Name: Non radioattivo In situ Protocollo di ibridazione applicabile per la Norvegia Abete e una serie di specie di piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Impara un protocollo di ibridazione in situ DIG non radioattivo per l'espressione genica in diverse specie vegetali, incluso l'abete rosso norvegese. Questo metodo offre un'analisi rapida e riproducibile dei tessuti.

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Siamo molto grati a Anders Bovin che ha fornito la musica per il nostro cinema e di Michael Elliot Azioni per il volontariato di essere la voce degli altoparlanti. Il sostegno è stato fornito da Carl Trygger Foundation, il programma di ricerca strategica Genomica Funzionale agricola (AgriFunGen) presso l&#39;Università svedese di Scienze Agrarie, il Consiglio svedese della ricerca (VR), e il Consiglio svedese della ricerca per l&#39;ambiente, Scienze Agrarie, e della pianificazione territoriale (FORMAS ).

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</ol>

Due aspetti del P. abies protocollo sono stati ottimizzati rispetto alla A. thaliana / B. napus protocollo, RNasi trattamento e proteinasi K concentrazione. La RNAsi rimuove i segnali di fondo e quindi aumenta la specificità del segnale 17. Il trattamento proteinasi K è necessaria per permeabilize tessuti modo che la sonda può entrare e ibridare alla piscina RNA di interesse. Il DAL13 antisenso sonda ha dato un segnale superiore senza RNasi-trattamento (Fig. 3C, E, G), rispetto a sezioni trattate con RNasi per 30 min (Figura 2D, F e H). Dato che la RNAsi-trattamento non ha incrementato il segnale è stato rimosso dal protocollo. Il trattamento proteinasi K sono stati testati a tre diverse concentrazioni, 1, 3 e 5 mg / ml. Nel caso di P. abies un segnale basso o nullo è stato osservato con 1 mg / ml di proteinasi K (Fig. 3C-D). Un segnale forte è stato ottenuto sia con 3 g / ml (Fig. 3E-F) e 5 mg / ml (Fig. 3G-H) proteinasi K. Poiché nessuna differenza apparente nella potenza del segnale è stato trovato quando con 5 mg / ml di proteinasi K rispetto a 3 mg / ml, abbiamo scelto di utilizzare 3 mg / ml nel nostro protocollo. E &#39;probabile che la necessità di una concentrazione più alta proteinasi K in P. abies coni maschio rispetto alla A. thaliana e B. napus gemme floreali è dovuto al tessuto più compatto, con livelli più elevati di composti fenolici e polisaccaridi. Durante la fissazione e di inclusione delle differenze tra la A. thaliana / B. napus protocollo e la P. abies protocollo sono evidenti. Il tessuto di interesse è fissato per fornire ritenzione RNA e questo è un passo fondamentale in quanto materiali poco fisso potrebbe dare un segnale basso o non rilevabili, anche se l&#39;mRNA è molto abbondante. Il tessuto è disidratato, cancellato e incorporati in cera a cambiamenti graduali per evitare danni ai tessuti, e in alcuni protocolli di NaCl 0,85% viene aggiunto l&#39;etanolo nella disidratazione per evitare ulteriori ritiro e rigonfiamento delle cellule 3. Il passo disidratazione durante embedding possono essere eseguite su ghiaccio per mantenere l&#39;attività RNAsi al minimo. Nel P. abies protocollo la soluzione al 4% paraformaldeide fix contiene 0,25% glutaraldeide, che dovrebbe dare una migliore ritenzione RNA 17, anche se alcuni sostengono che probabilmente non fa differenza 3. Dopo sezionare il materiale è fissato su diapositive e pretrattati (cioè deparaffinati, reidratato, permeabilizzate, trattato per ridurre legame non specifico della sonda e, infine, disidratati) prima della ibridazione. Nel protocollo presentato qui la procedura di rilevamento intero può essere eseguita nei laboratori ordinari, il segnale di solito si sviluppa entro 1-3 giorni e il rapporto tra il segnale su sfondo può essere continuamente monitorato. Il DIG-sonde marcate di solito danno un segnale più distinti rispetto ai radioattivo sonde marcate, sono più stabili e possono essere riutilizzati in esperimenti consecutivi. D&#39;altra parte, la sensibilità è ridotta rispetto alle sonde radioattive 17. Ibridazione in situ rileva espressione utilizzando una sonda marcata specifica per un determinato mRNA. Radio-etichettatura è un metodo di etichettatura affidabile e sensibile, ma richiede una gestione della radioattività e ci vogliono diverse settimane prima che i risultati possono essere rilevati. Antigene-sonde marcate invece, sono più stabili, meno pericolosi e richiedono l&#39;esposizione al mezzo di rilevazione per pochi giorni solo 17. Così, antigene-etichettatura metodi sono attualmente dominante. La fase più critica a prescindere dal protocollo è il design della sonda. Si deve prestare attenzione per assicurarsi che la sonda ha una alta specificità ed è etichettata con UTPs di alta qualità. A volte l&#39;ibridazione di temperatura e / o la lunghezza di reazione devono essere adattati per sonde specifiche. Il nostro protocollo modificato sulla base di DIG-sonde marcate faciliterà la localizzazione di espressione di mRNA contemporaneamente in specie che vanno da A. thaliana a P. abies, e con piccole modifiche dovrebbero essere utilizzabili in altre specie di piante. Il protocollo ha, accanto coni maschili, anche stato testato su diverse fasi di germogli vegetativi e in entrambi i zigotico embrioni somatici e da P. abies con buoni risultati (risultati non pubblicati;. Karlgren et al).

