Articolo metodologico

Modellazione della malattia mitocondriale utilizzando organoidi cerebrali: un focus sull'encefalomiopatia mitocondriale, l'acidosi lattica e gli episodi simili all'ictus

DOI:

10.3791/69303

⸱

10 ottobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli organoidi cerebrali fungono da modello prezioso per gli studi sull'encefalomiopatia mitocondriale, l'acidosi lattica e gli episodi simili all'ictus (MELAS), offrendo approfondimenti sulla loro fisiopatologia sottostante e fornendo una piattaforma per lo screening dei farmaci. Gli organoidi derivati da linee cellulari con livelli variabili di eteroplasmia dei geni che causano la malattia mostrano differenze fenotipiche significative.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'encefalomiopatia mitocondriale, l'acidosi lattica e gli episodi simili all'ictus (MELAS) sono disturbi mitocondriali più comunemente causati da una variante m.3243A>G nel tRNA mitocondrialeLeu. Per studiare la fisiopatologia di MELAS, abbiamo generato organoidi cerebrali da più linee di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da un paziente con MELAS portatore della variante m.3243A>G. Queste linee condividono un background genetico nucleare identico, ma differiscono nei loro livelli di eteroplasmia che coinvolgono la variante m.3243A>G. Abbiamo osservato differenze significative nelle dimensioni degli organoidi, nella morfologia e nell'efficienza dell'induzione neurale, che erano correlate con il grado di eteroplasmia. I neuroni dissociati dagli organoidi sono stati trasferiti in un sistema di coltura 2D, che è conveniente e adatto per lo screening di farmaci ad alto rendimento. Gli organoidi hanno anche mostrato differenze significative nella formazione delle reti neurali, a seconda dei livelli di eteroplasmia. I nostri risultati suggeriscono che i modelli di organoidi iPSC derivati da pazienti rappresentano una piattaforma utile per lo studio dei meccanismi MELAS e per lo screening dei farmaci. Questo video presenta metodi completi e di facile utilizzo, compresi i protocolli per la generazione di organoidi e la valutazione dei fenotipi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La miopatia mitocondriale, l'encefalopatia, l'acidosi lattica e gli episodi simili all'ictus (MELAS) sono malattie mitocondriali caratterizzate da disfunzione neurologica, episodi simili all'ictus e vari sintomi sistemici. La causa più comune è una variante m.3243A>G nel gene mitocondriale della leucina tRNA, MT-TL11. Si ritiene che questa variante comprometta la modificazione della taurina nell'anticodone, riducendo così l'efficienza di traduzione della leucina e contribuendo alla disfunzione mitocondriale in MELAS 2,3,4. In particolare, sono stati riportati miglioramenti dei sintomi in seguito alla somministrazione di alte dosi di taurina 5,6. Tuttavia, la presenza di non-responder suggerisce che ulteriori meccanismi fisiopatologici, non ancora identificati, possono contribuire alla malattia in individui portatori della variante m.3243A>G.

Per chiarire i meccanismi della malattia causati da varianti genetiche, è ideale utilizzare modelli sperimentali in cui tutte le variabili sono identiche tranne la variante causativa, consentendo confronti fenotipici accurati. Le linee cellulari modificate con genoma e i modelli animali con varianti corrette sono spesso utilizzati come controlli per le malattie dei geni nucleari. Tuttavia, la riparazione delle varianti del mtDNA rimane tecnicamente impegnativa, anche con tecnologie avanzate di editing del genoma7. Pertanto, la creazione di modelli sperimentali con sfondi nucleari identici rimane impegnativa. Per affrontare questo problema, abbiamo utilizzato due linee di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate dallo stesso paziente con MELAS che differiscono solo nei loro livelli di eteroplasmia (cioè la proporzione di DNA mitocondriale che trasporta la variante MT-TL1 m.3243A>G8) e abbiamo generato organoidi cerebrali come modello di malattia. Sebbene i livelli di eteroplasmia possano fluttuare durante il passaggio o la differenziazione cellulare, influenzando potenzialmente i fenotipi e causando variabilità da lotto a lotto nei risultati sperimentali, le cellule derivate da pazienti che trasportano varianti geniche mitocondriali rimangono preziose per studiare la patogenesi della malattia.

