Preparazione di perle di compensazione economiche e universali compatibili per anticorpi multispecie

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo conveniente per preparare perle di compensazione multi-specie compatibili per la compensazione della fluorescenza nella citometria a flusso utilizzando microsfere di polistirene accoppiate da proteine ricombinanti A/G/L.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo economico e riproducibile per preparare perle di compensazione compatibili con più specie per la compensazione della fluorescenza nella citometria a flusso multicolore. Qui, la proteina di legame dell'immunoglobulina A/G/L (Protein A/G/L) contenente più domini di legame delle immunoglobuline è stata espressa in Escherichia coli (E. coli), purificata tramite cromatografia di affinità al nichel e accoppiata covalentemente a microsfere di polistirene carbossiliato tramite chimica EDC/NHS. Le sfere risultanti legano anticorpi provenienti da diverse specie e sottoclassi, generando segnali di fluorescenza forti e distinti adatti alla configurazione della compensazione. Questi risultati forniscono indicazioni pratiche per selezionare il diametro della perla e il carico proteico per raggiungere intensità di fluorescenza appropriate a diversi requisiti di compensazione. L'esecuzione efficace del protocollo è indicata da una purificazione efficiente delle proteine e da un picco di fluorescenza chiaro e ad alta intensità delle sfere coniugate rispetto alle sfere di controllo durante l'analisi della citometria a flusso. Questo approccio semplice e scalabile consente la preparazione di routine di sfere di compensazione stabili e versatili in laboratori standard, riducendo i costi e migliorando la flessibilità per le applicazioni della citometria a flusso.

Introduzione

La citometria a flusso è diventata uno strumento indispensabile in immunologia, biologia cellulare e ricerca clinica per l'analisi multiparametrica delle popolazioni^{cellulari 1,2,3}. Una sfida critica nella tradizionale citometria a flusso multicolore è lo spillover di fluorescenza, in cui lo spettro di emissione di un fluorocromo si sovrappone a più canali del rivelatore, portando a contaminazione del segnale e interpretazioni errate ^4,5. Pertanto, una corretta compensazione è essenziale per un'interpretazione accurata dei dati.

Tradizionalmente, i controlli di compensazione sono preparati utilizzando celle colorate a colori singoli. Tuttavia, il numero limitato di cellule, l'espressione variabile degli antigeni e il legame differenziale degli anticorpi alle cellule pongono^{sfide 6}. Di conseguenza, le sfere sintetiche modificate per legare gli anticorpi coniugati con fluorocromo sono emerse come alternativa^{pratica 7,8}. Le sfere offrono i vantaggi di una capacità di legame costante, un'elevata intensità di fluorescenza e l'indipendenza dai livelli di espressione antigenica^cellulare. Rispetto ai reagenti di cattura a singola specie o a reazione limitata Fc, l'incorporazione di più domini di legame immunoglobulina (Proteina A, G e L) amplia la copertura delle specie e la compatibilità dei formati degli anticorpi, permettendo a una singola preparazione di sfera di accogliere diversi anticorpi coniugati con fluorocromo.

Tra le perle utilizzate per compensazione, l'accoppiamento di proteine che legano l'immunoglobulina come la Proteina A, la Proteina G e la Proteina L fornisce ampia compatibilità con isotipi di anticorpi di diverse specie. Le proteine A e G si legano alla regione Fc di molte sottoclassi IgG, mentre la proteina L si lega alle catene leggere κ delle immunoglobuline e quindi espande la capacità di legame ai frammenti di Fab e agli anticorpi a catena^{singola 10,11}.

Sebbene siano disponibili perle di compensazione commerciali, il loro costo relativamente elevato può essere proibitivo per laboratori con budget limitati, limitandone così la diffusione³. Date queste sfide, è necessario creare piattaforme di perle flessibili e personalizzabili che permettano ai ricercatori di definire la dimensione delle perle, il dominio di legame degli anticorpi e i tipi di anticorpi utilizzati per i controlli di compensazione. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo semplice, economico e riproducibile per preparare perle di compensazione compatibili con più specie per la citometria a flusso multicolore. Questo protocollo descrive la progettazione, l'espressione e la purificazione di una proteina di fusione ricombinante contenente molteplici domini di legame immunoglobulina provenienti dalle proteine A, G e L, seguita dalla sua coniugazione covalente con sfere di polistirene modificate con carbossili di diametri definiti.

