNA 16S è stato impiegato per analizzare l'origine e le differenze di composizione delle vescicole extracellulari tra i gruppi normali e HSD, rivelando l'impatto di un'elevata assunzione di sale sulle caratteristiche genetiche delle vescicole extracellulari del microbiota intestinale. Questo studio fornisce strumenti preziosi e approfondimenti scientifici sui meccanismi del microbiota intestinale alla base dell'ipertensione indotta da sali e offre nuove prospettive per la prevenzione e il trattamento delle malattie correlate.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il microbiota intestinale, noto anche come microflora del microbiota intestinale o microecologia intestinale, è un complesso di decine di migliaia di microrganismi situati nel tratto gastrointestinale biologico e svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute umana1. Negli ultimi anni, con ulteriori ricerche, è stato scoperto che il microbiota intestinale può produrre vescicole extracellulari (EV)2. Le vescicole extracellulari sono piccole vescicole rilasciate dalle cellule, che trasportano varie molecole nella cellula, come proteine, acidi nucleici e lipidi 3,4. Possono interagire con altri microbi5, cellule epiteliali intestinali e persino tessuti e organi distanti6, influenzando così la salute del corpo umano 7,8. Esiste uno stretto legame tra le vescicole extracellulari prodotte da questi microbioti intestinali e la dieta9.

Le vescicole extracellulari prodotte dal microbiota intestinale possono essere agenti significativi attraverso i quali una dieta ricca di sale (HSD) influisce sulla salute del corpo. L'HSD non solo interrompe direttamente l'equilibrio del microbiota intestinale10, portando a una significativa riduzione del numero di batteri benefici (come il Lactobacillus)11, ma promuove anche la proliferazione di batteri nocivi (come i Bacteroides, ecc.)12. Questo squilibrio riduce la funzione della barriera intestinale e aumenta il rischio di infiammazione intestinale. Inoltre, un HSD influisce ulteriormente sull'equilibrio acido-base e sull'assorbimento dei nutrienti nell'intestino modificando le attività metaboliche13 del microbiota intestinale, come la riduzione della produzione di acidi grassi a catena corta14,15 con molteplici funzioni fisiologiche.

Questi cambiamenti non solo hanno un impatto sulla salute intestinale, ma possono anche regolare indirettamente la produzione e il rilascio di vescicole extracellulari e alterare la composizione e la funzione delle vescicole extracellulari. L'ambiente ad alto contenuto di sale può influenzare le normali funzioni fisiologiche delle cellule intestinali, compreso il rilascio e il trasporto di vescicole extracellulari, disturbando così il ruolo delle vescicole extracellulari nella trasmissione delle informazioni intercellulari e nella regolazione immunitaria. Allo stesso tempo, l'infiammazione intestinale può promuovere una varietà di vescicole extracellulari con funzioni speciali16 e diffondersi a tutto il corpo attraverso l'asse intestino-organo e altri modi17,18, che è strettamente correlato all'insorgenza e allo sviluppo di ipertensione19,20, malattie cardiovascolari21 e cerebrovascolari22,23, obesità24,25, diabete26 e altre malattie croniche.

Pertanto, l'obiettivo generale di questo studio era quello di sviluppare un metodo efficiente e affidabile per estrarre le vescicole extracellulari dal microbiota intestinale di ratti sensibili al sale alimentati con HSD e di studiare sistematicamente le loro proprietà fisiche, composizione e funzioni. A causa delle caratteristiche del significativo aumento della pressione sanguigna dopo una dieta ricca di sale, sono stati selezionati ratti sensibili al sale che hanno rivelato l'effetto dell'HSD sul microbiota intestinale EV costruendo un metodo di estrazione efficiente. Il metodo si basava sulla centrifugazione in gradiente di densità e combinava varie tecniche di identificazione dinamica come il rilevamento delle dimensioni delle particelle, la misurazione LPS/BCA, la microscopia elettronica a trasmissione e l'analisi proteomica. Il protocollo mira a rivelare gli effetti dell'HSD sul microbiota intestinale EV e i suoi meccanismi nelle malattie cardiovascolari. Con la sua elevata efficienza, riproducibilità e ampia applicabilità, questo approccio non solo fornisce uno strumento importante per esplorare il meccanismo delle vescicole extracellulari del microbiota intestinale nell'ipertensione indotta da sale, ma getta anche le basi teoriche per lo sviluppo di strategie di intervento sulla malattia basate sulle vescicole extracellulari. Attraverso questo studio, speriamo di aprire nuove strade per la prevenzione e il trattamento delle malattie cardiovascolari, come l'ipertensione27,28.

