Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

Summary

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di come creare campioni per il tracciamento a singola proteina in bistrati lipidici supportati da solidi. Spiega anche un microscopio a fluorescenza semplice con sensibilità a singola molecola e un frame rate elevato. Infine, delineiamo la procedura per estrarre traiettorie a singola proteina.

Abstract

L'osservazione diretta è un metodo fondamentale per la scoperta e la comprensione scientifica. L'imaging a fluorescenza singola a singola molecola in time-lapse consente l'osservazione delle singole proteine mentre si muovono e interagiscono con l'ambiente circostante, rendendo visibili stati che normalmente sarebbero nascosti nelle misurazioni dell'ensemble. Il tracciamento a singola proteina è particolarmente adatto per lo studio delle proteine di membrana, dove la sua natura bidimensionale consente un'imaging rapido e a campo ampio con sensibilità al singolo fluoroforo. L'uso di bilayer lipidici artificiali che imitano membrane dove si trovano proteine transmembrana o periferiche (come membrane plasmatiche o membrane di organelli intracellulari di vari tipi cellulari) permette di misurare interazioni specifiche in ambienti quasi nativi. Permette inoltre l'aggiunta graduale di complessità, un componente alla volta, sopprimendo al contempo l'interferenza di fondo dovuta alla fluorescenza e alla diffusione Raman. Aggiungendo il controllo della temperatura, diventa possibile determinare anche le proprietà termodinamiche delle interazioni a singola particella. In questo lavoro, descriviamo un protocollo per la preparazione del campione, la raccolta dati, il tracciamento della fluorescenza a singola molecola e l'analisi delle traiettorie delle proteine di membrana nei bilayer lipidici utilizzando Aquaporin-4. Questo lavoro rappresenta un esempio fondamentale e può essere adattato a diverse proteine e composizioni a due strati.

Introduction

In condizioni biologiche naturali, le proteine di membrana sono circondate da un'estesa rete di interazioni, che include altre proteine di membrana, proteine nei fluidi intracellulari ed extracellulari, vari tipi di lipidi e colesterolo, substrati o ligandi, interazioni con soluzioni e interazioni tra matrici extracellulari e intracellulari. Un approccio biofisico classico per comprendere meglio le interazioni specifiche e collettive parte da un singolo componente, introducendo gradualmente ulteriori componenti uno alla volta fino a quando la complessità riflette l'ambiente nativo: un approccio "dividi e conquista" della biofisica. Un metodo moderno su scala molecolare per studiare queste interazioni è attraverso l'osservazione diretta tramite immagini di fluorescenza singola a time-lapse per tracciare le singole proteine mentre si muovono e interagiscono con il loro ambiente. In questo articolo descriviamo i passaggi fondamentali di questo approccio, inclusa la formazione di bistrati lipidici su coperture di quarzo e l'inserimento di una grande proteina di membrana in questi bistrati pre-formati in modo adatto all'imaging a singola proteina. A questo seguirà un protocollo 'da lavoro' per tracciare singole proteine nei bilayer supportati.

Questo articolo descrive come creare bistrati lipidici sostenuti da solidi utilizzando piccole vescicole unilamelari (SUV) che si rompono su coperture di quarzo idrofilo. Le superfici di quarzo sono preparate tramite lavaggio acido o pulizia con ozono ultravioletto (UV). I lipidi utilizzati per creare i SUV dovrebbero, quando possibile, corrispondere alla composizione chimica principale della membrana biologica di interesse (ad esempio, l'acquaporina-4 (AQP4) si trova nella membrana plasmatica degli astrociti e i principali componenti sono POPC (46,4%), POPE (8,5%), PS (5,6%), colesterolo (30%), PI (2,5%) e SM (5,6%)^1,2). Per prevenire l'interazione con il substrato solido, additivi come il polietilenglicole (PEG) innestato su un lipide sollevano il bistrato dalla^{superficie 3,4}. La quantità di ciascun additivo deve essere regolata con attenzione per garantire che la diffusione delle proteine non venga ostacolata, fornendo al contempo un supporto sufficiente per sollevare la membrana dalla superficie del substrato. Gli additivi come i lipidi PEGilati presentano tipicamente due fasi: una 'fase spazzolatura' e una 'fase fungo'. La fase a spazzola si verifica quando il PEG è ad alta concentrazione, facendo sì che il polimero si mantenga eretto per ridurre l'ostacolo sterico. La fase fungo si verifica a basse concentrazioni, quando i polimeri sono sufficientemente separati da esistere come bobine casuali. In generale, la fase a spazzola ostacola la diffusione, ma la fase fungo offre poco supporto. La concentrazione tra le fasi a spazzola e fungo è ottimale, fornendo supporto con un impatto minimo sulla diffusione ^3,4.

Alcune proteine di membrana si inseriscono spontaneamente nelle membrane lipidiche sostenute da solidi, come P450 e citocromo P450^{reduttasi 5}, mentre altre dovranno essere inserite con detergenti, un processo delicato. È necessario un lavaggio accurato per rimuovere questi detersibili, così come qualsiasi proteina non incorporata che possa interferire con il tracciamento delle singole proteine - un processo che sarà descritto in dettaglio. Il focus principale di questo articolo è la preparazione di un campione per il tracciamento a singola molecola (SMT) utilizzando l'imaging a fluorescenza in time-lapse. Questo richiede un obiettivo con alto ingrandimento e apertura numerica (NA) — tipicamente un obiettivo di immersione in olio di 100x e 1,45 NA ^6,7. Richiede inoltre una telecamera veloce e altamente sensibile (EMCCD, CMOS o ICCD) e eccitazione laser. L'eccitazione laser deve coprire un campo visivo sufficientemente ampio per misurare lunghe traiettorie proteiche, cosa che spesso viene realizzata utilizzando la riflessione interna totale per creare un campo evanescente di circa 50 μm x 100 μm oppure l'epi-illuminazione con ottica a forma del fascio (Gaussian a top-hat) di circa 80 μm x 80 μm⁸ oppure un foglio ottico altamente inclinato e laminato (HILO) con un campo simile a quello del TIRF. La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) ha il vantaggio di ridurre il segnale di fondo. Di seguito è presentato un semplice e relativamente economico progetto di microscopio TIRF. Aggiungendo controlli di temperatura, è possibile misurare diverse proprietà termodinamiche come entalpia, entropia ed energia libera^{di Gibbs 9}. La tecnica richiede anche la marcatura a fluorescenza della proteina di membrana a un grado di marcatura tale da garantire che la maggior parte delle proteine di membrana porti un tag fluorescente.