Il protocollo delinea il design molecolare della proteina di fusione, la sua espressione e purificazione in E. coli e la preparazione di reagenti di compensazione a perla compatibili con anticorpi multipli coniugati con fluorocromo. Questo protocollo è pensato per laboratori che esegue citometria a flusso multicolore in diversi contesti di ricerca, inclusi immunologia, oncologia e studi traslazionali, in particolare quando sono necessarie la riduzione dei costi, la compatibilità tra specie e controlli di compensazione flessibili.

Protocollo

NOTA: Preparare tutti i tamponi e reagenti con freschezza come indicato nella Tabella 1. Preparare soluzioni EDC e NHS immediatamente prima dell'uso; Non conservarli. Per tutti gli altri buffer (lisi, legaggio, lavaggio, eluzione, MES, PBS, Tris), preparare le soluzioni stock in anticipo e conservarle a 4 °C. Bilanciare i buffer immagazzinati alla temperatura di reazione appropriata (temperatura ambiente o 4 °C) prima dell'uso. Assicurarsi che il buffer FACS e il buffer di stoccaggio siano preparati freschi o conservati a 4 °C.

1. Espressione e purificazione della proteina ricombinante A/G/L

1. Espressione della proteina ricombinante A/G/L
   1. Trasformare il plasmide A/G/L della proteina pET28 in cellule competenti per E. coli BL21(DE3) utilizzando un protocollo standard di shock termico.
   2. Implacare le cellule trasformate su agar LB contenente 50 μg·^mL-1 kanamicina e incubare durante la notte a 37 °C.
   3. Inoculare una singola colonia in 5–10 mL di brodo contenente kanamicina (50 μg·^mL-1) e coltivare durante la notte a 37 °C con agitazione a 200 × g.
   4. Trasferire la coltura notturna in 200 mL di LB contenenti kanamicina (concentrazione finale 50 μg·^mL-1) a una diluizione 1:100.
   5. Far crescere la coltura a 37 °C finché la densità ottica a 600 nM (OD600) raggiunge 0,6–0,8.
   6. Indurre l'espressione proteica aggiungendo isopropilico β-D-1-tiogalattociranoside (IPTG) a una concentrazione finale di 0,5 mM e incubare a 28 °C per 12–16 ore.
   7. Prelevare le celle tramite centrifugazione a 4 °C, 4000 × g per 10 minuti.
   8. Scartare il soprantantante e risospendere il pellet cellulare nel buffer di lissi. Procedi immediatamente o conserva i pellet a -80 °C.
      Punto di pausa: I pellet cellulari possono essere conservati a -80 °C per diverse settimane prima della lisi.
2. Lisi Cellulare
   1. Risospendere la pellet batterica in 10 mL di tampone per lisi per ogni grammo di massa cellulare umida.
   2. Lisare le celle utilizzando un omogeneizzatore ad alta pressione impostato a 1000 bar, facendo passare la sospensione per 2–3 cicli finché la soluzione non diventa meno viscosa e traslucida.
      Nota: In alternativa, la disgregazione cellulare può essere eseguita tramite sonicazione sul ghiaccio usando la modalità pulsazione (5 s ON / 10 s OFF) per 8–12 cicli, evitando il surriscaldamento. Assicurati la lisi completa esaminando una piccola aliquota al microscopio.
   3. Centrifuga il lisato a 12000 × g per 30 minuti a 4 °C.
   4. Raccogli il soprandanante come frazione proteica solubile per la purificazione.
3. Purificazione dell'affinità Ni-NTA
   1. Bilanciamento delle colonne e carico del campione
      1. Bilanciare la colonna Ni-NTA con 10 volumi della colonna (CV) di buffer di legame contenente 10 mM di imidazolo.
      2. Filtrare il lisato chiarificato attraverso un filtro da 0,45 μM, aggiungere imidazolo a una concentrazione finale di 10 mM e caricarlo sulla colonna a 0,5 CV·^min-1.
      3. Raccogli la frazione di flusso per monitorare l'efficienza del legame.
   2. Lavaggio
      1. Lavare la colonna con 10 CV di tampone di legame e tampone di lavaggio contenenti 20 mM di imidazolo a una portata di 1 CV·^min-1.
   3. Eluzione
      1. Eludi la proteina bersaglio con il tampone di eluzione a una portata di 1 CV·^min-1.
      2. Raccogliere frazioni e monitorare A280 per identificare le frazioni contenenti proteine.
   4. Scambio di tampone e stoccaggio proteico
      1. Trasferire la soluzione proteica purificata su un tubo centrifugo di ultrafiltrazione a corte di peso molecolare (MWCO) da 50 kA.
      2. Centrifugare a 3.500 × g per 15–20 minuti a 4 °C fino a raggiungere la concentrazione desiderata.
      3. Scartare il flow-through e aggiungere un volume uguale di buffer PBS (pH 7,4) al retentate per lo scambio di buffer.
      4. Ripeti la centrifugazione e la sostituzione del PBS 2–3 volte per sostituire completamente il buffer originale con il PBS.
      5. Dopo l'ultimo passaggio di concentrazione, raccogli il retentato e misura la concentrazione proteica.
      6. Verifica le frazioni elute tramite SDS-PAGE; il peso molecolare atteso della proteina A/G/L è di circa 90 kDa.
      7. Aliquota la proteina purificata e conserva a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
         NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa in questo passaggio. La proteina purificata A/G/L può essere conservata a -80 °C per una successiva coniugazione delle perle. Dopo la concentrazione, sono stati ottenuti circa 10 mg di proteina purificata A/G/L da 200 mL di coltura batterica, con una concentrazione finale di 2–5 mg·mL⁻¹.

