Durata pannello misura replicazione in lievito

Il lievito in gemmazione Croce Visi è stato ampiamente utilizzato per studiare la biologia dell'invecchiamento. In questo articolo, presentiamo un protocollo generale per misurare la durata della vita replicativa delle cellule madri di lievito. Ciao, sono Kristen Steffen del laboratorio di Brian Kennedy nel Dipartimento di Biochimica dell'Università di Washington.

Oggi vi mostreremo una procedura per misurare la durata della vita replicativa delle cellule madri di lievito. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i geni che influenzano la durata della vita delle cellule di lievito. Quindi iniziamo.

Per l'esperimento replicativo della durata della vita e la preparazione delle cellule di lievito per l'analisi della durata della vita, è necessario preparare piastre YEPD solide per fare ciò. Utilizzare una tecnica sterile appropriata per preparare queste piastre per agar YEPD. Preparare almeno due piastre per ogni quattro o cinque ceppi da analizzare nell'esperimento sulla durata della vita.

Queste piastre devono essere preparate almeno due giorni prima dell'esperimento sulla durata della vita e lasciate asciugare prima di iniziare il saggio sulla durata della vita. Se l'esperimento non avrà luogo entro quattro o cinque giorni dal versamento delle piastre, queste devono essere avvolte in pellicola di para o plastica e poste in un incubatore refrigerato per evitare l'essiccazione. Rimuovere i ceppi di lievito dai ceppi congelati e striare per le singole colonie.

Sulle piastre di agar YEPD. È possibile striare facilmente fino a sei ceppi sulla stessa piastra YEPD suddividendo la piastra in cunei a forma di torta di uguali dimensioni. Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per due giorni.

Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatrice e applicare il cerotto alle cellule di una singola colonia su una nuova piastra YEPD. A questo punto, i ceppi da analizzare devono essere rivestiti per garantire che l'esperimento di durata della vita replicativa venga eseguito alla cieca. Dove i dissettori non conoscono l'identità dei singoli ceppi. Catene.

Quindi, incubare le cellule rivestite a 30 gradi Celsius fino alla sera successiva. Rimuovere le cellule e applicare leggermente il patch alle cellule di ciascun ceppo rivestito su piastre YEPD fresche. Queste serviranno come piastre sperimentali utilizzate per la durata della vita replicativa.

Le celle di analisi devono essere applicate lungo una linea verticale sul lato sinistro della piastra YEPD. Non trasferire troppe cellule su un'unica piastra YEPD fresca. Poiché ciò causerà una crescita densa delle cellule durante l'incubazione notturna e influenzerà la loro durata replicativa, circa tre o cinque cerotti per piastra sono ottimali.

Supponendo che l'analisi replicativa della durata della vita venga eseguita su 20 cellule di ciascun cerotto, ora l'esperimento della durata della vita è tutto pronto e tutto ciò che devono fare è incubare durante la notte sul banco. E poi domani possiamo iniziare la micro dissezione Per posizionare le cellule di lievito sulla piastra e ottenere cellule figlie vergini. Per l'analisi replicativa della durata di vita.

Utilizzare un microscopio dotato di un apparecchio di microdissezione adatto al lievito. Trasferire circa 50 cellule dal primo ceppo di patch in una posizione sulla piastra distale alle cellule patched. Se il tavolino del microscopio è classificato, queste gradazioni possono essere utilizzate per garantire che le cellule siano facili da trovare durante le iterazioni successive.

A volte le cellule possono rimanere bloccate nell'ago, il che può essere un problema se escono nel momento sbagliato. Per assicurarsi che l'ago sia pulito e privo di cellule, toccarlo ripetutamente con la superficie dell'agar. Quindi creare un foro nell'agar forzando l'ago attraverso la superficie dell'agar.

Questo foro servirà come marcatore per orientarti sulla piastra durante le successive iterazioni di dissezione e rimozione delle cellule di dotter. Fai attenzione a non far entrare le cellule di lievito nel buco, altrimenti cresceranno e formeranno una colonia direttamente sopra il buco. Allineare verticalmente le singole cellule di lievito in 20 posizioni equidistanti con uno o tre diametri dell'ago tra ogni posizione della cellula.

Per ogni poche celle, posiziona due celle una accanto all'altra nella stessa posizione nella linea anziché una. Ciò consente la ridondanza durante la selezione delle cellule figlie vergini. Se una delle celle trasferite non riesce a dividersi tra la 10a e l'11a posizione della linea, creare una serie orizzontale di sette-otto fori nell'agar.

Questo servirà come marcatore per orientarti sulla piastra durante le successive dissezioni e rimozioni di cellule figlie. Ancora una volta, fai attenzione a non far entrare le cellule di lievito nei buchi o cresceranno e formeranno una colonia. Ripetere questa procedura per ogni cerotto sulla piastra, continuando a disporre le cellule verticalmente lungo lo stesso asse.

È importante ricordare che quando si crea il foro nell'AER è necessario che il numero di fori creati corrisponda al numero di patch in modo che ci sia un foro per la prima patch e due fori per la seconda. Una volta che le cellule sono state disposte per ogni cerotto, paraformare la piastra e incubare a 30 gradi Celsius per circa due ore. Ricorda, da questo punto in poi, tutte le lastre dovrebbero essere parafilmate tranne quando vengono sottoposte a dissezione.