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Protocol

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Questo studio sperimentale sugli animali è conforme alle linee guida etiche pertinenti e agli standard internazionali. Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per il benessere e l'etica degli animali da laboratorio dell'Università di Medicina Cinese di Chengdu (istituto: Università di Medicina Cinese di Chengdu; numero di protocollo: 2018-21).

1. Preparazione degli animali e regime dietetico

  1. Acclimatare ratti maschi Dahl sensibili al sale di 6 settimane, peso corporeo 180-200 g, allevandoli al 50% ± al 10% di umidità; ciclo di luce 12 h / 12 h; 20,0 ± 2,0 °C per 1 settimana in condizioni specifiche prive di agenti patogeni.
  2. Successivamente, dividere i ratti in parti uguali in due gruppi (n = 6). Fornire a ciascun gruppo una dieta diversa che duri 6 settimane: una dieta salina normale (NSD) con lo 0,5% di cloruro di sodio e una HSD con l'8% di cloruro di sodio, che è comunemente usata negli studi pubblicati 29,30,31. I topi hanno avuto accesso illimitato a cibo e acqua durante lo studio.

2. Monitoraggio della pressione arteriosa

NOTA: La pletismografia del bracciale della coda è stata utilizzata come metodo non invasivo per la misurazione della pressione sanguigna e la registrazione della pressione volumetrica (VPR) è stata utilizzata quando la pressione sanguigna è stata misurata dal volume del sangue della coda.

  1. Metti i ratti singolarmente in piccole gabbie con segatura, riscaldati per 10 minuti a circa 37 °C e mettili in un sistema di ritenuta per roditori personalizzato con naso regolabile e porta per l'ingresso degli animali. Metti i ratti su un termoforo in posizione prona per mantenere la loro temperatura corporea a 37 °C.
  2. Collegare il sensore VPR alla parte inferiore della coda e impostare almeno 10 cicli di adattamento per stabilizzare il BP28.
    1. Riempi il bracciale gonfiabile sulla radice della coda e posiziona il sensore pletismografico (o sensore fotoelettrico) sotto. Gonfiare lentamente fino a superare la pressione sistolica (di solito 200 mmHg) e poi rilasciare lentamente. Lo strumento rileva automaticamente il valore della pressione della scomparsa dell'onda del polso (pressione arteriosa sistolica) e del recupero (pressione arteriosa diastolica). Misura 3-5 volte consecutive e prendi il valore medio.
  3. Addestrare tutti i ratti ad adattarsi alla procedura di contenzione ed eseguire questo studio in un laboratorio tranquillo intorno alle 9 del mattino per ridurre al minimo gli effetti della variazione circadiana.
  4. Misurare la pressione arteriosa sistolica (SBP) e la pressione arteriosa diastolica (DBP) a giorni alterni prima del sacrificio. Stima della pressione arteriosa media (MAP) da SBP e DBP
    MAPPA = (SBP + 2 DBP)/3

