Non radioattivo In situ Protocollo di ibridazione applicabile per la Norvegia Abete e una serie di specie di piante
17 aprile 2009
Descriviamo un DIG modificato In situ Protocollo di ibridazione, che è veloce e applicabile su una vasta gamma di specie vegetali tra cui la Norvegia abete rosso. Con solo alcuni aggiustamenti, tra cui alterato RNasi trattamento e la concentrazione proteinasi K, il protocollo può essere utilizzato negli studi di diversi tessuti e specie.
Protocollo di ibridazione in situ non radioattiva applicabile alla picea abete rosso e a una vasta gamma di specie vegetali. Carre Etal. Ciao, mi chiamo AM GaN e lavoriamo presso l'Università OBS e la Swedish University of Agricultural Sciences a Uppsala, Svezia.
Abbiamo stabilito un protocollo di visita insettivora che funziona su diverse specie vegetali. Oggi vi mostreremo alcuni passaggi impegnativi. In questo protocollo, vi illustreremo l'inclusione, il taglio in sezioni e le diverse fasi dell'esperimento di visita insettivora.
Andiamo al laboratorio Uno, fissazione e inclusione, passaggi da nove a undici del protocollo. Passaggio nove, preriscaldare le piastre di Petri e gli stampi a 60 gradi centigradi. Passaggio dieci, riscaldare una coppia di pinzette e distribuire i tessuti uniformemente in una piastra.
Aggiungere ulteriore paraffina istologica in modo da coprire i tessuti. Passaggio 11: lasciare solidificare la paraffina a temperatura ambiente. Due passaggi sessuali da 12 a 19 nel protocollo.
Accendere le piastrine riscaldanti e tenere a disposizione paraffina istologica fusa. Prelevare i campioni dalla stanza fredda. Passaggio 13: utilizzare un bisturi per tagliare con attenzione un blocco di tessuto in paraffina.
Modellare il campione per facilitare il taglio. Passo 14: riscaldare il blocco a freddo e fondere insieme il tallone. Lasciare solidificare il preparato a quattro gradi centigradi.
Passo 15, tagliare il blocco di paraffina in sezioni spesse da sei a otto micrometri. Utilizzando un microtomo, le sezioni sono collegate in un'unica striscia lunga. Tagliare la striscia e trasferirla sulla carta.
A questo punto, è possibile esaminare le singole sezioni al microscopio stereoscopico per selezionare le sezioni di interesse. Sarà facile eseguire un'ispezione con tessuti o colorati con eosina. Passo 17: aggiungere acqua Milli Q libera da RNA sui vetrini.
Tagliare il nastro in pezzi più piccoli e posizionarli sui vetrini. Spostare i vetrini sulla piastra riscaldata. Passaggio 17: lasciare appiattire i nastri su una piastra a 42 gradi centigradi per uno o due minuti.
Svuotare l'acqua utilizzando l'olio Kim. Passaggio 19, incubare i vetrini a 42 gradi centigradi per tutta la notte in modo che i tessuti aderiscano ai vetrini per l'ibridazione in situ 4.1 nella sezione in-situ. Passaggi di pre-trattamento da 36 a 48 nel protocollo.
Passaggio 36: sezioni depa nello strato istologico. I vetrini sono disposti in modo uniforme e posizionati in una rastrelliera per facilitare lo spostamento tra contenitori diversi, disidratando le sezioni. In una serie di etanolo, aggiungere anidride acetica mescolando vigorosamente.
Passaggio 45, preparazione per il trattamento con anidride acetica 4.2 di ibridazione in situ. Passaggi da 49 a 52 in un protocollo. Passaggio 51, invecchiamento dei vetrini Pro One Plus.
La soluzione è viscosa. Cerchi di evitare bolle. Incubare i vetrini in una camera umidificata.
4.3 iniz. Dopo l'ibridazione, passaggi da 53 a 72 nel protocollo. Passaggio 62, incubare i vetrini con il blocco di burer in un contenitore di plastica.
Passaggio 63, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione bloccante per coprire appena i vetrini. Gli anticorpi vengono aggiunti sui vetrini mediante incubazione. L'incubazione funziona solo con vetrini ProBonn Plus. Per vetrini di disegno simile, passaggio 65, lasciare che le forze capillari risucchino la soluzione di anticorpo anti-digossigenina.
Questo passaggio viene ripetuto. Passaggio 70, come in precedenza, inserire a sandwich e aspirare la soluzione blu Western. Notare che la soluzione blu Western viene aspirata due volte, proprio come abbiamo fatto per la soluzione dell'anticorpo anti dig.
E al passaggio 65, passaggio 71 incubare i vetrini al buio per uno a cinque giorni. A temperatura ambiente, il monitoraggio dei segnali di ibridazione può essere effettuato al microscopio stereoscopico. Mentre i vetrini sono ancora accoppiati, dovrebbe essere possibile osservare macchie di colore viola a marroncino.
Questo è l'aspetto dei risultati effettivi dell'esperimento condotto nella stazione CW. È possibile osservare il segnale qui come una colorazione viola o marroncina.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo modificato di ibridazione in situ con DIG efficiente e adattabile a diverse specie vegetali, inclusa l'abete rosso. Il protocollo incorpora specifiche modifiche, come variazioni nel trattamento con RNasi e nella concentrazione di proteinasi K, per migliorarne l'applicabilità su diversi tessuti e specie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Biologia molecolare
- Tecniche di ibridazione in situ
Sfondo
- L'ibridazione in situ è una tecnica preziosa per lo studio dell'espressione genica nei tessuti.
- I metodi tradizionali possono essere lunghi e specifici per specie.