La proteina transmembrana di interesse in questo articolo è AQP4. AQP4 è un canale d'acqua polarizzato nelle estremità degli astrociti e in altre aree della vascolatura del sistema nervoso^{centrale 10}. Può trasportare fino a 3 miliardi di molecole d'acqua al secondo ed è coinvolta nell'omeostasi dell'acqua, nella migrazione cellulare, nell'edema cerebrale, nell'apprendimento e nella formazione della memoria tramite plasticità^{sinaptica 11}. La disregolazione della funzione di AQP4 è stata collegata a varie condizioni neurologiche, tra cui edema cerebrale, neuromielite ottica ed^epilessia 12,13,14,15. AQP4 è una proteina da 32-37 kD, a seconda della sua isoforma, e ha una struttura quaternaria tetramerica con otto domini di membrana idrofobici collegati da anelli di unizione, un dominio N-terminale intracellulare e un grande dominio^{C-terminale intracellulare 16}. Ci sono due isoforme principali di AQP4, M1 e M23; La differenza deriva dall'inizio al residuo di metionina 1 o al residuo di metionina 23. Le ricerche hanno dimostrato che l'isoforma M1 può formare diadi o triadi con se stessa, a seconda del suo stato di^{palmitoilazione 9}. L'isoforma M23 si forma in grandi aggregati proteici noti come Array Ortogonali di Particelle (OAP). Quando co-espressa, l'isoforma M1 limita la crescita OAP formando un rivestimento proteico periferico attorno al^{suo esterno} 17,18,19. La dinamica dell'aggregazione OAP può essere un fattore chiave nel modulare la permeabilità all'acqua e l'omeostasi nel cervello. In questo articolo descriviamo i passaggi necessari per tracciare singoli AQP4 in una membrana e osservare le interazioni proteina-proteina singole.

Protocol

1. Preparazione di piccole vescicole unilamelari

1. Tira fuori le soluzioni di brodo lipidico dal congelatore e lasciale raggiungere la temperatura ambiente.
2. Prendi una fiaschetta pulita da 10 mL dal forno e lasciala raffreddare a temperatura ambiente.
3. Aggiungi 900 μL di cloroformio di grado spettroscopico e 100 μL di metanolo di grado spettroscopico nella fiaschetta fredda a fondo rotondo, poi aggiungi le quantità appropriate di ciascun lipido nella miscela. Fai roteare la fiaschetta per assicurarti che i lipidi siano ben mescolati.
   NOTA: Altri autori usano rapporti diversi di cloroformio:metanolo, ma abbiamo trovato che il miglior rapporto per la formazione di torti lipidici uniformi era 9:1.
   Un foglio di calcolo per calcolare le quantità corrette di lipidi è fornito nel Supplemental File 1. Se si preparano i lipidi per verificare la formazione dei due strati lipidici sulla superficie del substrato, si utilizza un lipide marcato fluorescente.
4. Posizionare un connettore per la distillazione a vuoto sopra la fiaschetta a fondo rotondo, come mostrato nella Figura 1, e collegarlo alla linea dell'azoto (apparecchiature di essiccazione).
   NOTA: Usa N₂(g) purificato e passalo attraverso un filtro da 0,22 μm prima di collegarlo all'apparecchiature di asciugatura.
5. Accendi l'N₂(g) e regola la pressione in modo che il flusso sia tale che si senta appena sul dorso della mano.
   NOTA: Bagnare il dorso della mano può aiutare a percepire l'evaporazione.
6. Lasciare asciugare il campione sotto un flusso di N₂(g) per 2,5-3 ore, controllando periodicamente che l'azoto continui a fluire. Il campione probabilmente apparirà asciutto entro la prima mezz'ora; tuttavia, continua a far fluire azoto per altre 2-2,5 ore per rimuovere eventuali solventi residui.
   NOTA: Il campione può anche essere asciugato durante la notte.
7. Aggiungi 1 mL di tampone per ogni 5,0 μmol di lipidi totali nella fiaschetta a fondo tondo.
   NOTA: Il buffer utilizzato in questo studio era composto da 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} e 140 mM NaCl; questo è lo stesso buffer utilizzato durante tutta la preparazione del campione.
8. Metti un tappo di vetro sulla fiaschetta e avvolgila con pellicola di paraffina.
9. Posizionare la fiaschetta in una pinza su un supporto ad anello e immergere il fondo della fiaschetta in una vasca di un sonicatore impostato a 60 °C. Lasciare che la fiaschetta incubi per 1 ora, ruotando delicatamente ogni 15 minuti per creare liposomi multi-lamellari, che appaiono come una soluzione opaca senza lipidi attaccati alla fiaschetta.
10. Dopo l'incubazione di 1 ora, accendi il sonicatore (~35 kHz) e imposta l'ampiezza al massimo. Poi, muovi la fiaschetta nella vasca per trovare la posizione in cui si verifica la maggiore agitazione, così che la soluzione sbucchi e spruzzi all'interno della fiaschetta. Sonicate per 30 minuti, cercando un passaggio da opaco a trasparente e leggermente opalescente.
11. Rimuovere la soluzione lipidica dalla fiaschetta e metterla in un tubo per microcentrifuga, poi centrifugare a 100.000 × g per 1 ora a 4 °C. Rimuovi il surnatante dal tubo della microcentrifuga.
    NOTA: Un piccolo pellet può formarsi sul fondo del tubo. Se il pellet è grande, scartalo e ripeti il processo.
12. Usa gli SUV dopo la centrifugazione, conservali a 4 °C per una settimana, oppure manteni a -80 °C con un po' di trealosio.
    NOTA: La quantità raccomandata di trealosio è 1 mg per mL di soluzione lipidica. Per risultati ottimali, i nuovi SUV possono essere prodotti ogni settimana e conservati in frigorifero.
    NOTA: Questo è solo un metodo per preparare i SUV. Oltre ai SUV, possono essere prodotte vescicole unilamelari piccole, medie e grandi utilizzando linfosomi unilamelari giganti o tramite elettroformazione 20,21,22,23.

