Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Sommario

Fino a tempi recenti, studi di espressione sul cervello umano sono stati limitati alla quantificazione di RNA o proteine. Con le tecniche di immunoprecipitazione della cromatina descritte in questo documento, sarà possibile mappare metilazione dell'istone e gli altri regolatori epigenetici dell'espressione genica nel cervello post-mortem.

Abstract

Croniche malattie neuropsichiatriche come la schizofrenia, malattia bipolare e l'autismo si pensa che il risultato di una combinazione di fattori genetici e ambientali che potrebbero risultare in alterazioni epigenetiche dell'espressione genica e di altre patologia molecolare. Tradizionalmente, tuttavia, studi di espressione nel cervello post-mortem erano limitati alla quantificazione di mRNA o proteine. I limiti riscontrati nella ricerca sul cervello post-mortem come variabilità nel tempo e integrities autolisi dei tessuti sono anche suscettibili di influenzare tutti gli studi di strutture di ordine superiore della cromatina. Tuttavia, l'organizzazione nucleosomal di DNA genomico tra cui DNA: istone nucleo vincolante - sembra essere in gran parte conservati in campioni rappresentativi forniti dalle banche del cervello diverse. Pertanto, è possibile studiare il modello di metilazione ed altre modifiche covalenti istoni del nucleo a definire loci genomici nel cervello post-mortem. Qui vi presentiamo una versione semplificata nativo immunoprecipitazione della cromatina (NChIP) protocollo per surgelati (mai-fisso) campioni del cervello umano. A partire dalla digestione micrococcal nucleasi omogenati di cervello, NChIP seguita da qPCR può essere completata entro tre giorni. La metodologia qui presentata dovrebbe essere utile a chiarire i meccanismi epigenetici dell'espressione genica in condizioni normali e malate del cervello umano.

Protocollo

Procedimento:

1 ^° Giorno

1. Omogeneizzare 50-500 mg di surgelati post-mortem del tessuto grigio questione con Douncing tampone.

! ATTENZIONE - tessuti umani devono essere maneggiati con cura in condizioni di sicurezza rigorose. Pertanto deve essere trattato a BSL-2 o superiore standard di sicurezza.

1. Prendere in precedenza sezionato, post-mortem del cervello da -80 ° C, li dounce del volume cerebrale di tampone 5X Douncing, e il luogo in tubo di 2,0 ml microcentrifuga. Abbinato campione e le coppie di controllo vengono elaborati contemporaneamente. ....

Discussione

Il protocollo qui descritto è particolarmente utile per i ricercatori interessati ad firme metilazione dell'istone e / o il DNA del cervello umano, perché questi segni cromatina può essere meno soggetti a post-mortem artefatti rispetto ad altri tipi di modifiche, tra cui (gli istoni) acetilazione e fosforilazione ^{1, 2.} Il cervello post-mortem è riconducibile allo studio di mono-nucleosomal preparati; il DNA rimane in gran parte collegata al istoni core, almeno negli esemplari con intervalli autolisi rappresentante (il tempo t.......

Materiali

Soluzioni:

• Buffer nChIP Douncing: 10 mM Tris, 4 mM MgCl _2, 1 mM CaCl ₂ aggiustare il pH a 7,5
• 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl aggiustare il pH a 7,5
• Sale di lavaggio tampone bassa: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
• Buffer sale di lavaggio ad alta: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl
• Tampone al litio cloruro: 1% IGEPAL-CA 630, 1% acido desossicolico, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl
• TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
• Eluizione Buffer: 0,1 M NaHCO _3, 1% SDS
• Proteinasi K buffer di digestione (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl regolare il pH a 8,0
• 3 M di acetato di sodio: 24,61 g di acetato di sodio anidro (PM = 82,03) in 100 ml di acqua distillata in autoclave. Regolare il pH a 5,2 con acido acetico concentrato.