3. Estrazione di veicoli elettrici

  1. Raccolta campioni
    1. Immergi un batuffolo di cotone sterile in alcol al 75% e usalo per stimolare l'ano del ratto. La stimolazione aveva lo scopo di favorire la peristalsi intestinale e rilassare lo sfintere anale, favorendo così la defecazione. Dopo che le feci sono state espulse, raccoglierle con una pinza sterile in contenitori sterili di dimensioni adeguate e conservarle immediatamente a -80 °C.
  2. Preparazione del campione
    1. Usando un cucchiaio, trasferisci 5 g di feci in una provetta da centrifuga da 50 ml pre-pesata. Aggiungere 50 mL di PBS preriscaldato a 37 °C privo di endotossine (concentrazione massima del campione del 10%) nella provetta e ruotare per 30 minuti. Raffreddare la centrifuga ad alta velocità a 4 °C.
    2. Centrifugare a 8.000 x g per 15 minuti dopo aver posizionato i campioni simmetricamente per consentire alla centrifuga di equilibrarsi. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga sterile.
    3. Centrifugare nuovamente a 8.000 x g per 15 min. Aspirare il surnatante e utilizzarlo per ulteriori analisi.
  3. Preparazione dell'estratto grezzo
    1. Utilizzare un'unità filtro sterile da 0,22 μm. Posizionare l'unità filtro sul ghiaccio e tenere saldamente la pompa del vuoto. Trasferire il surnatante ottenuto sulla parte superiore del filtro. Accendere la pompa a vuoto per raccogliere i campioni filtrati.
    2. Trasferire il filtrato in un filtro centrifugo (10 kDa, 15 mL), centrifugare a 4 °C, 3.000 x g per 30 minuti e concentrare il campione ad almeno 1400 μL.
    3. Raccogliere il campione concentrato e, se necessario, diluirlo a 1400 μl utilizzando PBS preraffreddato privo di endotossine. Conservare il campione in ghiaccio subito dopo la diluizione.
      NOTA: L'estratto grezzo può essere utilizzato immediatamente o conservato a -80 °C per diversi mesi.
  4. Separazione delle vescicole extracellulari
    1. Preparare il buffer sfumatura A e il buffer sfumatura B come descritto di seguito. Preparare il tampone con un giorno di anticipo, poiché il composto impiega diverse ore per dissolversi completamente. Il tampone preparato può essere conservato a 4 °C per 6 mesi.
      1. Preparazione del tampone gradiente A: Sciogliere 0,25 M di saccarosio, 6 mM di EDTA e 60 mM di Tris in 800 mL di acqua priva di endotossine mediante agitazione magnetica, con il pH regolato a 7,4 utilizzando acido cloridrico. Diluire a 1 L con acqua priva di endotossine. Utilizzare un filtro per flaconi da 0,22 μm per filtrare il tampone.
      2. Preparazione del tampone gradiente B: Sciogliere 0,25 M di saccarosio, 1 mM di EDTA e 10 mM di Tris in 800 mL di acqua priva di endotossine mediante agitazione magnetica, con pH regolato a 7,4 con acido cloridrico. Diluito a 1 L con acqua priva di endotossine. Utilizzare un filtro per flaconi da 0,22 μm per filtrare il tampone.
    2. Mescolare 1 volume di tampone gradiente A e 5 volumi di terreno gradiente di densità (il mezzo è una soluzione di iodixanolo al 60%) per preparare la soluzione di lavoro.
    3. Preparazione della soluzione di iodixanolo (10%, 20%, 40%): per preparare una soluzione di iodixanolo al 10%, miscelare 1 unità di soluzione di lavoro e 4 unità di tampone B; per una soluzione di iodixanolo al 20%, miscelare 2 unità di soluzione di lavoro e 3 unità di tampone B; per una soluzione di iodixanolo al 40%, mescolare 4 unità di soluzione di lavoro e 1 unità di tampone B. Preparare ogni soluzione fresca e conservare in ghiaccio.
      NOTA: Per ogni esperimento devono essere preparate nuove soluzioni funzionanti e può essere preparato un ulteriore 10% di volume di soluzioni per tenere conto dell'errore sperimentale.
    4. Miscelare la soluzione preparata al punto 3.3.3 con 7 mL di terreno a gradiente di densità per ottenere una soluzione di iodixanolo al 50%.
    5. Per preparare un gradiente di densità, aggiungere la soluzione di blu di tripano alla soluzione al 40% e alla soluzione di iodixanolo al 10% (wt/vol) per fornire un contorno chiaro tra gli strati distinti.
    6. Trasferire 8 mL di soluzione di iodixanolo al 50% sul fondo della provetta da centrifuga in polipropilene a parete sottile. Inclinare la provetta a 70° e trasferire 8 mL di soluzione di iodixanolo al 40% sulla superficie del liquido. Aggiungere 8 mL di soluzione di iodixanolo al 20%, quindi 7 mL di soluzione di iodixanolo al 10% e infine 2 mL di PBS privo di endotossine.
      NOTA: La preparazione di un gradiente di densità richiede pratica. La qualità del gradiente di densità ha un grande impatto sui risultati sperimentali. Non posizionare il tubo in posizione verticale tra le diverse fasi del processo di aggiunta, poiché ciò influisce negativamente sulla qualità del gradiente di densità.
    7. Preraffreddare la centrifuga in anticipo e posizionare il gradiente di densità preparato nell'ultracentrifuga. Parametri di input per l'avvio, valori dei parametri: 100.000 x g, 20 h, 10 °C.
    8. Per la separazione manuale della densità del gradiente, prelevare lentamente 2 mL della soluzione dal centro della superficie del sistema contenente un totale di 34 mL di liquido. Ogni 2 ml è un gradiente, dividendo così la soluzione del gradiente di densità in 17 gradienti.
    9. Trasferire le frazioni di densità in una provetta sterile utilizzando una pipetta e posizionarle immediatamente sul ghiaccio. Clamp la provetta da centrifuga tra il pollice e l'indice per assicurarsi che rimanga in posizione verticale.
  5. Recupero dei veicoli elettrici
    1. Utilizzando un sistema di estrazione delle vescicole extracellulari completamente automatizzato che applica l'oscillazione a pressione negativa attraverso un sistema di oscillazione ultrasonica a doppio accoppiamento sul chip di ultrafiltrazione, rimuovere le impurità dell'acido nucleico e delle proteine nel campione attraverso il nanoporo e intercettare le vescicole extracellulari, portando all'arricchimento e alla purificazione delle vescicole extracellulari.
      1. Rimuovere il filtrato al punto 3.4.7 e aggiungerlo al chip di ultrafiltrazione.
      2. Far funzionare lo strumento secondo le istruzioni dello strumento e raccogliere il filtrato filtrato, ovvero la soluzione arricchita con esosomi. Il processo principale è illustrato nella Figura 1.