In questo studio, abbiamo generato organoidi cerebrali da iPSC derivate da un paziente con MELAS e abbiamo studiato la loro fisiopatologia per comprendere meglio i meccanismi della malattia. Utilizzando due linee iPSC con livelli di eteroplasmia alti e bassi, abbiamo osservato differenze significative nell'efficienza dell'induzione neurale, che erano correlate con il grado di eteroplasmia. I nostri risultati suggeriscono che gli organoidi cerebrali derivati da pazienti basati su iPSC forniscono una piattaforma preziosa per chiarire i meccanismi alla base di MELAS e per facilitare lo screening dei farmaci.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le due linee iPSC (2-6 e 2-8) sono state derivate dai fibroblasti dello stesso paziente MELAS utilizzando metodi ben consolidati8. Differiscono solo nei loro livelli di eteroplasmia. La linea 414C2 iPSC stabilita da un individuo sano è stata utilizzata come controllo. Il protocollo utilizzato in questo studio ha seguito le linee guida del Comitato Etico della Kitasato University School of Medicine (#G22-02).

1. Coltura cellulare

  1. Scongelamento delle scorte di celle congelate
    1. Preparare le piastre a 6 pozzetti rivestendo con laminina secondo le istruzioni del produttore.
    2. Riscaldare a 37 °C il terreno di coltura per iPSC prive di alimentatore contenenti 10 μM di inibitore ROCK.
    3. Recuperare il flaconcino di iPSC congelato dal serbatoio di azoto liquido (LqN2) e scongelarlo rapidamente in un bagno d'acqua a 37 °C.
    4. Trasferire la sospensione scongelata in 10 mL di terreno preriscaldato. Centrifugare a 120 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (22 °C).
    5. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere delicatamente il pellet picchiettando il tubo. Aggiungere il terreno fresco e le cellule del seme in piastre a 6 pozzetti prerivestite con laminina. Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.
  2. Cambio medio
    1. Sostituire il terreno (senza inibitore ROCK) ogni 1-2 giorni.