2. Coniugare le sfere alla Proteina A/G/L

1. Pre-lavaggio delle perline
   1. Il vortice applica la sfera alla massima velocità per 20–30 secondi a temperatura ambiente (20–25 °C) per risospendere uniformemente. Trasferire 0,2 mL di 8 μM (5 mg) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
   2. Pellet per centrifugazione, 5000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
   3. Aspirare con cura e scartare il surnatante senza disturbare il pellet.
   4. Aggiungi 1 mL di 0,1 M di buffer MES, risospendi delicatamente tramite pipetto o vortice delicato, centrifuga di nuovo 5000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente, e rimuovi il surnaante. Ripeti questo lavaggio una volta (in totale due lavaggi MES).
2. Attivazione con EDC/NHS
   ATTENZIONE: EDC e NHS sono irritanti e devono essere gestiti con dispositivi di protezione individuale adeguati in una cappa a pompa.
   1. Sospendere le perle in un buffer MES da 0,5 mL, poi aggiungere sequenzialmente 50 μL di 50 mg·^mL-1 NHS e 100 μL di 50 mg·^mL-1 EDC.
      Nota: Le soluzioni EDC e NHS devono essere preparate fresche immediatamente prima dell'uso.
   2. I vortice formano perle e incubano su uno shaker rotante a temperatura ambiente per 30 minuti per attivarsi.
3. Rimuovere i reagenti di attivazione e lavare
   1. Perle per pellet: 5000 × g, 3 min, a temperatura ambiente. Rimuovi con attenzione il surnatente.
   2. Aggiungi 1 mL di PBS buffer, risospendi delicatamente, centrifuga (5000 × g, 3 minuti, a temperatura ambiente) e rimuovi il surnadante. Esegui un lavaggio PBS per rimuovere i reagenti di attivazione.
4. Accoppiamento proteico
   1. Risospendere la pellet a sfera attivata in 0,4–0,5 mL PBS (obiettivo finale di volume di reazione 0,5–0,6 mL). Mantieni il volume basso per aumentare la concentrazione efficace di proteine.
   2. Aggiungi 100 μg di proteine A/G/L. MESCOLA DELICATAMENTE.
   3. Incubare la reazione su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 2 ore per un accoppiamento rapido, oppure 4 °C durante la notte. Mantieni un rotolamento delicato per evitare che le perline si depositino.
5. Reazione di spegnere/terminazione
   1. Perdite di pellet (5000 × g, 3 minuti) e rimuovere il soprandante.
   2. Aggiungere 1 mL 0,1 M Tris (pH = 7,4) per estinguere gli esteri NHS rimanenti. Risospendere e incubare su shaker rotante per 30 minuti a temperatura ambiente.
   3. Sferare pellet e lavare con 1 mL PBS nello stesso tubo da microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifuga di nuovo (5000 × g, 3 minuti) e scarta il soprantantante. Poi, sospezione delle perle con un buffer di stoccaggio da 0,5 mL.
      Punto di pausa: Il protocollo può essere messo in pausa in questo passo. Le perle di sospensione possono essere conservate a 4 °C.
6. Mescola e conserva
   1. Contando le perline coniugate e le perline non coniugate. Mescola le sfere coniugate e non coniugate in un rapporto 25%–75% nel nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
   2. Sospendere la miscela di perline in 1 mL di buffer di conservazione (PBS contenente 1% di BSA e conservante antimicrobico allo 0,05%).
   3. Trasferisci la sospensione in un tubo etichettato e conserva a 4 °C. Non è necessaria la protezione della luce. Sospendi delicatamente prima dell'uso per garantire una distribuzione uniforme delle perline. In queste condizioni, le perline rimangono stabili per almeno 6 mesi.