<table><tbody><tr><td>Anidride acetica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404-200ml</td><td>minimo 98%</td></tr><tr><td>Acrylamide, lineare</td><td>Ambion</td><td>9520</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi anti-DIG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>Roche Group</td><td>11 175 041 910 o 11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50g</td><td>minimo 98%</td></tr><tr><td>Formammide deionizzata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Denhardt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532-5ml</td><td></td></tr><tr><td>DEPC, dietilpirocarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per etichettatura RNA DIG (SP6/T7)</td><td>Roche Group</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide (25%)</td><td>Histolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Ambion</td><td>9510G</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear II</td><td>Histolab</td><td></td><td>È possibile utilizzare Tissue-clear, Histoclear II, xilene o un prodotto simile durante l'inclusione del tessuto.</td></tr><tr><td>Histowax</td><td>Histolab</td><td></td><td>Per l'inclusione possono essere utilizzati Histowax o Paraplast.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1kg</td><td>Per l'inclusione possono essere utilizzati Histowax o Paraplast.</td></tr><tr><td>Phusion&amp;#8482; High-Fidility DNA Polymerase</td><td>Finnzymes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Probe-on Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5mg</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-clear</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>È possibile utilizzare Tissue-clear, Histoclear II, xilene o un prodotto simile durante l'inclusione del tessuto.</td></tr><tr><td>Trietanolammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1377-100ml</td><td>minimo 98%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>utilizzare il prodotto standard del laboratorio</td><td></td><td>Utilizzare uno o entrambi i prodotti: Triton X-100 e Tween-20.</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83853-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>utilizzare il prodotto standard del laboratorio</td><td></td><td>Utilizzare uno o entrambi i prodotti: Triton X-100 e Tween-20.</td></tr><tr><td>Western Blue</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non radioattivo in situ protocollo di ibridazione applicabile per la norvegia abete e una serie di specie di piante