2. Marcatura delle proteine

NOTA: La marcatura delle proteine con sonde fluorescenti utilizzando vari coniugati, come esteri e maleimidi NHS, è ben documentata e ben compresa. Tuttavia, il grado di marcatura (DOL) è particolarmente importante nel tracciamento di una singola proteina. In questo studio, è stato essenziale determinare quale percentuale di proteine transmembrana fosse stata marcata e la distribuzione dei fluorofori su ciascun tetramero AQP4.

1. Inserire un tubo per dialisi in un becher contenente 0,1 M di fosfato tampone a pH 8,3 che è stato fatto passare attraverso un filtro da 0,22 μm. Poi, lasciala riposare nel buffer tutta la notte in posizione invertita, permettendo alla membrana di condizionare.
2. Il giorno seguente, sostituire il tampone all'interno del tubo di dialisi con la soluzione proteica.
   NOTA: Il volume della soluzione proteica dovrebbe essere entro 20-250 μL. Dovrebbe esserci ~1-5 mg di proteine disciolte nella soluzione.
3. Una volta inserita la proteina nel tubo di dialisi, lasciala riposare invertita per tutta la notte nel tampone fosfato da 0,1 M.
4. Dopo la dialisi, trasferire la proteina in un tubo microcentrifuga.
5. Prepara un nuovo tubo per la dialisi ripetendo il passo 2.1.
6. Prepara il colorante NHS applicando alcuni granelli (3-4) su un piccolo pezzo di carta da pesare, poi trasferiscilo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e scioglilo in 100 μL di DSMO. Segue con due diluizioni da 1 mL da 10 volte in DMSO, utilizzando la diluizione finale per determinare le concentrazioni di ciascun campione tramite spettroscopia UV-vis. Per ottenere un DOL medio di 2-3, aggiungere un eccesso molare triplicatore di colorante reattivo alla soluzione proteica mentre si agita delicatamente.
   NOTA: Uno spettrometro UV-vis standard sarà sufficiente per questo scopo, anche se uno spettrometro a piccolo volume è vantaggioso a causa della dimensione del campione.
7. Aggiungi il colorante reattivo al tubo della microcentrifuga contenente la proteina in volumi uguali. Una volta aggiunto il colorante reattivo e le proteine, nutate per almeno 8 ore.
8. Dopo la nutazione, trasferire la proteina marcata nel tubo di dialisi preparato nel passo 2.5 e inserirla in un becher contenente tampone di fosfato fresco. Metti una barra di agitazione nel buffer e lascia che si muova delicatamente per 6 ore, seguito da un cambio del buffer e altre 6 ore di dialisi.
9. Dopo i due scambi di tamponi, si posiziona il tubo per la dialisi contenente la proteina marcata in un becher pulito contenente il tampone finale funzionante.
   NOTA: Il buffer operativo finale utilizzato in questo studio consisteva in 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} e 140 mM NaCl a pH 7,4.
10. Dopo la dialisi, misurare il DOL utilizzando uno spettrometro UV-vis.
    NOTA: È importante seguire i metodi standard per misurare il DOL. Di seguito è riportata un'equazione per il calcolo.
    (1)
    Dove l'assorbanza misurata al picco del colorante è e il picco proteico a 280 nm è . Il coefficiente di estinzione della proteina è (calcolato dal peso molecolare della proteina), mentre e sono forniti dal produttore del colorante.

3. Preparazione di coperture di quarzo di diametro 25 mm

NOTA: Di seguito sono riportati due metodi diversi:

1. Lavaggio acido
   NOTA: Esistono diverse procedure di lavaggio acido pubblicate, tra cui piranha e base etch. Abbiamo riscontrato che la procedura qui sotto fornisce una superficie estremamente pulita e idrofila senza incisione, il che è preferibile per studi su singola molecola utilizzando immagini a fluorescenza.
   1. Il metodo Acid Wash richiede una cappa elettrica durante il riscaldamento della soluzione e DPI (occhiali, camice da laboratorio, guanti). Una bottiglia di bicarbonato di sodio dovrebbe essere disponibile nel cappuccio in caso di fuoriuscimenti.
   2. Inserire le coperture in un becher e riempirle con acqua nanopura, perossido di idrogeno al 30% e acido nitrico concentrato in parti uguali per volume (soluzione 1:1:1).
   3. Riscalda le coperture in questa soluzione per 30 minuti finché la soluzione non inizia a bollire.
   4. Controlla la soluzione e mescola girandola delicatamente ogni 10 minuti per evitare che le coperte si attacchino tra loro. Quando si fa roteare la soluzione, osserva le sbottine che si separano e poi si separano. Una volta separati, rallenta gradualmente per tenerli separati, permettendo alla soluzione bollente di avvolgere le lingue.
      NOTA: La soluzione non dovrebbe essere riscaldata troppo vigorosamente, poiché la reazione produce calore. Regola la piastra riscaldante su una bolla delicata, di solito al minimo. A queste impostazioni, la soluzione rimane a ~70 °C. Si raccomanda anche il perossido di idrogeno fresco.
   5. Dopo 30 minuti o quando la soluzione smette di bollire, lascia raffreddare la soluzione 1:1:1 a temperatura ambiente, poi risciacqua accuratamente le coperture con acqua purificata usando una leggera voluta.
2. UV ozono
   1. Pulisci le coperture di quarzo con n-esano, poi metanolo, usando fazzoletti per lenti.
   2. Inserire le coperture in un detergente UV all'ozono con la superficie da trattare rivolta verso la lampada.
   3. Scorre ossigeno nella camera a 5 psi per 5 minuti; Poi, spegni il flusso di ossigeno.
   4. Poi, accendi le luci UV per 15 minuti e lascia riposare le coperte per almeno 10 minuti per far uscire l'ozono.
   5. Dopo aver utilizzato uno dei due metodi di pulizia, assicurati di usare immediatamente le coperture pulite. Se si usano lappi già puliti, ripeti il processo per rigenerare la superficie.
      NOTA: L'ozonazione UV richiede una circolazione costante per rimuovere l'ozono dall'aria. Il sistema dovrebbe essere posizionato sotto uno snorkel per la manipolazione dell'aria o in una cappa a fumi.