Per evitare l'essiccazione, ripetere questa procedura per ogni piastra. Nell'esperimento. Per l'analisi della durata della vita, è importante essere sicuri che ogni cellula inizi come una cellula figlia vergine.

Per fare ciò, per prima cosa, rimuovi le piastre dall'incubatore e verifica che la maggior parte delle cellule dell'array abbia subito una divisione cellulare. Quindi quello che abbiamo qui sono cellule che sono state allineate in precedenza, e potete vedere che dopo due ore nell'incubatrice, hanno iniziato a dividersi. E ora abbiamo una cellula madre, la più grande attaccata al suo corpo, la cellula figlia vergine, e quella cellula figlia vergine è una cellula che verrà utilizzata per iniziare la vita in avanti.

Se è necessario più tempo per consentire il completamento delle divisioni cellulari, rimettere la piastra nell'incubatore. A partire dalla prima cella dell'array. Utilizzare l'ago per staccare le cellule figlie dalla cellula madre posizionando delicatamente l'ago sopra le cellule attaccate.

A volte è utile picchiettare il lato della base del microscopio mentre l'ago è appoggiato sulle cellule. Quindi, posiziona la cella figlia staccata nella linea verticale di celle, sostituendo la cella madre e tutte le cellule figlie aggiuntive e spostandole temporaneamente da parte. Ripetere questi passaggi per ciascuna delle celle dell'array.

Se una cella non riesce a dividersi, prelevare una cellula figlia da una delle celle ridondanti posizionate accanto alla cella di test. Al termine, dovresti avere 20 celle figlie per ogni cerotto allineate verticalmente sulla piastra della durata della vita. Raccogli tutte le cellule madri e le cellule figlie extra in una pila e trasferiscile di nuovo in un'area vicino alle macchie chiamata cimitero.

È importante tenere le cellule indesiderate lontane dalle cellule sottoposte ad analisi della durata della vita per prevenire la formazione di micro colonie e l'esaurimento dei nutrienti locali. Una volta separate le cellule, parare dalla piastra e incubare a 30 gradi Celsius per circa due ore. Ripeti questi passaggi per ogni piastra dell'esperimento.

Per misurare la capacità replicativa delle singole cellule, è necessario preparare le schede tecniche della durata della vita. Un foglio dati sulla durata della vita può essere una semplice griglia in cui ogni riga corrisponde a una singola cellula madre e ogni colonna corrisponde a un punto di età. Assicurati di etichettare ogni scheda tecnica in base al numero di ceppi da analizzare.

Per iniziare, per prima cosa, rimuovi le piastre dall'incubatore e verifica che la maggior parte delle cellule dell'array abbia subito almeno una divisione cellulare. Se è necessario più tempo per consentire il completamento della divisione cellulare, rimettere la piastra nell'incubatore. Inizia con la prima cella dell'array sulla prima piastra e osserva visivamente la madre e la figlia, la cellula o le cellule per determinare il numero di divisioni cellulari che si sono verificate.

In genere è facile determinare quante cellule figlie una madre ha prodotto in base a modelli caratteristici di disposizione cellulare. Questo è davvero semplice da vedere quante cellule ha prodotto perché ce ne sono due e hanno le stesse dimensioni e sono entrambe più piccole della madre. Registrare il numero di cellule figlie prodotte dalla cellula madre nell'apposita casella del foglio di valutazione della durata della vita.

Quindi, utilizzare l'ago per staccare le cellule figlie dalla cellula madre come descritto in precedenza, posizionando delicatamente l'ago sopra le cellule attaccate e picchiettando il lato della base del microscopio mentre l'ago è appoggiato sulle cellule. Mantieni la cellula madre nella sua posizione sulla linea verticale e sposta temporaneamente da parte la cellula o le celle figlie. Ripetere questi passaggi per ciascuna delle celle dell'array.

Infine, raccogli tutte le celle figlie scartate e spostale nel cimitero situato vicino alle macchie originali. Filmare la piastra e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre ore. Ripetere lo scarto delle cellule figlie e l'incubazione.

Passaggio per ogni piatto nell'esperimento. Ripeti l'intera procedura fino a quando tutte le cellule madri hanno smesso di dividersi. Tieni presente che man mano che le cellule madri invecchiano, la progressione del ciclo cellulare diventa più lenta e sarà desiderabile incubare la piastra per periodi di tempo più lunghi tra i punti di età in seguito, le piastre possono essere posizionate a quattro gradi Celsius durante la notte.

I dati grezzi prodotti da un esperimento replicativo sulla durata della vita sono un elenco di numeri corrispondenti alle cellule figlie prodotte da ciascuna cellula madre in ogni punto di età. Come si vede qui. Sommando ogni riga del foglio di punteggio, si ottiene la durata della vita replicativa per ciascuna cellula madre.

I dati provenienti da altre cellule dello stesso gruppo sperimentale possono essere raggruppati per generare una curva di sopravvivenza ed eseguire calcoli statistici. La curva dovrebbe essere approssimativamente coerente con la cinetica di Gomperts Macam, mostrando una forma sigmoidale con bassa mortalità precoce, seguita da un declino relativamente rapido della sopravvivenza e da un appiattimento della curva in età successive. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire un esperimento di durata della vita replicativa del lievito.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le cellule continueranno a dividersi ogni volta che non sono al freddo. Quindi ricordati di mettere le piastre a quattro gradi durante la notte in modo da non ritrovarti con troppe cellule figlie da contare al mattino. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.