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Le tecnologie high-throughput analisi di espressione oggi disponibili agli scienziati un overflow dei profili di espressione, ma la loro risoluzione in termini di espressione tessuto specifica è limitato a causa di problemi nella dissezione dei tessuti individuali. Dati di espressione deve essere confermata e integrata con i modelli di espressione utilizzando ad esempio di ibridazione in situ, una tecnica utilizzata per localizzare cellula specifica espressione di mRNA. Il metodo di ibridazione in situ è faticoso, richiede tempo e spesso richiede l&#39;ottimizzazione estese a seconda della specie e dei tessuti. Negli esperimenti in situ sono relativamente più difficili da eseguire in specie legnose come la Norvegia conifere abete rosso (Picea abies). Qui vi presentiamo una DIG modificato nel protocollo ibridazione in situ, che è veloce e applicabile su una vasta gamma di specie vegetali tra cui P. abies. Con solo alcuni aggiustamenti, tra cui alterato RNasi trattamento e la concentrazione proteinasi K, si potrebbe utilizzare il protocollo per lo studio dell&#39;espressione tessuto specifica di geni omologhi in organi riproduttivi maschili di una gimnosperme e due specie di angiosperme; P. abies, Arabidopsis thaliana e Brassica napus. Il protocollo ha lavorato altrettanto bene per la specie e geni studiati. AtAP3 e BnAP3 sono state osservate negli organi spirale secondo e terzo floreali in A. thaliana e B. napus e DAL13 in microsporophylls di coni maschio da P. abies. Per P. abies la concentrazione proteinasi K, usato per permeablize i tessuti, doveva essere aumentata a 3 g / ml invece di 1 g / ml, forse a causa di tessuti più compatti e più elevati livelli di composti fenolici e polisaccaridi. Per tutte le specie il trattamento RNAsi è stato rimosso a causa della ridotta potenza del segnale senza un corrispondente aumento della specificità. Confrontando pattern di espressione di specifici tessuti omologhi geni di entrambi piante da fiore e un albero di conifere dimostriamo che il DIG in situ protocollo presentato qui, con solo piccoli aggiustamenti, può essere applicato a una vasta gamma di specie vegetali. Quindi, il protocollo evita sia l&#39;ottimizzazione vasta specie specifico e l&#39;uso di sonde laborioso radioattivo a favore di sonde DIG etichettati. Abbiamo scelto di illustrare i passaggi tecnicamente impegnativo del protocollo nel nostro film. Anna Karlgren e Jenny Carlsson contribuito in maniera uguale a questo studio. Autori corrispondenti: Anna Karlgren a Anna.Karlgren @ ebc.uu.se e Jens Sundström F. a Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Descriviamo un DIG modificato<em&gt; In situ</em&gt; Protocollo di ibridazione, che è veloce e applicabile su una vasta gamma di specie vegetali tra cui la Norvegia abete rosso. Con solo alcuni aggiustamenti, tra cui alterato RNasi trattamento e la concentrazione proteinasi K, il protocollo può essere utilizzato negli studi di diversi tessuti e specie.

Non radioattivo In situ Protocollo di ibridazione applicabile per la Norvegia Abete e una serie di specie di piante

Le tecnologie di analisi dell'espressione ad alta produttività oggi disponibili forniscono agli scienziati un eccesso di profili di espressione, ma la loro risoluzione in termini di...