2. Generazione di organoidi cerebrali

  1. Inizio della differenziazione (Giorno 0)
    1. Rimuovere il terreno dalle piastre di coltura iPSC (~70-80% confluente). Lavare le celle con PBS.
    2. Aggiungere la soluzione enzimatica e incubare a 37 °C per 5 minuti.
    3. Aggiungere del mezzo per fermare la reazione. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL. Centrifugare a 190 × g per 5 min a temperatura ambiente (22 °C).
    4. Risospendere il pellet in 1 mL di terreno di differenziazione contenente 30 μM di inibitore ROCK, 5 μM di SB431542 e 2,5 μM di IWP-2.
      NOTA: Il supporto di base è lo stesso utilizzato nel passaggio 1.1.2.
    5. Conta le celle. Seminare 3 × 103 celle in 100 μl per pozzetto in piastre a forma di U, 96 pozzetti, a basso attacco. Incubare per 6 giorni a 37 °C, 5% CO2.
  2. Variazione media (giorno 6)
    1. Trasferire gli organoidi (dal passaggio 2.1.5) da una piastra a 96 pozzetti a una piastra da 10 cm utilizzando una pipetta a foro largo. Aggiungere 50 μL di terreno (DMEM/F12 con 1% di N2, sostituto della glutammina all'1% NEAA, 2,5 μM di IWP-2, 5 μg/mL di eparan solfato e 1% di PS) a ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti.
      NOTA: Utilizzare pipette a foro largo durante gli esperimenti durante il trasferimento degli organoidi per evitare di interrompere la loro struttura 3D. Inoltre, le pipette a 8 canali sono utili per eseguire esperimenti in modo rapido e accurato.
    2. Raccogliere gli organoidi in provette da 2 mL. Rimuovere con cautela il terreno per non aspirare gli organoidi e aggiungere 1,5 mL di DMEM/F12. Ripetere 3 volte per lavare gli organoidi.
    3. Rimuovere il terreno e aggiungere 500 μl di terreno fresco alle provette con organoidi. Trasferire tutti gli organoidi in un piatto di 10 cm, quindi aggiungere 5 ml di terreno per facilitare la raccolta di ciascun organoide.
    4. Prelevare un singolo organoide utilizzando una micropipetta regolata a 50 μl e trasferirlo in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Ripetere fino a quando tutti gli organoidi sono stati trasferiti nella piastra a 96 pozzetti (volume finale 100 μl). Incubare per 3 giorni a 37 °C, 5% CO2.
  3. Variazione media (9° giorno)
    1. (Facoltativo) Trasferire gli organoidi in una piastra di 10 cm quando si utilizzano pipette a 8 canali. Saltare il passaggio 2.3.1 quando si utilizzano micropipette a canale singolo e procedere al passaggio 2.3.2.
    2. Raccogliere gli organoidi in provette da 2 mL. Lavare 3 volte con DMEM/F12 come al punto 2.2.2.
    3. Risospensione in terreno di differenziazione (1:1 DMEM/F12 e neurobasale) contenente l'1% di N2, il 2% di B27 senza vitamina A, 100 μM di 2-mercaptoetanolo (ME), 2,5 μg/mL di insulina, l'1% di sostituto della glutammina, lo 0,5% di NEAA e l'1% di estratto della membrana basale.
      NOTA: Preparare piccole aliquote di estratto della membrana basale per uso singolo e conservare a -20 °C fino al momento del bisogno. Scongelare l'estratto a 4 °C senza farlo superare gli 8 °C, quindi mescolarlo in un terreno freddo e scaldare il terreno a temperatura ambiente per circa 30 minuti.
    4. Trasferire ~10 organoidi per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Regolare il volume finale del terreno per 1 pozzetto a 2 ml. Coltura statica per 6 giorni a 37 °C, 5% CO2.
  4. Variazione media (giorno 15)
    1. Raccogliere gli organoidi in provette da 15 mL. Lasciare la provetta indisturbata fino a quando tutti gli organoidi non si sono stabilizzati. Rimuovere il surnatante e aggiungere un nuovo mezzo di differenziazione (come al passaggio 2.3.3 ma con B27 + vitamina A).
      NOTA: Di solito, gli organoidi si depositano sul fondo della provetta senza centrifugazione. Tuttavia, i piccoli organoidi derivati dalle iPSC dei pazienti potrebbero non affondare in modo efficiente. In tal caso, centrifugare le provette a 120 × g per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere gli organoidi.
    2. Trasferire ~10 organoidi per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Coltura statica per 15 giorni a 37 °C, 5% CO2.
    3. Sostituire il terreno ogni 5-7 giorni fino al giorno 30.

3. Dissociazione di organoidi cerebrali per coltura 2D (Giorno 30)

  1. Piastre di rivestimento con poli-L-ornitina (PO)
    1. Preparare la soluzione madre PO sciogliendo 10 mg di PO in 66,7 mL di H2O e fare piccole aliquote per uso singolo. Conservarli a -20 °C fino al momento dell'uso.
    2. Diluire la soluzione madre PO 1:5 con H2O e rivestire le piastre di coltura con la soluzione diluita. Incubare per una notte a 37 °C.
  2. Rivestimento di laminina
    1. Rimuovere l'PO e lavare i pozzetti 3 x 5 minuti con PBS.
    2. Aggiungere la laminina (1:1.000 in PBS) e incubare a 37 °C per 3 ore o tutta la notte.
      NOTA: La soluzione madre di laminina è di 1 mg/mL. Preparare piccole aliquote e conservare a -80 °C fino al momento del bisogno.
  3. Dissociazione in singoli neuroni
    1. Scongelare la soluzione di dissociazione a 4 °C per 1 ora prima dell'uso.
    2. Trasferire gli organoidi in una provetta da 15 mL e lasciare la provetta indisturbata fino a quando tutti gli organoidi non si sono stabilizzati. Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di PBS per risciacquare gli organoidi.
    3. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere 1 mL di soluzione enzimatica e pipettare delicatamente 1-2 volte. Incubare a 37 °C per 5 min; pipettare più volte. Se necessario, incubare per altri 2–3 minuti. Pipettare nuovamente per completare la dissociazione.
    4. Centrifugare a 200 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di soluzione di dispersione e pipettare.
    5. Strato di soluzione isolante sotto e centrifugare a 200 × g per 5 min.
    6. Aggiungere 1 mL di terreno neuronale (neurobasale con 1% di B27, 0,25% di sostituto della glutammina, 1% di PS) e mescolare. Far passare la sospensione attraverso un colino da 70 μm in una provetta da 50 mL.
    7. Conta le celle. Celle di semina a 1 × 105 cellule/cm2 su piastre rivestite di PO/laminina. Sostituire il fluido ogni 4-7 giorni fino al giorno 60.

