Name: Etichette fluorescenti di Drosophila Cuore Strutture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Scopri la marcatura fluorescente delle strutture cardiache in Drosophila melanogaster larve e adulti. Questo protocollo consente l'analisi morfologica dettagliata del tubo cardiaco mediante microscopia confocale.

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Gli autori ringraziano SI Bernstein (San Diego State University) per la lettura critica e utili suggerimenti per quanto riguarda la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni di NIH SI Bernstein, SDSU, e di R. Bodmer, BIMR, e da un post-dottorato dal Affiliato occidentale Stati della American Heart Association a G. Vogler e ad A. Cammarato.

Prima di iniziare <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ol class="lalpha"><li> tampone rilassante (artificiale Drosophila emolinfa (ADH) (vedere &quot;Visualizzare il cuore pulsante in Drosophila&quot;) che contiene 10 mM EGTA) </li><li> fissativo (4% di formaldeide in 1x PBS) </li><li> PBSTx (PBS contenente 0,1% Triton X-100) </li><li> Opportunamente diluita anticorpi fluorescente primaria e secondaria specie-specifiche in PBSTx </li></ol></li><li> Sezionare Drosophila per esporre i tubi cardiaci (di mosche adulte e / o larve) a seguito di <ol class="lalpha"><li> il semi-intatta Drosophila preparazione protocollo cuore &quot;Visualizzare il cuore pulsante in Drosophila&quot;, o </li><li> Drosophila larvale NMJ Dissezione protocollo 1 con le seguenti modifiche: Utilizzare ossigenata ADH durante la dissezione larvale e spostare il perno posteriore leggermente dalla linea mediana ventrale. Le larve sono tagliati lungo la linea mediana ventrale. Non rimuovere i tessuti prima di fissazione. </li></ol></li></ol> La colorazione fluorescente <ol><li> Controllare che tutti i cuori sono ritmicamente battendo in ossigenato ADH. Sostituire rapidamente ADH con rilassanti buffer. Esaminare ogni tubo cardiaco per assicurare le contrazioni sono inibiti. </li><li> Fissare il cuore, sostituendo il buffer di relax con fissativo. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti agitando delicatamente. (Per agitazione preparazione larvale non è necessario in ogni passo, e può essere considerato dannoso per l&#39;integrità del tessuto cardiaco). </li><li> Lavare i campioni per tre volte per dieci minuti con PBSTx a temperatura ambiente con agitazione continua. </li><li> Per gli adulti, con attenzione tagliare di nuovo i bordi ventrale della cuticola addominale in modo che ciò che rimane è più ellittica e meno arrotondata. Inoltre, con un taglio unico tra l&#39;addome e il torace, attento e pulito separato da entrambi i segmenti del corpo e garantire il minimo danno alla regione anteriore del cuore. Per i cuori larvale, rimuovere con attenzione il grasso corporeo con una pinza sottile. La rimozione del grasso deve essere eseguito con estrema cautela, poiché il cuore larvale è particolarmente fragile e ha un supporto molto poco da altri muscoli o del tessuto connettivo. Non rimuovere i rami tracheali in quanto ciò potrebbe danneggiare il cuore. </li><li> Trasferire la regione tagliata dorsale della cuticola addominale per i bordi, evitando il contatto con il tubo in posizione centrale cardiaco, in una piastra da 96 pozzetti con pozzi che contengono 50-100 ml di anticorpo primario diluito in PBSTx. Luogo non più di 12 esemplari per bene. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore con agitazione continua. L&#39;incubazione può essere effettuata anche durante la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi. Lavare i cuori per tre volte per dieci minuti con 100 microlitri PBSTx a temperatura ambiente con agitazione continua. </li><li> Dopo la rimozione di tampone di lavaggio finale, aggiungere 100 ml di anticorpo secondario in PBSTx, integrato con Alexa594-falloidina (1:1000). Incubare per un&#39;ora con agitazione continua a temperatura ambiente. Conservare i campioni coperti per evitare fluoroforo sbiancamento. </li><li> Dopo l&#39;incubazione secondaria, lavare i cuori per tre volte per dieci minuti con 100 ml di PBSTx a temperatura ambiente con agitazione continua. Mantenere i campioni coperto per tutta la fasi di lavaggio. </li><li> Per la rimozione di Triton X-100, lavare i cuori un&#39;ultima volta in 100 ml di PBS per 10 minuti. I campioni possono essere conservati al buio a 4 ° C per diversi giorni prima del montaggio. </li></ol> Cuori di montaggio per adulti <ol><li> Rispettare due 18 x 18 mm per coprire scivola un vetrino da microscopio con 10 l di media Vectashield montaggio. I coprioggetti devono essere distanziati ~ 10-15 mm. Mettere una piccola goccia terzo di montaggio di medie-tra le due lamelle. </li><li> Mettere 20 ml di Vectashield al centro di un vetrino coprioggetto terzo. </li><li> Rimuovere con attenzione ciascuno dei cuori dalla soluzione di lavaggio PBS dai bordi estremi della cuticola, e delicatamente