Protocollo di ibridazione in situ non radioattiva applicabile alla picea abete rosso e a una vasta gamma di specie vegetali. Carre Etal. Ciao, mi chiamo AM GaN e lavoriamo presso l'Università OBS e la Swedish University of Agricultural Sciences a Uppsala, Svezia.Abbiamo stabilito un protocollo di visita insettivora che funziona su diverse specie vegetali. Oggi vi mostreremo alcuni passaggi impegnativi. In questo protocollo, vi illustreremo l'inclusione, il taglio in sezioni e le diverse fasi dell'esperimento di visita insettivora.Andiamo al laboratorio Uno, fissazione e inclusione, passaggi da nove a undici del protocollo. Passaggio nove, preriscaldare le piastre di Petri e gli stampi a 60 gradi centigradi. Passaggio dieci, riscaldare una coppia di pinzette e distribuire i tessuti uniformemente in una piastra.Aggiungere ulteriore paraffina istologica in modo da coprire i tessuti. Passaggio 11: lasciare solidificare la paraffina a temperatura ambiente. Due passaggi sessuali da 12 a 19 nel protocollo.Accendere le piastrine riscaldanti e tenere a disposizione paraffina istologica fusa. Prelevare i campioni dalla stanza fredda. Passaggio 13: utilizzare un bisturi per tagliare con attenzione un blocco di tessuto in paraffina.Modellare il campione per facilitare il taglio. Passo 14: riscaldare il blocco a freddo e fondere insieme il tallone. Lasciare solidificare il preparato a quattro gradi centigradi.Passo 15, tagliare il blocco di paraffina in sezioni spesse da sei a otto micrometri. Utilizzando un microtomo, le sezioni sono collegate in un'unica striscia lunga. Tagliare la striscia e trasferirla sulla carta.A questo punto, è possibile esaminare le singole sezioni al microscopio stereoscopico per selezionare le sezioni di interesse. Sarà facile eseguire un'ispezione con tessuti o colorati con eosina. Passo 17: aggiungere acqua Milli Q libera da RNA sui vetrini.Tagliare il nastro in pezzi più piccoli e posizionarli sui vetrini. Spostare i vetrini sulla piastra riscaldata. Passaggio 17: lasciare appiattire i nastri su una piastra a 42 gradi centigradi per uno o due minuti.Svuotare l'acqua utilizzando l'olio Kim. Passaggio 19, incubare i vetrini a 42 gradi centigradi per tutta la notte in modo che i tessuti aderiscano ai vetrini per l'ibridazione in situ 4.1 nella sezione in-situ. Passaggi di pre-trattamento da 36 a 48 nel protocollo.Passaggio 36: sezioni depa nello strato istologico. I vetrini sono disposti in modo uniforme e posizionati in una rastrelliera per facilitare lo spostamento tra contenitori diversi, disidratando le sezioni. In una serie di etanolo, aggiungere anidride acetica mescolando vigorosamente.Passaggio 45, preparazione per il trattamento con anidride acetica 4.2 di ibridazione in situ. Passaggi da 49 a 52 in un protocollo. Passaggio 51, invecchiamento dei vetrini Pro One Plus.La soluzione è viscosa. Cerchi di evitare bolle. Incubare i vetrini in una camera umidificata.4.3 iniz. Dopo l'ibridazione, passaggi da 53 a 72 nel protocollo. Passaggio 62, incubare i vetrini con il blocco di burer in un contenitore di plastica.Passaggio 63, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione bloccante per coprire appena i vetrini. Gli anticorpi vengono aggiunti sui vetrini mediante incubazione. L'incubazione funziona solo con vetrini ProBonn Plus. Per vetrini di disegno simile, passaggio 65, lasciare che le forze capillari risucchino la soluzione di anticorpo anti-digossigenina.Questo passaggio viene ripetuto. Passaggio 70, come in precedenza, inserire a sandwich e aspirare la soluzione blu Western. Notare che la soluzione blu Western viene aspirata due volte, proprio come abbiamo fatto per la soluzione dell'anticorpo anti dig.E al passaggio 65, passaggio 71 incubare i vetrini al buio per uno a cinque giorni. A temperatura ambiente, il monitoraggio dei segnali di ibridazione può essere effettuato al microscopio stereoscopico. Mentre i vetrini sono ancora accoppiati, dovrebbe essere possibile osservare macchie di colore viola a marroncino.Questo è l'aspetto dei risultati effettivi dell'esperimento condotto nella stazione CW. È possibile osservare il segnale qui come una colorazione viola o marroncina.

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Impara un protocollo di ibridazione in situ DIG non radioattivo per l'espressione genica in diverse specie vegetali, incluso l'abete rosso norvegese. Questo metodo offre un'analisi rapida e riproducibile dei tessuti.

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