4. Raccolta di cellule e organoidi per analisi cellulari e molecolari

  1. Fissazione degli organoidi per l'immunofluorescenza (Giorno 30)
    1. Raccogliere gli organoidi (passaggio 2.4.3) in microprovette.
    2. Rimuovere il terreno con attenzione per non aspirare gli organoidi e aggiungere 1 ml di PBS per risciacquare gli organoidi.
    3. Rimuovere il PBS con attenzione per non aspirare gli organoidi e aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) per fissare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    4. Lavare 3 volte con PBS.
    5. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
  2. Raccolta di organoidi per RT-qPCR (giorno 30)
    1. Trasferire gli organoidi (passaggio 2.4.3) in microprovette. Lavare con PBS come descritto al punto 4.1.2.
    2. Aggiungere il tampone di lisi e congelare in azoto liquido (LqN2). Conservare a −80 °C fino al momento dell'uso.
  3. Fissazione cellulare per immunofluorescenza (giorno 60)
    1. Rimuovere il terreno di coltura e aggiungere PBS per lavare le cellule.
    2. Fissare in PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere il PFA e aggiungere PBS alle celle di lavaggio. Ripeti questo passaggio 3 volte.
    4. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.

5. RT-qPCR

  1. Estrarre l'RNA totale dagli organoidi secondo le istruzioni del produttore del kit.
  2. Sintetizzare il cDNA da 1 μg di RNA totale preparato nella fase 5.1 secondo le istruzioni del produttore del kit in un volume di reazione totale di 20 μL.
  3. Eseguire la PCR quantitativa utilizzando i seguenti primer: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Impostare la concentrazione finale per ogni reazione come segue: 1x master mix fluorescente, primer diretto 0,25 μM, primer inverso 0,25 μM. Il volume totale di reazione è di 15 μl, inclusi 0,2 μl di cDNA dalla fase 5.2. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: denaturazione iniziale a 95 °C per 1 min; 40 cicli a 95 °C per 15 s e 60 °C per 30 s.
  4. Normalizza l'espressione di FOXG1 in ACTB come controllo interno.

6. Colorazione in immunofluorescenza

  1. Incubare gli organoidi (giorno 30) in saccarosio al 10% per 1 ora a 4 °C, quindi saccarosio al 30% per ≥3 ore a 4 °C.
  2. Montare gli organoidi nel terreno di inclusione e preparare la criosezione (10 μm) utilizzando il criostato. Conservare le sezioni sui vetri scorrevole a −20 °C fino al momento dell'uso.
  3. Rimuovere il terreno di inclusione con il lavaggio PBS (2 x 5 min).
  4. Permeabilizzare in 0,3% PBST per 10 min. Lavare con PBS.
  5. Bloccare il 10% di siero di capra normale allo 0,1% di PBST per 1 ora. Incubare per una notte a 4 °C con anticorpi primari: anti-FOXG1 (1:200), anti-TUBB3 (1:500-1:1.000). Lavare 3 volte con PBS.
  6. Incubare con anticorpo secondario (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) per 1 ora. Lavare 3 volte con PBS.
  7. Montare e osservare al microscopio confocale.