4. Formazione a bistrato e incorporazione di AQP4 in una membrana a due strato

NOTA: Il tampone utilizzato in questo studio consisteva in 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} e 140 mM NaCl al pH 7,4.

1. Metti il copertino appena pulito in un portacampioni da 25 mm usando un tubo obiettivo SM1 da 1/4 di pollice. Successivamente, taglia una guarnizione a doppio strato di parafilm di 8 mm di diametro e posizionala al centro del portacampioni (vedi Figura 3).
2. Applicare una goccia da 50 μL dei SUV al centro della guarnizione da 8 mm, sigillare e poi incubare a 37 °C per 1 ora.
   NOTA: Questo permette ai liposomi di fondersi con la superficie di quarzo idrofilo e di rompersi, formando uno strato bistrato continuo.
   È molto probabile che la quantità di liposomi aggiunti all'area della guarnizione possa variare, e una guarnizione più grande possa richiedere più liposomi per formare uno strato bistrato continuo. Tuttavia, le quantità specificate nel passo 4.2 favoriscono quasi sempre la formazione di un bistrato continuo.
3. Dopo l'incubazione, risciacquare il campione con una pipetta per rimuovere la soluzione. Poi, aggiungi 50 μL di nuovo tampone al bilayer. Poi, ripeti il processo un totale di 10 volte.
   NOTA: È fondamentale che la punta della pipetta non tocchi il bistrato lipidico e che rimanga una soluzione per mantenere il bistrato idratato. Portando la punta in cima alla goccia, vedrai che entra in contatto. Puoi rimuovere la soluzione senza danneggiare il bistrato mantenendo un contatto minimo con la superficie delle gocce. Alla fine, la goccia si inverte e si sposterà verso la guarnizione; Questo è il momento ideale per smettere di rimuovere la soluzione. La luce riflessa dovrebbe cambiare in questo punto e può servire come segnale per fermarsi. Se temi di rimuovere troppa soluzione, abbassa la regolazione della pipetta durante il lavaggio per lasciare una quantità comoda di buffer sopra il bistrato lipidico.
   L'integrità della formazione dei due strati lipidici in queste condizioni può essere valutata in anticipo utilizzando il recupero di fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP). Questo richiede di avere un componente nella miscela lipidica marcato^{fluorescentmente} 6,7,24,25.
4. Dopo aver completato il lavaggio finale, rimuovere nuovamente il tampone e aggiungere un'aliquota di 50 μL della proteina desiderata nel detersivo a temperatura micellare o inferiore. Lascia almeno 1 ora per l'incorporazione proteica a 37 °C.
   NOTA: Il detersivo ammorbidirà delicatamente il bistrato e aiuterà la proteina a incorporarsi nella membrana. In questo protocollo, il detersivo utilizzato era 50 μM di n-Dodecyl-beta-D-tiomalaltoside (DOTM), un detergente non ionico, con la concentrazione proteica di 2 nM.
5. Dopo un'ora, risciacqua il campione con un tampone per rimuovere qualsiasi proteina e detersivo non incorporati.
6. Aggiungere 5 mg di perle di polistirene condizione (Bio-perle) al campione, lascia riposare per almeno 1 ora prima di rimuoverlo. Il campione è quindi pronto per l'imaging (vedi sotto).

5. Additivo antifade

1. Sciogliere 5 mg di Trolox e 80 mg di D-glucosio in 10 mL di tampone (vedi sopra). Scuoti e vortice finché non restano più solidi. Nutate tutta la notte al buio, poi filtrate la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. Prepara una nuova settimana.
2. Sciogliere 6,5 mg di glucosio ossidasi (1650 U) e 8 μL di Catalasi (29.200 U/mL in tampon) in 92 μL di tampon. Mescola delicatamente la soluzione senza vortice, poi centrifuga e trasferisci il soprantantante in un nuovo tubo. Conserva a 4 °C e proteggile dalla luce.
   NOTA: Questa soluzione può essere conservata in frigorifero per diversi mesi; Tuttavia, se si manifesta qualche torbidezza, gettala e prepara una soluzione nuova.
3. Mescolare 99 μL di soluzione da 5,1 con 1 μL dello stadio 5,2 in un nuovo tubo. Dopo il risciacquo finale del campione, aggiungi la soluzione antifade sopra il campione (chiamata soluzione per l'imaging).
   NOTA: Le soluzioni antifade possono alterare le funzioni delle proteine transmembrana; È importante verificare la compatibilità con il sistema.

6. Configurazione e impostazioni del microscopio

NOTA: Per questo studio su singola molecola è stato utilizzato un microscopio TIRF personalizzato. Questa sezione descrive i principali componenti e le tecniche di allineamento delle chiavi per un microscopio a fluorescenza di base adatto per immagini a rapido time-lapse (Figura 4), che è uno strumento affidabile.