4. Identificazione delle vescicole extracellulari

  1. Rilevamento delle dimensioni e della concentrazione delle particelle
    1. Valutare la distribuzione dimensionale e il potenziale zeta utilizzando un contatore nanocoulometrico basato sul rilevamento di impulsi resistivi (RPS). Per questo esperimento selezionare chip nanopore con un intervallo di misurazione compreso tra 60 e 200 nm. Inoltre, valutare la distribuzione granulometrica e il potenziale zeta delle vescicole extracellulari utilizzando un contatore di nanolibrerie.
      1. Prelevare una quantità appropriata di soluzione di EVs e diluirla in (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. Diverse diluizioni di soluzioni EV sono state posizionate sullo strumento per i test.
      3. Il multiplo di diluizione con una migliore stabilità è stato selezionato e testato nuovamente per ottenere dati più accurati.
  2. Dosaggio LPS e BCA
    1. Dosaggio BCA: Lisi delle vescicole extracellulari utilizzando il tampone RIPA e quindi separare le proteine. Determinare il contenuto proteico delle EV utilizzando il kit per la determinazione della concentrazione proteica BCA.
    2. Saggio LPS: Utilizzando il kit di rilevamento delle endotossine, aggiungere campioni, un rilevatore di endotossine e cromogenico secondo i passaggi del kit. Misurare l'assorbanza a 545 nm e calcolare l'espressione LPS delle vescicole esterne secondo la curva standard.
  3. Valutazione TEM: per la colorazione negativa e l'analisi TEM, applicare i campioni su una griglia di rame luminescente rivestita con un film di carbonio continuo e colorare con formiato di uranile allo 0,75%. Per la crio-EM, assorbire i veicoli elettrici in una griglia di carbonio EM da 300 mesh con una superficie idrofila e congelare in azoto liquido. Osserva e analizza le griglie utilizzando il Cryo-TEM e registra le immagini a 22.000 ingrandimenti32.
  4. Caratterizzazione delle proteine: Lisi delle vescicole extracellulari utilizzando il tampone RIPA e quindi separare le proteine. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA, separare quantità uguali di proteine da ciascun campione mediante SDS-PAGE e colorare con la soluzione di colorante blu Coomassie dopo l'elettroforesi per visualizzare i profili proteici33,34.
  5. Sequenziamento e analisi S: Estrarre il DNA genomico dai campioni fecali utilizzando un kit di estrazione del DNA fecale. Valutare l'integrità e la concentrazione del DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio e spettrofotometro. Amplificare la regione V3 - V4 del gene 16S rRNA con primer universali, purificare i prodotti della PCR, quantificarli e sequenziarli sulla piattaforma Illumina. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando la pipeline QIIME235.
    1. Classificare le varianti di sequenza di ampliconi (ASV) utilizzando DADA2 e confrontarle con il database Silva utilizzando l'algoritmo VSEARCH. Utilizza l'analisi della diversità α per valutare la ricchezza e la diversità delle specie all'interno dei campioni, utilizzando principalmente indici come l'indice di Shannon e l'indice Chao1. L'analisi della diversità β confronta la composizione della comunità microbica tra i campioni ed è solitamente visualizzata mediante analisi delle coordinate principali (PCoA). Utilizzare metodi di analisi differenziale, come l'analisi discriminante lineare delle dimensioni dell'effetto (LEfSe) e l'analisi del grafico del vulcano, per identificare i taxa microbici con condizioni significativamente diverse o tra i gruppi.

