Name: Durata pannello misura replicazione in lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Impara a misurare la durata della vita replicativa nelle cellule madri di lievito Saccharomyces cerevisiae. Questo protocollo consente di studiare i meccanismi dell'invecchiamento cellulare e i fattori genetici che influenzano la longevità.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di MK e BKK dal Ellison Medical Foundation. MK è una Ellison Medical Foundation Scholar Nuove invecchiamento. Vorremmo ringraziare Soumya Kotireddy per l&#39;assistenza durante le riprese.

Parte 1: Preparare i ceppi e le piastre per l&#39;analisi del ciclo di vita replicativa Questa sezione descrive la preparazione delle lastre solide YEPD per l&#39;uso nella sperimentazione durata replicativa vita e la preparazione di cellule di lievito per l&#39;analisi durata della vita. <ol><li> Utilizzando opportuni tecnica sterile, preparare piastre di agar YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% agar, 2% di glucosio) che verrà utilizzato per la coltura e le cellule di lievito per l&#39;analisi durata replicativo. Si dovrebbe preparare almeno 2 piastre per ogni 4-5 ceppi da analizzare nell&#39;esperimento durata della vita. Piastre devono essere preparate almeno 2 giorni prima dell&#39;esperimento durata della vita e lasciato asciugare prima di iniziare il saggio durata della vita. Se l&#39;esperimento non sarà avviata entro 4-5 giorni di versare le piastre, devono essere collocati in un incubatore refrigerato e avvolto in parafilm o plastica per evitare essiccazione. </li><li> Rimuovere ceppi di lievito da scorte congelate e strisciare per singole colonie su piastre di agar YEPD. Fino a 6 ceppi possono essere facilmente striature sulla stessa piastra YEPD suddividendo il piatto in uguali dimensioni torta a forma di cunei. </li><li> Incubare le cellule a 30 ° C per 2 giorni. </li><li> Rimuovere le cellule dal termostato e le cellule patch da una singola colonia su un piatto fresco YEPD. Due patch da due colonie diverse deve essere generato per ogni ceppo. A questo punto, i ceppi da analizzare deve essere codificato per garantire la vita esperimento replicativo durata viene effettuato &quot;alla cieca&quot;, dove il dissettori non conoscono l&#39;identità dei singoli ceppi. </li><li> Incubare le patch, le cellule codificati a 30 ° C fino alla sera successiva. </li><li> Rimuovere le cellule e leggermente cellule patch da ogni ceppo codificato a fresco piatti YEPD, che servirà come le piastre sperimentali utilizzati per l&#39;analisi durata replicativa vita. Le cellule devono essere patchato lungo una linea verticale sul lato sinistro del piatto YEPD (Figura 1). Circa 3-5 patch per ciascuna piastra è ottimale, assumendo vita analisi replicativa durata di 20 celle da ogni patch. Non è necessario (né auspicabile) per trasferire un gran numero di cellule al piatto fresco YEPD, come questo farà sì che le cellule a crescere abbondantemente durante la notte di incubazione, che può limitare la loro durata di vita successive replicativo. </li><li> Incubare le piastre appena patchato durante la notte sulla cima panchina. </li></ol> Parte 2: le cellule di posizione per l&#39;analisi del ciclo di vita replicativa. In questa sezione viene descritto come posizionare le cellule di lievito sul piatto e come ottenere cellule figlie vergini per l&#39;analisi del ciclo di vita replicativa. Da questo punto in poi, tutte le lastre devono essere parafilmed, tranne quando sottoposti a dissezione, per evitare essiccazione. <ol><li> Utilizzando un microscopio dotato di un apparato adatto per microdissezione lievito, il trasferimento di circa 50 cellule dal ceppo prima patch ad una posizione sul piatto distale alle cellule patch. Se il vostro stadio è classificato microscopio, queste gradazioni possono essere utilizzate per garantire le cellule saranno facili da trovare durante le iterazioni successive. Sul Axioscope Zeiss 40, le cellule del ceppo prima patch può essere posizionato in corrispondenza delle coordinate 90 x 10 e disposte in verticale da lì. </li><li> Pulire l&#39;ago di cellule ripetutamente di toccare la superficie di agar, quindi creare un buco nel agar forzando l&#39;ago attraverso la superficie di agar. Questo buco servirà come marcatore orientativa sul piatto durante iterazioni successive della dissezione e la