Questo video dimostra il protocollo di immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP). MeDIP è una procedura di due giorni che estrae selettivamente i frammenti di DNA metilato da un campione di DNA genomico utilizzando anticorpi con specificità per 5-metilcitosina (anti-5 MC).
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Articolo metodologico
Immunoprecipitazione DNA metilato
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'identificazione di modelli di metilazione del DNA è una procedura comune nello studio dell'epigenetica, come metilazione è conosciuto per avere effetti significativi sulla espressione genica, ed è impegnato con il normale sviluppo così come la malattia
Protocollo
DNA ESTRAZIONE E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
DNA da una varietà di diversi campioni (cellule in coltura, fresco congelato così come i tessuti fissati in formalina paraffina) può essere utilizzato per MeDIP. E 'importante utilizzare il DNA altamente purificato, senza proteine associate come gli istoni. E 'anche importante rimuovere l'RNA il più possibile dal campione, in quanto può interferire sia con la quantificazione del DNA e legame degli anticorpi. La quantità di DNA utilizzata per MeDIP può variare da 200 ng a 1 mg a seconda della quantità di DNA disponibile. Per dimostrare questo protocollo, 1 mg di DNA verrà utilizzato. I....
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Discussione
Vi è una crescente consapevolezza della metilazione del DNA gioca significativo ruolo nella malattia, quindi lo sviluppo di test per misurare questa modifica sono sempre più importanti 3, 12, 13. La tecnica MeDIP è uno strumento suscettibile di screening, sia l'intero genoma e locus specifico livello 6, 7. Questa tecnica fornisce una visione rapida dei livelli di metilazione del DNA utilizzando quantità limitate di partenza del DNA e permette un facile confronto tra le diverse fonti. Applicazio.......
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Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare i membri della Brown e laboratori Lam per la loro partecipazione criticare questo video e articolo. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute e la Michael Smith Fondazione per la Ricerca Sanitaria.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Sonicatore Biorupter | Strumento | Diagenode | UCD-200 TM | |
| Provette microcentrifuga SafeSeal da 1,7 ml | Altro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| Spectrofotometro ND 3300 | Strumento | NanoDrop | ||
| Anticorpo primario: Anti-5’-metilcitosina mouse mAb | Reagente | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Anticorpo secondario: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagente | Invitrogen | 112-01D | |
| Portaprovette magnetico | Strumento | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Strumento | Labnet International | H5500 | |
| Buffer per IP | 10 mM NaPO4 pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Conservare a temperatura ambiente | |||
| Buffer di digestione | 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl |
Riferimenti
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilbe....
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Ristampe e permessi