7. Analisi dell'eteroplasmia

  1. Raccogliere le iPSC utilizzando raschiatori cellulari e trasferirle in microprovette. Aggiungere 0,5 mL di PBS e centrifugare a 100 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e procedere al passaggio 7.2.
  2. Estrarre il DNA totale secondo le istruzioni del produttore del kit.
  3. Impostare la concentrazione finale per ogni reazione PCR: 1x master mix fluorescente, primer diretto da 0,25 μM, primer inverso da 0,25 μM. Il volume totale di reazione è di 15 μL, inclusi 50 ng di DNA totale dalla fase 7.2. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: denaturazione iniziale a 95 °C per 1 min; 40 cicli a 95 °C per 15 s e 60 °C per 30 s. Le sequenze di primer sono le seguenti: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ attaccanti: gccaggaggtcttcgctgta; FBXO15_ Retro: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. Utilizzare i valori del ciclo di soglia per calcolare il numero di copie del DNA mitocondriale (mutante vs wild-type).
  5. Normalizzare al numero di copie del gene nucleare FBXO15 .

8. Valutazione delle dimensioni e della forma degli organoidi

  1. Cattura immagini di organoidi utilizzando il microscopio con formato TIFF.
  2. Misura le dimensioni e la circolarità utilizzando un software di analisi delle immagini open source. Aprire i file TIFF salvati nel passaggio 8.1 facendo clic su File | Apri e seleziona il file. Scegli le selezioni a mano libera e traccia l'organoide. Quindi fare clic su Analizza | Misurare. I valori di Area e Circolarità nei risultati sono stati utilizzati per l'analisi del passaggio 8.3.
  3. Analizzare i dati eseguendo un t-test per valutare se ci sono differenze significative rispetto alle linee di controllo utilizzando un software statistico.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo generato organoidi cerebrali e condotto colture neuronali 2D utilizzando un protocollo relativamente semplice con modifiche minori basato su Nakamura et al.9 (Figura 1). Nel protocollo precedente sono state utilizzate piastre a 96 pozzetti a forma di V, mentre in questo studio sono state utilizzate piastre a 96 pozzetti a forma di U a basso attacco per consentire alle cellule di aggregarsi naturalmente al centro di ciascun poz...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli organoidi indotti da cellule staminali embrionali umane (ESC)/iPSC rappresentano modelli di malattia promettenti per malattie rare intrattabili, mentre la generazione di organoidi cerebrali richiede tipicamente periodi di coltura prolungati della durata di diversi mesi10 e l'uso di attrezzature costose, come un contenitore ingegnerizzato che mescola continuamente il terreno di coltura e mantiene condizioni stabili per la coltura cellulare 3D a lungo termine. I...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le iPSC 414C2 sono state ottenute da RIKEN BRC. Il sostegno finanziario è stato fornito da JSPS KAKENHI (24H00648 a M.F., 23K08971 a C.S.) e AMED Translational Research Network Program (25yf0126001j002 a M.F.). Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del Servizio di Scambio Accademico Tedesco (DAAD) a F.B.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vasto di coltura cellulare da 10 cmCorning353003
Superficie di attacco ultra bassa a 6 pozziCorning3471
70 & mu; Filtro per cellule MCorning352350
AccutaseNacalai Tesque12679-54enzimi usati per dissociare le iPSC
Supplemento B27Thermofischer scientific17504001
Integratore di B27 meno vitamina AThermofischer scientific12587010
β-mercaptoetanolo (2-ME)sigmaM3148Scartare secondo le regole dell'istituzione.
Coltura Cellulare a 6 pozzi multi-piastraCorning353046
Punta del salva-cellulareBMBio ECOBMT-200Wpunta a pipett a largo diametro
Raschietti a celleSUMITOMO BAKELITECO., LTD.MS-93100
Microscopio confocaleZeissLSM710
CriostatoLeicaCM3050
Laminina 1 per topi di colturaR& D3400-010-02Utilizzato per rivestire piastre di colture 2D di neuroni dissociati
DMEM/F12FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.042-30795