rimozione delle cellule figlie. Fare attenzione a non ottenere cellule di lievito nel foro, o saranno crescere e formare una colonia. </li><li> Direttamente sopra il foro, allineare verticalmente singole cellule di lievito in 20 punti distribuiti uniformemente, con diametri di aghi 1-3 (~ 100 mM) tra ogni posizione delle cellule (Figura 1). Ogni poche cellule, luogo due celle adiacenti gli uni agli altri nella stessa posizione nella linea piuttosto che uno. Questo consente la ridondanza durante la selezione della cellula figlia vergine, se una delle celle trasferite non riesce a dividere. </li><li> Tra il 10 e 11 ° posizione in prima linea, creare una serie orizzontale di 7-8 fori nella agar. Questo servirà come marcatore orientativa sul piatto durante iterazioni successive della dissezione e la rimozione delle cellule figlie. Fare attenzione a non ottenere cellule di lievito nei fori, o saranno crescere e formare una colonia. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,4 per ogni patch sul piatto, continuando a celle di serie verticalmente lungo l&#39;asse stesso. Per il passaggio 2.2, il numero di fori creati deve corrispondere al numero di patch (una buca per la prima patch, due fori per il secondo, ecc.) </li><li> Una volta che le cellule sono stati schierati per ogni patch, parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per circa 2 ore. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,6 per ogni piastra nell&#39;esperimento. </li></ol> Parte 3: Ottenere cellule figlie vergini per l&#39;analisi durata della vita In questa sezione abbiamo iniziato l&#39;analisi durata della vita facendo in modo che ogni cellula inizia come una figlia verginecell. <ol><li> Rimuovere le piastre dal termostato e verificare che la maggior parte delle cellule schierati hanno subito una divisione cellulare. Se è necessario ulteriore tempo per consentire la divisione cellulare per essere completato, riportare la piastra per l&#39;incubatore. </li><li> A partire dalla prima cella schierati, utilizzare l&#39;ago a staccarsi cellule figlie dalla cellula madre con delicatezza mettendo l&#39;ago sulla parte superiore delle celle collegate. A volte è utile per toccare il lato della base microscopio mentre l&#39;ago è appoggiato sulle cellule. </li><li> Posizionare il cellulare staccato figlia in linea verticale, sostituendo la cellula madre e le cellule figlie aggiuntivi e spostarli temporaneamente da parte. </li><li> Ripetere il punto 3.2 e 3.3 per ognuna delle celle in serie. Se una cellula non riesce a dividere, prendere una cellula figlia da una delle celle ridondanti posizionato al punto 2.3. Al termine, si dovrebbe avere 20 cellule figlie per ogni patch allineati verticalmente sulla piastra di vita. </li><li> Raccogliere tutte le cellule madri e cellule figlie in più in un mucchio e trasferire di nuovo a una zona vicino le patch (&quot;il cimitero&quot;). E &#39;importante mantenere le cellule indesiderate lontano dalle cellule in fase di analisi durata di vita per prevenire la formazione di microcolonie e l&#39;esaurimento delle sostanze nutritive locale. </li><li> Parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per circa 2 ore. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per ogni piastra nell&#39;esperimento. </li></ol> Parte 4: misura la capacità replicativa delle singole cellule <ol><li> Preparare i dati di durata fogli. Una vita scheda può essere una semplice griglia dove ogni riga corrisponde ad una cellula madre individuo e ogni colonna corrisponde ad una età-punto (Figura 2). Etichetta ogni scheda in base al numero di ceppi da analizzare. </li><li> Rimuovere le piastre dal termostato e verificare che la maggior parte delle cellule schierati hanno subito almeno una divisione cellulare. Se è necessario ulteriore tempo per consentire la divisione cellulare per essere completato, riportare la piastra per l&#39;incubatore. </li><li> A partire dalla prima cella schierati sul piatto prima, visivamente osservare la cellula madre e figlia (s) e determinare il numero di divisioni cellulari che si sono verificati. In genere è facile determinare il numero di cellule figlie di una madre ha prodotto, sulla base di modelli caratteristici di accordi cellulare. Registrare il numero di cellule figlie prodotte dalla cellula madre nella apposita casella sulla scheda di valutazione durata della vita. </li><li> Utilizzare l&#39;ago a staccarsi cellule figlie dalla cellula madre come descritto al punto 3.2. </li><li> Conservare la cellula madre nella sua posizione nella linea verticale e spostare la cellula figlia (s) a temporaneamente da parte. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,5 per ciascuna delle cellule schierati. </li><li> Raccogli tutte le cellule figlie scartato e spostarli al &#39;cimitero&#39;, che si trova nei pressi della patch originale. </li><li> Parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per 2-3 ore. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,8 per ogni piastra nell&#39;esperimento. </li><li> Ripetere i passaggi 4,2-4,9 fino a quando tutte le cellule madre hanno smesso di dividersi. Come l&#39;età della madre cellule, la progressione del ciclo cellulare diventa più lento e sarà auspicabile incubare la piastra per lunghi periodi di tempo tra età-punti. Piastre possono essere posizionati a 4 ° C durante la notte. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante. I dati grezzi prodotti da un esperimento durata replicativa vita è un elenco di numeri corrispondenti alle cellule figlie prodotte da ogni cellula madre ad ogni età-punto (Figura 2). Sommando ogni riga del foglio di punteggio, la durata della vita di replicazione per ogni cellula madre si ottiene. Dati per le cellule madre dello stesso gruppo sperimentale possono essere raggruppati per generare una curva di sopravvivenza (Figura 3A) e di eseguire calcoli statistici, come la durata della vita media, la durata della vita media e deviazione standard. Un test non parametrico, come il rank-sum test di Wilcoxon, possono essere eseguite per determinare se le differenze significative nella durata della vita sono stati individuati tra i gruppi sperimentali. Quando l&#39;esperimento funziona correttamente, la curva di sopravvivenza dovrebbero essere grosso modo in linea con Gompertz-Makeham cinetica che mostra un shap sigmoidale con bassa mortalità precoce seguì un declino relativamente rapido in termini di sopravvivenza e un appiattimento della curva uno epoche successive. La maggior parte dei ceppi wild-type hanno replicativa valori di durata della vita nel range 20-30 generazione, anche se al di fuori di questo intervallo di variazione è stato riportato. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Schema di un tipico piatto vita replicativa. La sera prima dell&#39;inizio microdissezione di cellule di lievito, 3-5 ceppi sono leggermente patchato sulla superficie di una piastra YEPD (box rosso) in una linea verticale lungo un lato della piastra. Dopo una crescita durante la notte, circa 30 celle singole da ogni ceppo sono disposte verticalmente in una linea contenente 20 posizioni. Durata della vita l&#39;analisi dells sarà eseguita su v cellule figlie vergini ottenuti da queste cellule iniziali. Extra cellule ottenute da microdissezione durante l&#39;esperimento (ad esempio cellule figlie indesiderate) sono collocati nel &quot;cimitero&quot; (ovale grigio), che si trova lontano dalle celle sperimentali in modo da evitare l&#39;esaurimento locale di sostanze nutritive come colonie sono formate. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Una vita replicativa foglio durata riscontro. I dati grezzi da un esperimento durata replicativa vita è mostrato. Ogni riga corrisponde ad una singola cellula di lievito madre e ogni colonna corrisponde ad una età-point. Il numero inserito in ogni casella è il numero di cellule figlie prodotte da quella cellula madre a quell&#39;età-point. Ogni sforzo è etichettato con un numero codificato in modo tale che l&#39;individuo dissezionare le cellule di lievito non è a conoscenza dell&#39;identità dei ceppi analizzati. Venti cellule sono analizzati per ogni ceppo. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Rappresentante sopravvivenza e curve di crescita di un esperimento durata replicativa vita. (A) Le curve di sopravvivenza sono ottenuta riportando la frazione di cellule madre ancora in vita in funzione di età replicativa (numero di divisioni cellulari. (B) le curve di crescita sono ottenuta riportando la numero medio di cellule figlie prodotto da un ceppo dato in funzione di età-point. In questo esempio, ceppo # 2 è a lungo vissuto, ma è più lenta crescita, come dimostra la pendenza ridotta iniziale della trama di crescita.