1. Usa un laser He:Ne a 633 nm per eccitare i campioni. Il laser passa attraverso un filtro passa-banda e una piastra d'onda da 1/4 per affinare la linea laser e convertire l'eccitazione dalla luce polarizzata linearmente in una luce polarizzata circolare.
   NOTA: La polarizzazione circolare riduce l'effetto dell'orientamento della sonda.
2. Il fascio passa attraverso un obiettivo da 300 mm e un filtro laser a linea da 633 nm, si riflette su uno specchio dicroico passa-lungo da 633 nm ed è focalizzato sul retro di un obiettivo a microscopio a olio da 100x e 1,45 N/A. Allinea il fascio per assicurarti che attraversi senza problemi il centro dell'obiettivo e rimanga dritto all'uscita.
   NOTA: A questo punto, il microscopio è configurato per l'epifluorescenza (epi). Una piccola quantità di latte in polvere può essere aggiunta a una cuvette con il fondo trasparente. La cuvetta viene poi posizionata sull'obiettivo del microscopio con una goccia di olio a immersione tra una goccia e l'altra. Questo ti permette di osservare che il fascio attraversa direttamente l'obiettivo.
3. L'emissione delle proteine marcate fluorescenti passa attraverso lo specchio oggettivo, dicroico, il filtro passa-lungo e un obiettivo da 300 mm, quindi viene immagazzata su una telecamera EMCCD. Utilizzare obiettivi a tubo a lunghezza focale più lunga per ingrandire le immagini sulla fotocamera e migliorare la super-localizzazione, il che è vantaggioso per proteine e aggregati transmembrana a movimento lento. Assicurati di calibrare i pixel della fotocamera in nanometri.
   NOTA: Tuttavia, l'ingrandimento 1x si ottiene con l'obiettivo a tubo specificato dal produttore dell'obiettivo, che aumenta il rapporto segnale-rumore concentrando la fluorescenza su meno pixel. Le lunghezze focali comuni includono obiettivi da 200 mm, 180 mm, 165 mm e 164,5 mm. Raccomandiamo di utilizzare un bersaglio con ingrandimento USAF del 1951. Utilizzando un obiettivo da 300 mm in questa configurazione, veniva misurata una calibrazione dei pixel di 74 nm con un ingrandimento totale di 170x.
4. Controlla la temperatura del campione utilizzando un collare obiettivo e un portacampioni dotato di riscaldatore/raffreddatore^{Peltier 26}.
   NOTA: Mantenere una temperatura stabile è fondamentale per garantire la stabilità termica del microscopio e per consentire misurazioni accurate dipendenti dalla temperatura e la messa a fuoco dello strumento.
5. Gli attuatori piezozologici spostano il campione nelle direzioni XYZ. Una volta che un campione è messo a fuoco, regolare il fascio verso il bordo dell'obiettivo del microscopio ( vedi Figura 4) utilizzando lo stadio collegato allo specchio rotante finale fino a raggiungere un angolo critico. Questo genera un campo di eccitazione evanescente. Il microscopio è ora posizionato in TIRF.
   NOTA: Puoi determinare che il microscopio è in TIRF quando la riflessione posteriore del laser è una linea (non una macchia), e lo sfondo del campione diminuisce di intensità ed allunga.

7. Raccolta dati

NOTA: La telecamera deve essere impostata per una rapida raccolta dei dati.

1. Imposta la velocità di spostamento verticale dei pixel a circa 600 ns e sovraccarichi la tensione di clock verticale (tipicamente +4). Poi, imposta la lettura orizzontale dei pixel alla sua impostazione massima (30 MHz a 16 bit in questo esempio). Regola il guadagno del preamplificatore a 2 e configura l'uscita dell'amplificatore per la moltiplicazione degli elettroni. Infine, imposta il guadagno del moltiplicatore di elettroni al livello più alto.
2. Imposta l'esposizione a 25 ms. A 25 ms di esposizione, assicurati che il frame rate sia leggermente più lungo (25,802 ms sulla fotocamera usata qui).
3. Regola la potenza del laser in modo che il segnale sia chiaramente sopra lo sfondo.
   NOTA: Regolare la potenza del laser può essere impegnativo. Troppo in alto, e la sonda sbianca troppo rapidamente; troppo basso, e il rapporto segnale-rumore rende difficile il tracciamento. Raccomandiamo di impostare la potenza in modo che il segnale superi il sottofondo di 3-5 volte per le particelle con il segnale più debole. La sezione 2 spiega perché la luminosità molecolare mostra una distribuzione.
4. Raccogli abbastanza dati per fornire almeno 1.000 tracce per campione.

8. Analisi di tracciamento

NOTA: Nei nostri laboratori, l'analisi di tracciamento a singola particella viene tipicamente eseguita utilizzando script personalizzati in MATLAB basati sul lavoro di Crocker e Grier e modificati dagli autori ^3,26,27. Di seguito è riportata una descrizione utilizzando ImageJ, un software liberamente disponibile per la comunità di ricerca. Entrambi i metodi producono risultati identici.

1. Ritaglia i set di dati a una dimensione costante e poi correggi lo sfondo usando ImageJ.
   NOTA: Se i dati raccolti sono gli stessi tra i set, non è necessario ritagliare. Questo avviene solitamente solo se la regione di interesse sul sensore della fotocamera si è spostata tra una raccolta di dati e l'altra. Le capacità di ImageJ possono essere notevolmente estese con i plugin. Un'opzione è installare e usare FIJI, che è ImageJ incluso con un set di plugin standard. Tra questi plugin c'è TrackMate, che verrà utilizzato per il protocollo^{qui 28,29}.
   Il sito ImageJ Wiki offre guide guida ed esempi per molti plugin. Include anche video tutorial.
2. All'interno di FIJI, trascina e rilasci il filmato o il file impilato *.tif da analizzare (vedi File Supplementare 2).
3. Inserisci i dettagli della calibrazione dei pixel. Nella scheda Analizza , seleziona Imposta scala e applica la calibrazione pixel-distanza per lo strumento.
4. Salva una copia per tenere traccia di eventuali cambiamenti rispetto all'originale.
5. Sottrai lo sfondo dalla finestra scelta e applicalo alla copia salvata dei dati originali. Nella scheda Processo , scegli Sottrai Background.
   NOTA: Questo sarà ottimizzato in base ai dati. Un buon punto di partenza è usare una "palla rotolante" più grande delle particelle che si stanno immaginando.
6. Nella scheda Plugin , seleziona Tracciamento | Compagno di pista. Questo apre la finestra di dialogo TrackMate , che guida l'utente attraverso il processo di tracciamento.
   NOTA: Una volta completato il tracciamento, è possibile esportare le tracce per ulteriori analisi al di fuori di ImageJ.

9. Elaborazione dei dati

NOTA: Qui viene discusso come elaborare i dati rappresentativi e come calcolare le distribuzioni di dimensioni dei passi per ottenere una costante media di diffusione.