- Modifiche ai protocolli esistenti possono migliorare l'efficienza e la versatilità.
- Questo studio si concentra su un protocollo adatto a una gamma di specie vegetali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo di ibridazione in situ più rapido e versatile.
- Dimostrare l'applicabilità del protocollo all'abete rosso e ad altre specie vegetali.
- Fornire passaggi procedurali dettagliati per i ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Inclusione e sezionamento dei tessuti vegetali.
- Passaggi di pretrattamento e ibridazione per l'analisi in situ.
- Utilizzo di reagenti specifici e condizioni ottimizzate per ottenere risultati migliori.
- Monitoraggio dei segnali di ibridazione al microscopio.
Risultati principali
- Il protocollo modificato facilita con successo l'ibridazione in situ in molteplici specie vegetali.
- Le modifiche nel trattamento con RNasi e nella concentrazione di proteinasi K migliorano la compatibilità con i tessuti.
- È stata ottenuta una chiara visualizzazione dei segnali di ibridazione.
- Il protocollo è efficiente e riproducibile per diverse applicazioni.
Conclusioni
- Il protocollo modificato di ibridazione in situ con DIG è uno strumento prezioso per la ricerca vegetale.
- Permette un'analisi rapida ed efficace dell'espressione genica in diversi tessuti vegetali.
- Studi futuri potranno basarsi su questo protocollo per applicazioni più ampie in biologia vegetale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo protocollo consente l'analisi dell'espressione genica spaziale ad alta risoluzione nei sistemi vegetali, supportando la validazione degli obiettivi nella fase iniziale di scoperta mediante conferma di modelli di espressione specifici per tessuto. Riduce la dipendenza da radioisotopi e da estese ottimizzazioni specifiche per specie, migliorando la riproducibilità e la scalabilità per studi comparativi interspecie. Il metodo fornisce un valore meccanicistico di riduzione del rischio per lo screening fenotipico e la scoperta di biomarcatori traslazionali nei processi produttivi di biofarmaci a base vegetale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Conferma la localizzazione dell'mRNA in tessuti specifici per indagare ipotesi terapeutiche e chiarire la funzione genica nei percorsi di sviluppo riproduttivo.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli attraverso la visualizzazione diretta dell'espressione genica negli organi riproduttivi maschili in modelli di gimnosperme e angiosperme.
- Valore predittivo: Supporta l'affidabilità predittiva dimostrando pattern conservati di espressione di geni omologhi (ad esempio, omologhi di AP3) nelle strutture floreali di Arabidopsis, Brassica e abete rosso.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sezioni di tessuto standardizzate per saggi di ibridazione successivi, garantendo un rilevamento del segnale costante mediante sonde marcate con DIG.
- Riproducibilità: Elimina il trattamento con RNasi e regola la concentrazione di proteinasi K per potenziare l'intensità del segnale e ridurre la variabilità tra specie.
- Scalabilità: Consente un'applicazione ad alto rendimento su diverse specie vegetali con minimi aggiustamenti del protocollo, permettendo il riutilizzo della piattaforma in genomica comparativa.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Dimostra l'applicabilità dagli angiospermi modello ai gimnospermi, sostenendo l'estrapolazione dei risultati a sistemi legnosi perenni rilevanti per la produzione di biomassa e biopolimeri.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'ambiguità nell'assegnazione della funzione genica collegando l'omologia di sequenza all'espressione spaziale in strutture dello sviluppo conservate.
- Allineamento dei biomarcatori: Permette la correlazione spaziale tra espressione genica e caratteri fenotipici nei tessuti riproduttivi, favorendo la scoperta di biomarcatori nell'agricoltura molecolare vegetale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase di biologia della scoperta, consentendo l'identificazione di bersagli guidata da ipotesi prima dello screening di composti leader in sistemi di espressione a base vegetale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante la validazione dell'espressione spaziale di geni candidati in tessuti specifici e stadi di sviluppo.
- Screening: Genera letture spaziali quantitative che guidano la progettazione di saggi per il monitoraggio dell'effetto di composti in tessuti transgenici o trattati.
- Analisi: Produce segnali cromogenici rilevabili (dal viola al marrone) adatti all'acquisizione di immagini e all'analisi comparativa tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i modelli di espressione genica a fenotipi dello sviluppo negli organi riproduttivi, supportando le decisioni di avanzamento nei percorsi di validazione di tratti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e adattabile per l'analisi dell'espressione genica interspecie, riducendo gli sforzi ridondanti di ottimizzazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo mediante la rilevazione diretta e risolta spazialmente dell'mRNA, senza i rischi associati all'uso di sostanze radioattive.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità eliminando il trattamento con RNasi e standardizzando l'uso della proteinasi K, riducendo così le percentuali di fallimento del protocollo.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o abbandono nella selezione degli obiettivi fornendo dati inequivocabili sull'espressione in una fase precoce della scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli adeguata al rischio in base a modelli di espressione conservati tra specie diverse, migliorando le probabilità di successo nelle applicazioni successive.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in istologia, inclusione dei tessuti e sezionamento per materiali vegetali.
- Dipende dall'accesso a microtomi, forni per ibridazione e sistemi di rilevamento cromogenico.
- Necessita della standardizzazione della concentrazione di proteinasi K in base alla densità del tessuto e al contenuto di fenoli.
- Richiede l'adattamento dei tempi e delle temperature di incubazione per specie diverse e lunghezze di sonde differenti.
- È limitato dall'autofluorescenza del tessuto e dalla penetrazione dei composti in campioni altamente lignificati o ricchi di metaboliti secondari.