Mezzo di montaggio a fluorescenzaDAKOS302380-2Mezzo di montaggio
Anticorpo FOXG1abcamab1968688
GlutamaxThermofischer scientific35050061
Anticorpo secondario anti-topo (H+L) per capra, Alexa Fluor Plus 488Thermofischer scientificA32723
Anticorpo secondario altamente adsorbito incrociato per capre IgG (H+L), Alexa Fluor Plus 555Thermofischer scientificA32732
Solfato di eparan (HS)sigmaH7640
Kit RNA-cDNA ad alta capacitàThermofischer scientific4387406Utilizzato per sintetizzare cDNA da RNA
Hoechst 33258Thermofischer scientificH3569
ImageJVersione 1.52AUtilizzato per misurare la dimensione e la circolarità degli organoidi
Seta iMatrix-511Takara Bio Inc.892021rivestimento per piastre per la coltura iPSC
insulinaFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.  090-06481
IWP2Tocris Bioscienza3533
Keyence BZ-X810KeyenceBZ-X810usata per catturare immagini per la Figura 3A
LSM710Carl Zeiss AGMicroscopio confocale
LSM980Carl Zeiss AGMicroscopio confocale
LUNA Universal qPCR Master MixNew England BiolabsM3003
MatrigelCorning354277
Supplemento N2Thermofischer scientific17502001
Mezzo neurobasaleThermofischer scientific21103049
Soluzione per la Dissociazione Neuronale  FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.291-78001
Amminoacidi non essenziali (NEAA)Nacalai Tesque06344-56
Siero normale per capreJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera trattata, micropiastra a fondo a forma di U trattataThermofischer scientific174929
Paraformaldeide (PFA)Nacalai Tesque09154-85Scartare secondo le regole dell'istituzione.
PBSNacalai Tesque14249-24
PBSNacalai Tesque27575-31
penicillina/streptomicina (PS)Nacalai Tesque26253-84
Poli-L-ornitina (PO)sigmaP3655
Poliossietilene(10) etere ottilfenilico (Triton)FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.168-11805
PRISM GraphPadVersione 9.5.0
QIAamp DNA Mini Kit & nbsp;QIAGEN51304Usato per estrarre il DNA totale
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Utilizzato per estrarre l'RNA totale
SB-431542Cayman Chemical13031
Occhiali a slittaMATSUNAMICRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02Nmezzo usato per la cultura degli iPSC non differenziati e dalla differenziazione dal Giorno 0 al Giorno 6
SucrosioFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.196-00015
Composto Tissue-Tek O.C.T.Sakura Finetek Japan Co., Ltd.4583Mezzo di crioconservazione
Anticorpo TUBB3PromegaG712A
Y27632FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.030-24021Inibitore ROCK
ZENCarl Zeiss AG2.3SP1 (edizione nera)software per analizzare le immagini scattate   con microscopio confocale (LSM710)
ZENCarl Zeiss AG2.6 (edizione blu)software per analizzare le immagini scattate   con microscopio confocale (LSM980)

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
  6. Ohsawa, Y., et al. Taurine supplementation for prevention of stroke-like episodes in MELAS: a multicentre, open-label, 52-week phase III trial. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 90 (5), 529-536 (2019).
  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
  9. Nakamura, M., et al. Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in patient-derived iPSCs. Stem Cell Rep. 13 (4), 684-699 (2019).
  10. Pagliaro, A., Artegiani, B., Hendriks, D. Emerging approaches to enhance human brain organoid physiology. Trends Cell Biol. 35 (6), 483-499 (2025).
  11. Kodaira, M., et al. Impaired respiratory function in MELAS-induced pluripotent stem cells with high heteroplasmy levels. FEBS Open Bio. 5, 219-225 (2015).
  12. Homma, K., et al. Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in the patient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium. Redox Biol. 41, 101921(2021).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Sindrome di MELAScellule staminali pluripotenti indottegenerazione di organoidiformazione di reti neuralilivelli di eteroplasmiascreening ad alto rendimentocolorazione in immunofluorescenzaanalisi RT qPCR

Articoli correlati