1. Trascina e rilasci la pila di immagini in FIJI; Poi, applica la calibrazione (74 nm/pixel).
2. Sottrai lo sfondo usando la sottrazione della palla rotolante con una larghezza di 5 pixel. Ritaglia il campo in quattro sezioni separate da 11 μm x 11 μm e analizza separatamente.
   NOTA: Questo serve a minimizzare qualsiasi varianza di soglia dovuta al campo di eccitazione durante il tracciamento delle proteine di membrana.
3. Avvia il plugin TrackMate . Verifica che la calibrazione sia applicata ai pixel (vedi File Supplementare 3) e che il tempo copra l'intervallo desiderato.
   1. In TrackMate, si seleziona il Laplaciano di Gauss (LoG) come metodo di rilevamento per le particelle, con un diametro stimato di 350 nm usando il filtro mediano pre-processo. Clicca sul pulsante Anteprima per verificare che le particelle rilevate siano ragionevoli.
      NOTA: Alcune particelle possono essere chiaramente sullo sfondo; Non preoccuparti di questi: verranno eliminati nel prossimo passo.
   2. Quando soddisfatti delle impostazioni di conteggio, elabora il resto della pila, seguito dalla soglia. Usa la soglia automatica o trascina la casella di selezione per regolare la soglia.
   3. Dopo aver scelto come visualizzare le particelle rilevate, seleziona il metodo di tracciamento: Advanced Kalman Tracker per questo dataset, con le seguenti impostazioni: 350 nm per i raggi di ricerca e un gap massimo di 2 fotogrammi.
      NOTA: È anche possibile aggiungere penalità, divisione dei binari e fusione dei binari. Per questo dataset è stato effettuato solo il tracciamento.
   4. Decidi come filtrare e visualizzare le tracce.
      NOTA: In questo dataset, sono visualizzate solo le macchie rilevate (vedi File Supplementare 4).
   5. Dopo aver elaborato le singole tracce, esportare i dati di tracciamento come file XML per l'uso in un software di editing di fogli di calcolo (vedi Supplemental File 5).

Results

Come descritto nella sezione 2 del protocollo, le lisine sono state marcate utilizzando esteri NHS coniugati a una molecola di colorante fluorescente (NHS-dye). Dopo la coniugazione con la proteina, si misura il DOL con uno spettrometro UV-Vis. Per questo esperimento, il DOL dei tetrameri AQP4 era 4,12. Successivamente, determina la probabilità che ogni tetramero AQP4 abbia almeno una molecola di colorante utilizzando la distribuzione di Poisson fornita di seguito.

(2)

Dove P è la probabilità che ogni AQP4 venga etichettato, usando l'equazione 2, la probabilità che ogni tetramero AQP4 abbia un'etichetta fluorescente attaccata è del 98%. La distribuzione delle etichette per tetramero è mostrata nella Figura 2 e riflette la distribuzione della luminosità osservata nel campione.

Il rapporto segnale-rumore ottenuto in questi dati di esempio era 8-9x superiore al fondo per un singolo fluoroforo e oltre 15-20 per le particelle più luminose. Questa variazione deriva dalla posizione nel fascio di eccitazione e dal DOL descritto nel passo 2 del protocollo.

All'interno del file XML generato, le colonne di interesse sono J, K, L e M, che corrispondono rispettivamente all'ID del numero di particelle, al sistema in cui la particella è stata rilevata, alla posizione X della particella e alla posizione Y della particella (vedi File Supplementare 6). Nel secondo foglio del file, vengono calcolate la distribuzione della dimensione dei passi e il coefficiente medio di diffusione, dove le dimensioni dei passi sono le distanze che una particella percorre tra i fotogrammi, e la diffusione media è data dall'equazione 3:

(3)

Dove D_media è il coefficiente medio di diffusione, e Δt è il frame rate. Questa equazione assume un moto browniano, che è generalmente valido per piccoli spostamenti e può essere confermato analizzando il tag medio-quadratico rispetto al tempo da un campione di singole tracce ^3,30,31.

Un istogramma delle dimensioni dei passi mostra una distribuzione di particelle che diffondono, che può essere attribuita a OAP di dimensioni diverse (Figura 5).

Figura 1: Apparecchio per l'asciugatura dei lipidi. L'apparecchiatura consiste in una fiaschetta a fondo arrotondato da 10 mL con un connettore per la distillazione a vuoto. L'azoto entra a bassa pressione attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm con un ago collegato a un cappuccio di sintesi giallo, collegato a un connettore di distillazione a vuoto. La pressione viene rilasciata tramite un tubo Tygon collegato a una siringa con un ago di taglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Distribuzione attesa delle marchette fluorescenti su ciascuna unità AQP4 usando l'equazione 2. Il numero più probabile di fluorofori è 4, e il 98% di tutti gli AQP4 avrà un'etichetta fluorescente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Assemblaggio del portacampione. L'assemblaggio è composto da un tubo per lenti SM1 da 1" con le filettature maschio rimosse e smussate per evitare interferenze con l'obiettivo del microscopio. Include una copertura in quarzo e una guarnizione in parafilm. L'intero insieme è fissato con un anello di ritenimento SM1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Microscopio. Sul lato destro c'è un diagramma semplificato del microscopio; La linea verde mostra la luce di eccitazione proveniente dal laser. Partendo da destra, la luce laser passa attraverso una piastra d'onda da 1/4, poi viene messa a fuoco da un obiettivo da 300 mm. La luce viene riflessa da uno specchio dicroico a passo lungo sull'obiettivo, dove viene messa a fuoco sull'apertura posteriore. Utilizzando uno specchio di traslazione per spostare il fascio di eccitazione, il fascio viene posizionato al bordo dell'apertura dell'obiettivo, creando un campo evanescente nel campione. La luce emessa a fuoco viene raccolta dall'obiettivo ed è rappresentata dalla linea rossa. La luce emessa passa poi attraverso il filtro dicroico, poi tramite un filtro passa-lungo, ed è messa a fuoco da un obiettivo da 300 mm sulla fotocamera, fornendo un ingrandimento ottico di 1,7x (ingrandimento totale di 170x dall'obiettivo e dall'obiettivo a valvola). Sul lato sinistro c'è un'immagine del microscopio. Si noti che vengono utilizzati ulteriori specchi rotanti per posizionare correttamente il laser. Contemporaneamente, il braccio di rilevamento è disposto per massimizzare la raccolta di fotoni dalle proteine transmembrana marcate fluorescente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Istogramma delle dimensioni dei passi. La linea blu con i cerchi rossi è un istogramma di tutte le dimensioni dei passi. La linea nera è adatta a più coefficienti di diffusione. La distribuzione di probabilità per la dimensione dei passi è data da: dove f_i è la popolazione frazionaria di ogni tipo di particella diffusa, assumendo che ciascuna suba moto browniano. L'istogramma e l'adattamento mostrano una distribuzione eterogenea di particelle che si muovono più lentamente e più velocemente, attribuita a una distribuzione di dimensioni multiple di OAP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Calcolatrice di fogli di calcolo utilizzata per determinare composizioni mol%, quantità totali di lipidi e componenti fluorescenti/FRAP opzionali per la preparazione del SUV. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 2: Pila di immagini a fluorescenza grezza a singola molecola utilizzata nel tracciamento della traiettoria (file sorgente per il tutorial TrackMate). Clicca qui per scaricare questo File.

