Durata pannello misura replicazione in lievito

Il lievito in gemmazione Croce Visi è stato ampiamente utilizzato per studiare la biologia dell'invecchiamento. In questo articolo, presentiamo un protocollo generale per misurare la durata della vita replicativa delle cellule madri di lievito. Ciao, sono Kristen Steffen del laboratorio di Brian Kennedy del Dipartimento di Biochimica dell'Università di Washington.

Oggi vi mostreremo un procedimento per misurare la durata della vita replicativa delle cellule madri di lievito. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i geni che influenzano la durata della vita delle cellule di lievito. Cominciamo dunque.

Per l'esperimento sulla durata della vita replicativa e per la preparazione delle cellule di lievito per l'analisi della longevità, è necessario preparare piastre solide di YEPD. Utilizzare un'adeguata tecnica asettica per preparare queste piastre di agar YEPD. Preparare almeno due piastre per ogni quattro-cinque ceppi da analizzare nell'esperimento sulla durata della vita.

Queste piastre devono essere preparate almeno due giorni prima dell'esperimento sulla durata della vita e devono essere lasciate asciugare prima di iniziare il saggio di longevità. Se l'esperimento non verrà eseguito entro quattro o cinque giorni dal versamento delle piastre, queste devono essere avvolte con pellicola parafilm o plastica e collocate in un incubatore refrigerato per prevenire la disidratazione. Rimuovere i ceppi di lievito dalle colture congelate e seminare per ottenere colonie singole.

Sulle piastre di agar YEPD. Fino a sei ceppi possono essere seminati facilmente sulla stessa piastra YEPD dividendo la piastra in settori uguali a forma di spicchio. Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per due giorni.

Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatore e trasferire le cellule da una singola colonia su una nuova piastra YEPD. A questo punto, i ceppi da analizzare devono essere rivestiti per garantire che l'esperimento sulla durata della vita replicativa venga eseguito in cieco, in modo che i responsabili della dissezione non conoscano l'identità dei singoli ceppi.

In seguito, incubare le cellule rivestite con macchia a 30 gradi Celsius fino alla sera successiva. Rimuovere le cellule e applicare leggermente le cellule da ciascun ceppo rivestito su piastre YEPD fresche. Queste fungeranno da piastre sperimentali utilizzate per la durata della vita replicativa.

Le cellule per l'analisi devono essere depositate lungo una linea verticale sul lato sinistro della piastra YEPD. Non trasferire troppe cellule su una singola piastra YEPD fresca. Poiché ciò causerebbe una crescita eccessiva delle cellule durante l'incubazione notturna e influenzerebbe il loro ciclo vitale replicativo, sono ottimali circa da tre a cinque patch per piastra.

Supponendo che l'analisi della durata della vita replicativa venga eseguita su 20 cellule provenienti da ciascuna coltura, ora l'esperimento sulla durata della vita è completamente allestito e non resta altro da fare che un'incubazione notturna a temperatura ambiente. Poi, domani, potremo iniziare la microdissezione per posizionare le cellule di lievito sulla piastra e ottenere cellule figlie vergini, per l'analisi della durata della vita replicativa.

Utilizzare un microscopio dotato di un apparato di microdissezione adatto ai lieviti. Trasferire circa 50 cellule dal ceppo della prima colonia in una posizione della piastra distale rispetto alle cellule inoculate. Se il tavolino del microscopio è graduato, è possibile utilizzare queste graduazioni per garantire che le cellule siano facilmente individuabili durante le iterazioni successive.

A volte le cellule possono rimanere intrappolate nell'ago, il che può rappresentare un problema se fuoriescono nel momento sbagliato. Per assicurarsi che l'ago sia pulito e privo di cellule, toccare ripetutamente la superficie dell'agar. Successivamente, creare un foro nell'agar forzando il passaggio dell'ago attraverso la superficie dell'agar.

Questo foro fungerà da marcatore per orientarvi sulla piastra durante le successive iterazioni di dissezione e rimozione delle cellule dotter. Fare attenzione a non far entrare cellule di lievito nel foro, altrimenti cresceranno e formeranno una colonia direttamente sopra il foro. Allineare verticalmente le singole cellule di lievito in 20 posizioni equidistanti, con una distanza di uno a tre diametri dell'ago tra ciascuna posizione cellulare.

Per ogni paio di cellule, posizionare due cellule l'una accanto all'altra nella stessa posizione della linea anziché una sola. Questo consente una ridondanza durante la selezione delle cellule figlie vergini. Se una delle cellule trasferite non si divide tra la 10ª e la 11ª posizione della linea, creare una serie orizzontale di sette-otto fori nell'agar.

Questo servirà come marcatore per orientarvi sulla piastra durante le dissezioni successive e la rimozione delle cellule figlie. Ancora una volta, fare attenzione a non far entrare cellule di lievito nei fori, altrimenti cresceranno e formeranno una colonia. Ripetere questa procedura per ogni area sulla piastra, continuando a disporre le cellule verticalmente lungo lo stesso asse.

È importante ricordare che, quando si crea il foro nell'AER, il numero di fori realizzati deve corrispondere al numero della patch, in modo da avere un foro per la prima patch e due fori per la seconda. Una volta che le cellule sono state disposte per ciascuna patch, sigillare la piastra con pellicola trasparente e incubare a 30 gradi Celsius per circa due ore. Ricordare che, da questo momento in poi, tutte le piastre devono essere sigillate con pellicola trasparente, tranne durante la dissezione.

Per evitare la disidratazione, ripetere questa procedura per ogni piastra nell'esperimento. Per l'analisi della durata della vita, è fondamentale assicurarsi che ogni cellula parta come cellula figlia vergine.