metterli cuore rivolto verso il basso sulla goccia di mezzo di montaggio sul vetrino terzo. Luogo non più di cinque cuori per goccia sul vetrino. </li><li> Controllare al microscopio per garantire che tutti i cuori sono rivolti verso il basso. </li><li> Con attenzione invertire il vetrino che contiene il cuore e rapidamente posto sulla diapositiva che contiene la coppia di coprioggetto in modo che la goccia con tubi cardiaci fonde con la goccia Vectashield tra la coppia coprioggetto. Un &quot;ponte&quot; dovrebbe essere formata da i coprioggetti. I cuori saranno sospesi tra un vetrino e il vetrino da microscopio. </li><li> Controllare al microscopio per garantire che i cuori sono ora rivolte verso l&#39;alto. </li><li> Fissare coprioggetto ai bordi con smalto. </li><li> I cuori sono ora pronti per essere ripreso mediante microscopia a fluorescenza o confocale. </li></ol><ol><li> Mettere una goccia (~ 20 l) Vectashield su un vetrino da microscopio. </li><li> Cura di trasferimento fino a due esemplari larvali nel loro lato Vectashield e orientare dorsale giù usando aghi di tungsteno. </li><li> Individualmente trascinare i campioni fuori dal mezzo di montaggio e allineare ciascuno in parallelo. </li><li> Mettere un coprioggetti ai lati opposti del campione. Utilizzando pinze, mettere un coprioggetto terza cima, prima che un lato del vetrino posteriore e abbassandolo fino al coprioggetto anteriore in modo da formare un ponte. Forze capillari causerà un flusso di Vectashield da anteriore a posteriore che aiuta il corretto allineamento del cuore larvale. </li><li> Sistemare tutti coprioggetto in posizione, ai bordi, con smalto e con attenzione riempire lo spazio tra i coprioggetti con 20-30 Vectashield microlitri. </li><li> Sigillare con smalto e conservare a 4 ° C, o per la conservazione a lungo termine a -20 ° C. </li></ol> Rappresentante Risultati Quando viene eseguito correttamente, tutti i componenti e dei relativi tessuti del vaso dorsale deve rimanere intatto ed essere facilmente visualizzati. La fluorescenza di fondo dovrebbe essere minimo. Per gli adulti, la ventrale longitudinale macchie strato muscolare molto bene e produce un segnale di sostanziale (Figura 1 e Figura 2). I cardiomiociti base circolare tuttavia, tendono a non produrre come un segnale forte come quella dello strato sovrastante ventrale. I miociti del anteriore &quot;camera conica&quot; del cuore adulto contengono una notevole quantità di materiale contrattile e, di conseguenza, questa regione appare come il parente più robusto per il resto del tubo cardiaco. Il cuore larvale presenta una disposizione a spirale miofibrillare simile a quella dei cardiomiociti adulti contrattile (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="Figura 1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="Figura 1b" /> Figura 1: Inizio. Un microscopio a fluorescenza che mostra il tubo intero cardiaca di un adulto Drosophila melanogaster che esprime miosina-GFP. L&#39;immagine è stata scattata con un microscopio a fluorescenza Zeiss Z1 Imager dotato di un modulo Apotome scorrevole. Miosina-GFP viene evidenziato in verde, actina è macchiata di AlexaFluor ® 594 falloidina (rosso) e α-actinina è etichettato con anti-α-actinina anticorpo (blu). Si noti la procedura preparativa permetta il recupero di campioni di cuore con strutture ben conservate. CC = camera conica; AM = muscolo Alary; V = valvola interna; VLL = ventrale strato muscolare longitudinale. Fondo. Una regione del tubo cardiaco adulto dal CC attraverso il terzo segmento addominale del cuore appena sotto lo strato ventrale longitudinale che mostra la disposizione a spirale miofibrilla dei cardiomiociti contrattile. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">cliccare qui</a> per una versione più grande di Figura 1a, e <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">qui</a> per una versione più grande di figura 1b <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Rappresentante pile confocale di una porzione anteriore del cuore adulto colorate con AlexaFluor ® 594 falloidina (rosso) e un anti-Pericardin (collagene di tipo IV) (verde) di anticorpi. Pericardin è associato con il cuore lungo la superficie ventrale, probabilmente provenienti dalla miofibrille longitudinalmente orientata dello strato muscolare ventrale. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">cliccare qui</a> per una versione più grande della figura 2. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Un microscopio a fluorescenza del segmento A7 del cuore corretta di una larva di terza fase Drosophila. L&#39;immagine è stata scattata con un microscopio a fluorescenza Zeiss Z1 Imager dotato di un modulo Apotome scorrevole. Actina è etichettato con AlexaFluor ® 594 falloidina (verde) e α-actinina è macchiato con anti-α-actinina anticorpi (rosso). Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">cliccare qui</a> per una versione più grande di figura 3.