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Results

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Le concentrazioni di EVs sono state determinate in diverse frazioni (Figura 2A). I risultati sperimentali hanno mostrato che la concentrazione delle EV mostrava un tipico pattern di distribuzione normale in una serie di soluzioni a gradiente di densità (Figura 2B). In particolare, nella frazione 9, la concentrazione di EV ha raggiunto il suo punto più alto (3,85 x 109), suggerendo che la frazione di distribuzione principale dei EV potrebbe essere 9

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Discussion

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In questo studio, ci siamo concentrati sulle vescicole extracellulari del microbiota intestinale nei ratti sensibili al sale sottoposti a HSD e abbiamo raggiunto una serie di risultati chiave. In primo luogo, è stato costruito con successo un metodo di estrazione efficiente basato sulla centrifugazione in gradiente di densità per isolare le vescicole extracellulari dal microbiota intestinale di ratto sensibile al sale su HSD e la maggior parte dei componenti non EV sono stati isolati att...

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82205240), dalla Natural Science Foundation della provincia del Sichuan (2025ZNSFSC1836) e dal Clinical Basic Project dell'Ospedale ortopedico provinciale del Sichuan (PY202414).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Essential Supplies
Filtro centrifugo (10nkDa 2 mL)MilliporeUFC903096
Centrifuga Tude (50 mL)BKMAN20220404
Z30815SCA
Sistema di filtrazione sottovuotoBiosharp24902581
Kit per il dosaggio dell'endotossina LAL strong
Chromogenic LALBeyotime022124240705
Coomassie Blue Soluzione di colorazione rapidaBeyotimeZ972241010
EDTADamas-betaP3117308
Kit per il dosaggio delle proteine BCA potenziatoBeyotimeA006241112
EtanoloKESH
HCl
OptiPrep (60% wt/vol, iodixanol)Serumwerk00124
PBSLabshark130114005
acido fosfotungsticoRUIXIN
SaccarosioDamas-betaP1917057
Tris (VWR)Damas-betaP3061764
Soluzione colorante blu di tripano (0,4%)BeyotimeBD07242904
Equipment
Absorbance Microplate ReaderSpectraMaxABP01690
BiomicroscopeMoticBA210Digital
Desk centrifugeCenceCHT210R
Microcentrifuga da tavolo ad alta velocitàDLABD3024
Rotore in alluminio ad angolo fisso + Cence
Bilancia elettronica ad alta precisioneSKRBN-200
Armadio a flusso laminareNantong Hunan Scientific Instrument Co., Ltd.SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti Girevole a secchiello oscillante + SW 32.1 Ti Secchio a rotoreBECKMAN COULTER
Microscopio elettronico a trasmissioneJEOLJEM-1400FLASH
Rotatore
UltracentrifugaBECKMAN COULTEROptima XE-100
Sistema ad acqua ultrapuraULPHWUPR-II-15TNZ
Pompa a vuoto multifunzione per acqua-cieculazioneQiang QiangSHZ-D(III)
Centrifuga Tudes BECKMAN COULTER a tazza centrifuga da 500 mLper provette

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