<ol><li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+yeast+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).</li>
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<li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Peptone Bacto</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

durata pannello misura replicazione in lievito

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

L&#39;invecchiamento è un processo degenerativo caratterizzato da un progressivo deterioramento delle componenti cellulari e gli organelli con conseguente mortalità. Il lievito in erba<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; È stato ampiamente utilizzato per studiare la biologia dell&#39;invecchiamento, e alcuni fattori determinanti di longevità lievito hanno dimostrato di essere conservato negli eucarioti pluricellulari, tra cui vermi, mosche e topi<sup&gt; 1</sup&gt;. A causa della mancanza di facilmente quantificabile associate all&#39;età fenotipi, l&#39;invecchiamento nel lievito sono stati analizzati quasi esclusivamente misurando la durata della vita delle cellule in contesti diversi, con due diversi paradigmi durata nell&#39;uso comune<sup&gt; 2</sup&gt;. Durata cronologica si riferisce alla lunghezza del tempo che una cellula madre può sopravvivere in un non-divisione, quiescenza stato simile, e si propone di servire da modello per l&#39;invecchiamento della post-mitotico in cellule di eucarioti pluricellulari. Durata della vita replicativa, al contrario, si riferisce al numero di cellule figlie prodotte da una cellula madre prima della senescenza, ed è pensato per fornire un modello di invecchiamento nelle cellule mitoticamente attivo. Qui vi presentiamo un protocollo generalizzato per misurare la durata della vita di replicazione di cellule di lievito madre in erba. L&#39;obiettivo del test replicativa durata della vita è quello di determinare quante volte ogni cellula madre germogli. Le cellule madre e figlia possono essere facilmente distinguibili da un ricercatore esperto utilizzando un microscopio a luce standard (totale ingrandimento 160X), come il Axioscope Zeiss 40 o un altro modello comparabile. Separazione fisica delle cellule figlie dalle cellule madre è ottenuta utilizzando un micromanipolatore manuale dotato di una fibra ottica ago. Ceppi di lievito tipici di laboratorio 20-30 produrre cellule figlie per madre e una sperimentazione durata richiede 2-3 settimane.

In questo articolo vi presentiamo un protocollo generale per misurare la durata della vita di replicazione delle cellule di lievito madre.

Durata pannello misura replicazione in lievito

L'invecchiamento è un processo degenerativo caratterizzato da un deterioramento progressivo dei componenti cellulari e degli organelli che conduce alla mortalità. Il lievito a gemmazione...

Il lievito in gemmazione Croce Visi è stato ampiamente utilizzato per studiare la biologia dell'invecchiamento. In questo articolo, presentiamo un protocollo generale per misurare la durata della vita replicativa delle cellule madri di lievito. Ciao, sono Kristen Steffen del laboratorio di Brian Kennedy del Dipartimento di Biochimica dell'Università di Washington.Oggi vi mostreremo un procedimento per misurare la durata della vita replicativa delle cellule madri di lievito. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i geni che influenzano la durata della vita delle cellule di lievito. Cominciamo dunque.Per l'esperimento sulla durata della vita replicativa e per la preparazione delle cellule di lievito per l'analisi della longevità, è necessario preparare piastre solide di YEPD. Utilizzare un'adeguata tecnica asettica per preparare queste piastre di agar YEPD. Preparare almeno due piastre per ogni quattro-cinque ceppi da analizzare nell'esperimento sulla durata della vita.Queste piastre devono essere preparate almeno due giorni prima dell'esperimento sulla durata della vita e devono essere lasciate asciugare prima di iniziare il saggio di longevità. Se l'esperimento non verrà eseguito entro quattro o cinque giorni dal versamento delle piastre, queste devono essere avvolte con pellicola parafilm o plastica e collocate in un incubatore refrigerato per prevenire la disidratazione. Rimuovere i ceppi di lievito dalle colture congelate e seminare per ottenere colonie singole.Sulle piastre di agar YEPD. Fino a sei ceppi possono essere seminati facilmente sulla stessa piastra YEPD dividendo la piastra in settori uguali a forma di spicchio. Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per due giorni.Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatore e trasferire le cellule da una singola colonia su una nuova piastra YEPD. A questo punto, i ceppi da analizzare devono essere rivestiti per garantire che l'esperimento sulla durata della vita replicativa venga eseguito in cieco, in modo che i responsabili della dissezione non conoscano l'identità dei singoli ceppi.In seguito, incubare le cellule rivestite con macchia a 30 gradi Celsius fino alla sera successiva. Rimuovere le cellule e applicare leggermente le cellule da ciascun ceppo rivestito su piastre YEPD fresche. Queste fungeranno da piastre sperimentali utilizzate per la durata della vita replicativa.Le cellule per l'analisi devono essere depositate lungo una linea verticale sul lato sinistro della piastra YEPD. Non trasferire troppe cellule su una singola piastra YEPD fresca. Poiché ciò causerebbe una crescita eccessiva delle cellule durante l'incubazione notturna e influenzerebbe il loro ciclo vitale replicativo, sono ottimali circa da tre a cinque patch per piastra.Supponendo che l'analisi della durata della vita replicativa venga eseguita su 20 cellule provenienti da ciascuna coltura, ora l'esperimento sulla durata della vita è completamente allestito e non resta altro da fare che un'incubazione notturna a temperatura ambiente. Poi, domani, potremo iniziare la microdissezione per posizionare le cellule di lievito sulla piastra e ottenere cellule figlie vergini, per l'analisi della durata della vita replicativa.Utilizzare un microscopio dotato di un apparato di microdissezione adatto ai lieviti. Trasferire circa 50 cellule dal ceppo della prima colonia in una posizione della piastra distale rispetto alle cellule inoculate. Se il tavolino del microscopio è graduato, è possibile utilizzare queste graduazioni per garantire che le cellule siano facilmente individuabili durante le iterazioni successive.A volte le cellule possono rimanere intrappolate nell'ago, il che può rappresentare un problema se fuoriescono nel momento sbagliato. Per assicurarsi che l'ago sia pulito e privo di cellule, toccare ripetutamente la superficie dell'agar. Successivamente, creare un foro nell'agar forzando il passaggio dell'ago attraverso la superficie dell'agar.Questo foro fungerà da marcatore per orientarvi sulla piastra durante le successive iterazioni di dissezione e rimozione delle cellule dotter. Fare attenzione a non far entrare cellule di lievito nel foro, altrimenti cresceranno e formeranno una colonia direttamente sopra il foro. Allineare verticalmente le singole cellule di lievito in 20 posizioni equidistanti, con una distanza di uno a tre diametri dell'ago tra ciascuna posizione cellulare.Per ogni paio di cellule, posizionare due cellule l'una accanto all'altra nella stessa posizione della linea anziché una sola. Questo consente una ridondanza durante la selezione delle cellule figlie vergini. Se una delle cellule trasferite non si divide tra la 10ª e la 11ª posizione della linea, creare una serie orizzontale di sette-otto fori nell'agar. Questo servirà come marcatore per orientarvi sulla piastra durante le dissezioni successive e la rimozione delle cellule figlie. Ancora una volta, fare attenzione a non far entrare cellule di lievito nei fori, altrimenti cresceranno e formeranno una colonia. Ripetere questa procedura per ogni area sulla piastra, continuando a disporre le cellule verticalmente lungo lo stesso asse.È importante ricordare che, quando si crea il foro nell'AER, il numero di fori realizzati deve corrispondere al numero della patch, in modo da avere un foro per la prima patch e due fori per la seconda. Una volta che le cellule sono state disposte per ciascuna patch, sigillare la piastra con pellicola trasparente e incubare a 30 gradi Celsius per circa due ore. Ricordare che, da questo momento in poi, tutte le piastre devono essere sigillate con pellicola trasparente, tranne durante la dissezione.Per evitare la disidratazione, ripetere questa procedura per ogni piastra nell'esperimento. Per l'analisi della durata della vita, è fondamentale assicurarsi che ogni cellula parta come cellula figlia vergine.Per fare ciò, in primo luogo rimuovere le piastre dall'incubatrice e verificare che la maggior parte delle cellule dell'array abbia subito una divisione cellulare. Quello che abbiamo qui sono cellule che erano state precedentemente allineate, e si può osservare che, dopo due ore in incubatrice, hanno iniziato a dividersi. Ora abbiamo una cellula madre, quella più grande, attaccata al suo corpo, la cellula figlia vergine, e questa cellula figlia vergine è la cellula che verrà utilizzata per iniziare il ciclo di vita.Se è necessario ulteriore tempo per consentire il completamento delle divisioni cellulari, riposizionare la piastra nell'incubatrice. Partendo dalla prima cellula dell'array, utilizzare l'ago per staccare le cellule figlie dalla cellula madre posizionando delicatamente l'ago sulla parte superiore delle cellule aderenti.A volte è utile dare dei colpetti sul lato della base del microscopio mentre l'ago è appoggiato sulle cellule. Successivamente, posizionare la cellula figlia staccata sulla linea verticale di cellule, sostituendo la cellula madre e qualsiasi altra cellula figlia, spostando temporaneamente da parte queste ultime. Ripetere questi passaggi per ciascuna delle cellule dell'array.Se una cellula non si divide, prelevare una cellula figlia da una delle cellule ridondanti posizionate accanto alla cellula in esame. Al termine, si dovrebbero avere 20 cellule figlie per ciascuna coltura, allineate verticalmente sulla piastra per l'analisi della durata di vita. Raccogliere tutte le cellule madri e le cellule figlie in eccesso in un mucchio e trasferirle nuovamente in un'area vicina alle colture denominata cimitero.