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<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
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<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
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<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

Qui vi presentiamo un protocollo utile per la preparazione e la colorazione dorsale Drosophila melanogaster nave e dei relativi tessuti per l&#39;imaging tramite microscopia a fluorescenza o confocale. Forniamo un resoconto sintetico dei passi da raffinate e comunemente impiegati nel nostro laboratorio per la colorazione efficace che permette ben risolta nella diagnostica per immagini in situ di larve e adulti tubi cuore Drosophila. Altri hanno descritto metodi simili in forma abbrevi...

<table><tbody><tr><td>Acido etilene glicole-bis(2-ammino-etil eter) -N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetraacetico (EGTA)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide, 10%, priva di metanolo, Ultra Purificata</td><td>Reagente</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 falloidina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Vectashield&amp;#174; per fluorescenza con DAPI</td><td>Reagente</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Puntine di tungsteno</td><td>Reagente</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Portapuntine</td><td>Reagente</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

etichette fluorescenti di drosophila cuore strutture

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Il<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Vaso dorsale, o cuore, è una struttura tubolare costituito da un singolo strato contrattile dei cardiomiociti, le cellule del pericardio che si allineano lungo ogni lato del muro di cuore, i muscoli Alary di supporto e, negli adulti, uno strato di cellule muscolari longitudinale ventrale. La casa contrattile delle fibre conservato componenti del citoarchitettura tra fasci muscolari densamente delle miofibrille e dei complessi di proteine ​​del citoscheletro / submembranous, che interagiscono con omologhe componenti della matrice extracellulare. Qui si descrive un protocollo per la fissazione e la marcatura fluorescente di particolari elementi del miocardio dal cuore delle larve sezionato e semi-intatte adulti<em&gt; Drosophila</em&gt;. In particolare, abbiamo dimostrato l&#39;etichettatura dei sarcomerica F-actina e di α-actinina nei cuori larvale. Inoltre, noi dobbiamo fare l&#39;etichettatura di F-α-actina e miosina in actinina-GFP che esprimono le mosche adulte e di α-actinina e pericardin, una matrice di collagene di tipo IV extracellulare, nel cuore selvaggio di tipo adulto. Particolare attenzione viene data a una strategia di montaggio per semi-intatti i cuori degli adulti che riduce al minimo la manipolazione ed ottimizza la possibilità di mantenere l&#39;integrità dei tubi e dei tessuti cardiaci associati. Questi preparati sono adatti per l&#39;imaging tramite microscopia a fluorescenza e confocale. In generale, questa procedura consente di analisi attenta e dettagliata delle caratteristiche strutturali del cuore da un potente sistema geneticamente modello trattabili.

Qui si descrive un protocollo di base per la marcatura fluorescente di elementi diversi di tubi cuore da larve e adulti<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;. Questi esemplari sono particolarmente adatti per l&#39;imaging mediante microscopia a fluorescenza o confocale. Questa tecnica permette una dettagliata analisi strutturale delle caratteristiche del cuore di un organismo modello potente.

Etichette fluorescenti di Drosophila Cuore Strutture

Il vaso dorsale di Drosophila melanogaster, o cuore, è una struttura tubulare composta da un singolo strato di cardiomiociti contrattili, cellule pericardiche ...