3. Rappresentante QC

1. Incubare 10 μL di sfere coniugate con 1 μL di anticorpo fluorescente in un tampone FACS da 100 μL per 15–30 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Ogni tubo dovrebbe contenere un solo anticorpo fluorescente.
2. Lavare le perline con 1 mL PBS, risospendere in PBS da 300–500 μL e far funzionare sul citometro a flusso.
3. Impostare il canale di rilevamento in base al fluoroforo coniugato all'anticorpo (ad esempio, laser da 488 nM con rivelatore FITC per anticorpi coniugati con FITC). Un intervallo rappresentativo di tensione a tubo fotomoltiplicatore (PMT) da 0 a 200 V può essere utilizzato come punto di partenza e regolato in base alle prestazioni dello strumento. Raccogli almeno 10.000 eventi per campione.
4. Gate sulle perline di FSC/SSC. Le sfere positive dovrebbero mostrare un picco singolo chiaro con un alto MFI nel canale del fluoroforo; Il controllo negativo dovrebbe mostrare solo lo sfondo.

Risultati

La proteina di fusione ricombinante A/G/L è composta da 816 amminoacidi con un peso molecolare calcolato di 90,5 kDa (File Supplementare 1). Questa proteina di fusione trattiene cinque domini B che legano IgG dalla Proteina A, due domini di legame IgG dalla Proteina G e cinque domini B che legano la catena leggera κ dalla Proteina L, mentre il dominio di legame all'albumina è stato rimosso (Figura 1A, Tabella Supplementare 1...

Discussione

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro pratico ed efficiente per la preparazione di sfere di compensazione fluorescenti basate sulla proteina ricombinante A/G/L. La procedura include l'espressione batterica, la purificazione dell'affinità Ni-NTA e l'accoppiamento covalente della proteina purificata a microsfere di polistirene modificate con carbossili utilizzando la chimica EDC/NHS. Le sfere risultanti possono legare anticorpi di più specie e sottoclassi, fornendo uno strumento v...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AF647 Rat Ig2a	BioLegend	141711
APC Mouse IgG1	BioLegend	353311
BL21(DE3) Cellule competenti	Sangon	B528414
BSA	Solarbio	A8010
EDC	Thermo Fisher	22980	CAS: 1892-57-5
FITC IgG per criceti armeni	BioLegend	400905
Imidazolo	Sigma-Aldrich	I202	CAS: 288-32-4
IPTG	GoldBio	I2481C	CAS: 367-93-1
Kanamicina	Sangon	A600286	CAS: 8063-07-8
KCl	Aladdin	P112134	CAS: 7447-40-7
KH2PO4	Aladdin	P434010	CAS: 7778-77-0
MES	Sigma-Aldrich	M3671	CAS: 145224-94-8
Na2HPO4	Aladdin	S274390	CAS: 7558-79-4
NaCl	Aladdin	C111549	CAS: 7647-14-5
NHS	Thermo Fisher	24500	CAS: 6066-82-6
Ni NTA Perle 6FF	Smart-Lifesciences	SA005005
Topo PE IgG2a	BioLegend	362603
ProClean 300	Beyotime	ST853
Tris	Sigma-Aldrich	252859	CAS: 77-86-1
Triptone	Ossassoide	LP0042
Filtro Ultra Centrifugo, 50 kDa MWCO	Millipore	UFC9050
Microsfere uniforme di polistirene carboxilo	Tomicro Biotech	10ml, 25mg/ml	Shanghai, Cina
Estratto di lievito	Ossassoide	LP0021