Per fare ciò, in primo luogo rimuovere le piastre dall'incubatrice e verificare che la maggior parte delle cellule dell'array abbia subito una divisione cellulare. Quello che abbiamo qui sono cellule che erano state precedentemente allineate, e si può osservare che, dopo due ore in incubatrice, hanno iniziato a dividersi. Ora abbiamo una cellula madre, quella più grande, attaccata al suo corpo, la cellula figlia vergine, e questa cellula figlia vergine è la cellula che verrà utilizzata per iniziare il ciclo di vita.

Se è necessario ulteriore tempo per consentire il completamento delle divisioni cellulari, riposizionare la piastra nell'incubatrice. Partendo dalla prima cellula dell'array, utilizzare l'ago per staccare le cellule figlie dalla cellula madre posizionando delicatamente l'ago sulla parte superiore delle cellule aderenti.

A volte è utile dare dei colpetti sul lato della base del microscopio mentre l'ago è appoggiato sulle cellule. Successivamente, posizionare la cellula figlia staccata sulla linea verticale di cellule, sostituendo la cellula madre e qualsiasi altra cellula figlia, spostando temporaneamente da parte queste ultime. Ripetere questi passaggi per ciascuna delle cellule dell'array.

Se una cellula non si divide, prelevare una cellula figlia da una delle cellule ridondanti posizionate accanto alla cellula in esame. Al termine, si dovrebbero avere 20 cellule figlie per ciascuna coltura, allineate verticalmente sulla piastra per l'analisi della durata di vita. Raccogliere tutte le cellule madri e le cellule figlie in eccesso in un mucchio e trasferirle nuovamente in un'area vicina alle colture denominata cimitero.

È importante mantenere le cellule indesiderate lontane dalle cellule sottoposte ad analisi della durata della vita per prevenire la formazione di microcoloni e l'esaurimento dei nutrienti locali. Una volta che le cellule sono state separate, spostarle dalla piastra e incubarle a 30 gradi Celsius per circa due ore. Ripetere questi passaggi per ogni piastra nell'esperimento.

Per misurare la capacità replicativa di singole cellule, sarà necessario preparare schede di dati sulla durata della vita. Una scheda di dati sulla durata della vita può essere una semplice griglia in cui ogni riga corrisponde a una singola cellula madre e ogni colonna corrisponde a un punto d'età. Assicurarsi di etichettare ogni scheda dati in base al numero di ceppi da analizzare.

Per iniziare, rimuovere innanzitutto le piastre dall'incubatrice e verificare che la maggior parte delle cellule dell'array abbia subito almeno una divisione cellulare. Se è necessario ulteriore tempo per completare la divisione cellulare, reinserire la piastra nell'incubatrice. Iniziare dalla prima cellula dell'array sulla prima piastra e osservare visivamente la cellula madre e la cellula o le cellule figlie per determinare il numero di divisioni cellulari avvenute.

È generalmente facile determinare quante cellule figlie una cellula madre ha prodotto in base a schemi caratteristici di disposizione delle cellule. In questo caso è particolarmente semplice capire quante cellule sono state prodotte, poiché ce ne sono due, di dimensioni uguali tra loro e più piccole rispetto alla cellula madre. Registrare il numero di cellule figlie prodotte dalla cellula madre nel riquadro appropriato del foglio di valutazione della durata della vita.

Successivamente, utilizzare l'ago per staccare le cellule figlie dalla cellula madre come descritto in precedenza, posizionando delicatamente l'ago sopra le cellule attaccate e picchiettando il lato della base del microscopio mentre l'ago è a contatto con le cellule. Mantenere la cellula madre nella sua posizione lungo la linea verticale e spostare temporaneamente da parte la o le cellule figlie. Ripetere questi passaggi per ciascuna delle cellule dell'array.

Infine, raccogliere tutte le cellule figlie scartate e trasferirle nel cimitero situato vicino alle colonie originali. Sigillare la piastra con pellicola parafilm e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre ore. Ripetere lo scarto delle cellule figlie e l'incubazione.

Passo per ogni piastra nell'esperimento. Ripetere l'intera procedura fino a quando tutte le cellule madri non hanno smesso di dividersi. Tenere presente che, con l'invecchiamento delle cellule madri, la progressione del ciclo cellulare diventa più lenta e sarà opportuno incubare la piastra per periodi di tempo più lunghi tra un punto d'età e l'altro; successivamente, le piastre possono essere mantenute a quattro gradi Celsius durante la notte.

I dati grezzi prodotti da un esperimento sul ciclo di vita replicativo consistono in un elenco di numeri corrispondenti alle cellule figlie prodotte da ciascuna cellula madre a ogni punto d'età. Come mostrato qui. Sommando ogni riga del foglio dei punteggi, si ottiene il ciclo di vita replicativo per ciascuna cellula madre.

I dati provenienti da altre cellule dello stesso gruppo sperimentale possono essere raggruppati per generare una curva di sopravvivenza e per eseguire calcoli statistici. La curva dovrebbe essere approssimativamente coerente con la cinetica di Gompertz-Makeham, mostrando una forma sigmoidale con una bassa mortalità iniziale, seguita da un declino relativamente rapido della sopravvivenza e da un appiattimento della curva in età avanzate. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un esperimento sulle durata media di replicazione del lievito.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le cellule continueranno a dividersi ogni volta che non si trovano al freddo. Ricordarsi quindi di mettere le piastre a quattro gradi durante la notte, in modo da non ritrovarsi con troppe cellule figlie da contare la mattina successiva. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.