Fascicolo supplementare 3: Anteprima animata dei dati grezzi di fluorescenza singola che mostrano intensità e background prima dell'elaborazione. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 4: Animazione dei percorsi delle particelle filtrate (post-soglia) che mostra traiettorie rappresentative di AQP4 nel tempo. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 5: Overlay animato che mostra il tracciamento a campo completo delle particelle di molecole AQP4 usando l'output TrackMate. Clicca qui per scaricare questo File.

File Supplementare 6: Foglio di calcolo che mostra le coordinate di traiettoria estratte e le distribuzioni calcolate della dimensione dei passi utilizzate per l'analisi della diffusione. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussion

In questo articolo, presentiamo un metodo di tracciamento a singola particella per osservare direttamente le singole proteine della membrana mentre si muovono attraverso una membrana a doppio strato lipidico sostenuta da solidi e interagiscono tra loro. AQP4 è stato scelto come esempio rappresentativo per la sua capacità di formare auto-assemblaggi dinamici regolati dalle sue diverse isoforme 32,33,34. Sopra, illustriamo un metodo affidabile per la preparazione del campione e parametri chiave per tracciare proteine a singola membrana su scale di tempo di millisecondi. I passaggi includono: (1) preparazione dei SUV, (2) determinazione del livello appropriato di marcatura fluorescente, (3) preparazione di supporti solidi, (4) creazione di campioni di proteine transmembrana all'interno di un doppio strato lipidico sostenuto da solidi, (5) preparazione di agenti antifade, (6) costruzione di un microscopio semplice a singola molecola, (7) raccolta dati di tracciamento di singola molecola e (8) analisi dei dati di tracciamento tramite ImageJ.

Il metodo passo dopo passo descritto è concettualmente lineare; Tuttavia, ogni passaggio critico ha le sue insidie e limitazioni. Tra questi, la preparazione del campione è la più impegnativa (passaggi 1-5). Pertanto, alcuni dettagli vanno tenuti a mente. La prima è come creare un doppio strato lipidico sostenuto solidamente. Esistono tre metodi principali: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) fusione e rottura di SUV, e (3) spin-coating 35,36,37,38,39. Ogni metodo ha i suoi vantaggi e svantaggi. Ad esempio, il metodo di Langmuir-Blodgett fornisce un maggiore controllo sulle proprietà e sulla composizione chimica dei bistrati, inclusa la composizione asimmetrica tra le due foglioline, e consente la formazione controllata di multistrati. Tuttavia, usare una mangiatoia LB è tecnicamente impegnativo, richiede tempo e costoso da ottenere³⁵. Il rivestimento a spin è una tecnica relativamente semplice per creare bistrati lipidici; tuttavia, tende a produrre multilayer e richiede un grande eccesso di materiale, spesso una quantità impraticabilmente^{grande di 39}. La fusione e la rottura delle vescicole sono processi semplici che richiedono solo una piccola quantità di materiale. Tuttavia, creare una superficie idrofila è cruciale, e alcune composizioni lipidiche formano due strati tramite fusione vescicola più facilmente di altre (ad esempio, nel nostro laboratorio abbiamo riscontrato che vescicole con carica netta negativa formano due strati tramite fusione vescicola solo con l'aggiunta di cationi divalenti e tempi di incubazione prolungati)⁴⁰. Oltre a stabilire una superficie idrofila (passo 3), altre considerazioni importanti nella formazione di un bistrato sostenuto da solido tramite fusione vescicola includono il lavaggio del nuovo bistrato sia prima che dopo l'incorporazione della proteina di membrana. Il lavaggio pre-inserzione rimuove l'eccesso di SUV e le vescicole multilamelari più grandi (MLV), mentre il lavaggio finale dopo l'inserimento della membrana elimina le proteine non incorporate. Un lavaggio insufficiente può introdurre segnali di fondo durante gli studi di tracciamento.

Abbiamo selezionato numerosi detersivi per determinare se sono adatti all'inserimento proteico transmembrana in bistrati lipidici sostenuti da solidi, tra cui C12E9, Tween-20, TritonX-100 e molti altri. Il nostro detersivo preferito è il DOTM perché è facile da rimuovere ed è il più delicato sulla membrana (meno probabile che rovini l'integrità della membrana). La quantità di proteine aggiunte è fondamentale. Troppo, e sarà impossibile osservare i singoli binari. Quando si adatta questa procedura ad altre proteine transmembrana, la quantità dovrà essere regolata tramite tentativi ed errori. Tuttavia, le quantità fornite in questa procedura sono un ottimo punto di partenza. La quantità di detersivo deve essere mantenuta a quella o al di sotto della concentrazione micellare critica; altrimenti, il bistrato verrà solubilizzato e rimosso dal substrato di quarzo.