È importante mantenere le cellule indesiderate lontane dalle cellule sottoposte ad analisi della durata della vita per prevenire la formazione di microcoloni e l'esaurimento dei nutrienti locali. Una volta che le cellule sono state separate, spostarle dalla piastra e incubarle a 30 gradi Celsius per circa due ore. Ripetere questi passaggi per ogni piastra nell'esperimento.Per misurare la capacità replicativa di singole cellule, sarà necessario preparare schede di dati sulla durata della vita. Una scheda di dati sulla durata della vita può essere una semplice griglia in cui ogni riga corrisponde a una singola cellula madre e ogni colonna corrisponde a un punto d'età. Assicurarsi di etichettare ogni scheda dati in base al numero di ceppi da analizzare.Per iniziare, rimuovere innanzitutto le piastre dall'incubatrice e verificare che la maggior parte delle cellule dell'array abbia subito almeno una divisione cellulare. Se è necessario ulteriore tempo per completare la divisione cellulare, reinserire la piastra nell'incubatrice. Iniziare dalla prima cellula dell'array sulla prima piastra e osservare visivamente la cellula madre e la cellula o le cellule figlie per determinare il numero di divisioni cellulari avvenute.È generalmente facile determinare quante cellule figlie una cellula madre ha prodotto in base a schemi caratteristici di disposizione delle cellule. In questo caso è particolarmente semplice capire quante cellule sono state prodotte, poiché ce ne sono due, di dimensioni uguali tra loro e più piccole rispetto alla cellula madre. Registrare il numero di cellule figlie prodotte dalla cellula madre nel riquadro appropriato del foglio di valutazione della durata della vita.Successivamente, utilizzare l'ago per staccare le cellule figlie dalla cellula madre come descritto in precedenza, posizionando delicatamente l'ago sopra le cellule attaccate e picchiettando il lato della base del microscopio mentre l'ago è a contatto con le cellule. Mantenere la cellula madre nella sua posizione lungo la linea verticale e spostare temporaneamente da parte la o le cellule figlie. Ripetere questi passaggi per ciascuna delle cellule dell'array.Infine, raccogliere tutte le cellule figlie scartate e trasferirle nel cimitero situato vicino alle colonie originali. Sigillare la piastra con pellicola parafilm e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre ore. Ripetere lo scarto delle cellule figlie e l'incubazione.Passo per ogni piastra nell'esperimento. Ripetere l'intera procedura fino a quando tutte le cellule madri non hanno smesso di dividersi. Tenere presente che, con l'invecchiamento delle cellule madri, la progressione del ciclo cellulare diventa più lenta e sarà opportuno incubare la piastra per periodi di tempo più lunghi tra un punto d'età e l'altro; successivamente, le piastre possono essere mantenute a quattro gradi Celsius durante la notte.I dati grezzi prodotti da un esperimento sul ciclo di vita replicativo consistono in un elenco di numeri corrispondenti alle cellule figlie prodotte da ciascuna cellula madre a ogni punto d'età. Come mostrato qui. Sommando ogni riga del foglio dei punteggi, si ottiene il ciclo di vita replicativo per ciascuna cellula madre.I dati provenienti da altre cellule dello stesso gruppo sperimentale possono essere raggruppati per generare una curva di sopravvivenza e per eseguire calcoli statistici. La curva dovrebbe essere approssimativamente coerente con la cinetica di Gompertz-Makeham, mostrando una forma sigmoidale con una bassa mortalità iniziale, seguita da un declino relativamente rapido della sopravvivenza e da un appiattimento della curva in età avanzate. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un esperimento sulle durata media di replicazione del lievito.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le cellule continueranno a dividersi ogni volta che non si trovano al freddo. Ricordarsi quindi di mettere le piastre a quattro gradi durante la notte, in modo da non ritrovarsi con troppe cellule figlie da contare la mattina successiva. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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