L'inserimento delle proteine di membrana nel bistrato lipidico supportato deve essere ottimizzato per ciascun insieme di condizioni sperimentali. Tuttavia, esistono alcuni metodi comuni per raggiungere questo obiettivo, tra cui l'uso di proteolisomi e l'incorporazione diretta di proteine di membrana in un bistrato⁴¹ preformato. Un proteoliosoma è un liposoma, come un SUV, con una proteina incorporata al suo interno. Questi proteoliosomi possono fondersi con un bistrato lipidico solido preformato o essere incorporati simultaneamente con i SUV durante la formazione del bistrato⁴². La fusione provoca la rottura, rilasciando la proteina nella membrana. È semplice da implementare, ma porta a un'orientazione casuale delle proteine di membrana. Questo può portare a forti interazioni con il supporto solido, risultando in proprietà di diffusione diverse a seconda dell'orientamento della^{proteina 3}. Questo protocollo descrive un metodo che utilizza l'incorporazione diretta, generando una preferenza orientazionale per AQP4 e altre proteine di membrana con grandi domini idrofili su un lato della^proteina 2,5,43,44^.

L'osservazione diretta è uno strumento potente utilizzato nella scoperta scientifica. L'imaging dinamico a singola molecola è particolarmente importante nella biofisica delle proteine di membrana, dove osservare il movimento e le interazioni delle singole proteine viene utilizzato per testare ipotesi o generarne di nuove che descrivono meglio il comportamento di una proteina. Il protocollo e i metodi descritti qui sono ideali per i bilayer lipidici bidimensionali supportati da solidi, ma possono essere estesi ad ambienti più complessi con componenti^{multipli 2}, celle vive 34,45,46,47 e tre dimensioni⁴⁸. Il tracciamento a singola molecola apre la porta a molti altri esperimenti, tra cui il tracciamento a due colori a singola^{molecola 49}, il FRET a singola molecola ^50,51 e l'imaging dinamico a super-risoluzione come la Stocastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) e la Point Accumulation Imaging Nanoscale Topography (PAINT). Espandendo lo strumento per includere il controllo della temperatura, si possono esplorare anche le proprietà termodinamiche delle proteine di^membrana 26,43,52.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra d'onda 1/4	Thorlabs	WPQ05M-633	Assicurati di abbinare il laser
Obiettivo 100X Oil	Olympus	12-563-659	1.45 N/A apocromatico
16:0-18:1 PC	Lipidi polari Avanti	850457	POPC Fosfolipidi
18:0 PEG2000 PE	Lipidi polari Avanti	880210	Sale di ammonio
Obiettivo 300mm	Thorlabs	AC254-300-A-ML
Laser He:Ne a 633 nm	Melles Griot	05-LHP-927	Può essere cambiato in altre fonti e in altre lunghezze d'onda
Filtro passa-banda a 633nm	Chroma Tech	633/10X	Corrispondenza al laser utilizzato
Filtro passa-lungo da 655nm	Chroma Tech	ET655lp	Modifica per adattarsi alle lunghezze d'onda del colorante/laser
Andor Solis I	Andor	Andor Solis I	Software per la cattura delle immagini
ATTO 655	ATTO-TEC	655 d.C.	Modifica NHS-Ester, qualsiasi colorante con una modifica adatta al lavoro su singole molecole può essere utilizzato. ATTO è consigliato, ma si può usare Cy5/7
Bio-perle SM-2 Resina	BioRad	1523922
Cloruro di calcio	Millipore Sigma	C4901
Catalasi	Sigma-Aldrich	C3155-50MG	dal fegato bovino, soltion acquoso, ≥ 30000 unità/mg
Cloroformio	Fisher Scientific	C547-1	HPLC o grado spettroscopico
Colesterolo	Sigma-Aldrich	C8667-500MG
Copertine	Ottica ESCO	R525000	Quarzo da 25mm
Divisore di fascio dicroico	Semrock	FF545/650-Di01-25x36	Modifica per adattarsi alle lunghezze d'onda del colorante/laser
Fotocamera EMCCD	Andor	iXon Ultra 888
Falcon Tubes 15mL	Greiner Bio-one	188261	Tubi di coltura cellulare Cellestar
Glucosio ossidasi	Sigma-Aldrich	G2133-50KU	da Aspergillus niger, typer VII, ≥ 100000 unità/g solido (senza ossigeno aggiunto)
Pistola termica	Trasporto merci portuale	56434	Utilizzata per il riscaldamento del parafilm, generalmente si poteva usare qualsiasi pistola termica
HEPES	Bioreagenti Fisher	BP310-500
Olio a immersione a bassa autofluorescenza	Thorlabs	MOIL-30
Methonal	Fisher Scientific	A452-1	HPLC o grado spettroscopico
Tubo microcentrifuga	VMR	525-1126	1,5 mL
Micro Pipetter	Ependorf		Varie; 1000 & micro; L, 100 & micro; L e 10 & micro; L sono suggeriti
& Oslash; Tubi per obiettivi da 1,5"	Thorlabs	SM1.5L10	La filettatura esterna viene ridotta per la preparazione del campione
Tabella ottica	Newport	Dipendenza RPR	La dimensione della tabula dipende dallo spazio disponibile
Tessuti ottici	Thorlabs	MC-50E	Pulizia di vari componenti
Parafilm	Millipore Sigma	P7669	Verifica che non sia nulla di fluorescente durante il processo
Attuatore piezoretico	Newport	PZA12
Isolatori pneumatici di vibrazione	Newport	Serie I-2000	usata per stabilizzare la tabella ottica per eventuali irregolarità
Bagno refrigerato	Fisher Scientific	Isotemp 3016
Regolatore dell'otturatore	Thorlabs	SC10	Collegato al software di imaging
Cloruro di sodio	Millipore Sigma	S988
Filtro Steritop	Millipore Sigma	S2GPT05RE
Driver e Controller Switchbox	Newport	PZC200	Controller di stage
Filtro a siringa	J.T. Baker	SF01-98	PES 25mm 0.2 & micro; M
Elemento TEC	Thorlabs	TEC3-2.5	Usata per collegare la pompa di calore Peltirer al portacampioni e al collare obiettivo
Regolatore di temperatura	Ingegneria Meerstetter	TEC-1091
Rivelatore di temperatura	Thorlabs	TH100PT
Termistore	Thorlabs	TH10K
Dialitico a tubo	G Bioscienze	786-611	4K MWCO
Detergente UV per ozono	Novascan	PSDP_UV	Pro Series - Digitale & nbsp;
Zoom Optics	Thorlabs	SM1NR1