Ciao, sono Nikita Ari del Laboratorio di Ralph Boer del programma di Sviluppo e Invecchiamento presso l'Istituto Burnham per la Ricerca Medica. Sono anche Gil ler del laboratorio inferiore. Oggi vi mostreremo le procedure per la marcatura fluorescente delle strutture cardiache larvali e adulte di Presolar.Utilizziamo questo procedimento in laboratorio per preparare i tubi cardiaci per l'analisi morfologica e strutturale mediante microscopia confocale o microscopia a fluorescenza, al fine di etichettare in modo fluorescente le strutture cardiache in Drosophila adulte. Prima di tutto, effettuare un singolo taglio tra torace e addome in un adulto semi-integro per separare i segmenti corporei. Successivamente, rimuovere i bordi ventrali sporgenti della cuticola adulta.Successivamente, trasferire ed etichettare campioni adulti o larvali dissezionati con anticorpi primari e secondari. Dopo l'etichettatura, montare i campioni adulti lavati tenendo i bordi della cuticola e posizionandoli con il lato del cuore rivolto verso il basso su una goccia di vector shield posta su un'immersione, quindi capovolgere l'immersione su una goccia di mezzo affiancata da due coprioggetti su un vetrino per formare un ponte. Con i cuori ora sospesi in posizione verticale per il montaggio dei cuori larvali.Trasferire i campioni su un vetrino con i lati ventrali rivolti verso il basso, montando due coprioggetti ai lati del vetrino. Infine, formare un ponte con un terzo coprioggetto posizionandolo inizialmente sul coprioggetto vicino alle estremità posteriori delle larve. I cuori sono ora pronti per l'acquisizione delle immagini.Prima di iniziare questa procedura, preparare il seguente buffer rilassante A DH contenente A DH come descritto in un altro protocollo video di questa serie, con un fissativo composto da 10 millimolare di EGTA e 4% di formaldeide in P-B-S-P-B-S 1X, TX, nonché anticorpi primari opportunamente diluiti e anticorpi secondari marcati con fluorocromo. In P-B-S-TX dissezionare gli adulti e le larve di drosophila per esporre i tubi cardiaci, seguendo la preparazione del cuore di drosophila semi-intatto mostrata nei protocolli video che visualizzano il battito cardiaco in drosophila e il protocollo di dissezione della giunzione neuromuscolare larvale di drosophila. Con alcune modifiche, utilizzare A DH ossigenato durante la dissezione delle larve e posizionare leggermente più lateralmente i perni posteriori rispetto alla linea mediana ventrale della larva.Tagliare lungo la linea mediana ventrale. Non rimuovere alcun tessuto prima della fissazione nei passaggi successivi. Iniziare la procedura di marcatura verificando al microscopio che tutti i cuori stiano contraggendo e rilasciando in modo ritmico in un A DH ossigenato. Quindi sostituire rapidamente il DH con una soluzione tampone rilassante e riesaminare ciascun tubo cardiaco per assicurarsi che le contrazioni siano inibite.Procedere alla fissazione dei cuori sostituendo il buffer rilassante con il fissativo. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti con agitazione delicata. Si noti che per i preparati larvali l'agitazione non è necessaria in alcun passaggio e potrebbe addirittura risultare dannosa per l'integrità del tessuto cardiaco.Al termine dei 20 minuti, rimuovere il fissativo e lavare i campioni tre volte per 10 minuti ciascuna con P-B-S-T-X. A temperatura ambiente e con agitazione continua per gli adulti, effettuare un singolo taglio tra l'addome e il torace con attenzione e precisione. Separare entrambi i segmenti corporei per garantire il minimo danno alla regione anteriore del cuore.Attenzione a non tagliare la sezione addominale anteriore in cui si trova la camera conica del cuore. Esaminare il campione al microscopio per assicurarsi che il taglio sia stato effettuato in modo netto. Successivamente, rimuovere con cura eventuali bordi ventrali sporgenti della cuticola addominale, in modo che ciò che rimane abbia una forma più ellittica e meno rotonda.Per i cuori delle larve, utilizzando pinzette fini, rimuovere con cura il corpo adiposo. Eseguire questa operazione con estrema cautela. Poiché il cuore larvale è particolarmente fragile e ha un sostegno minimo da parte di altri muscoli o tessuti connettivi, non rimuovere i rami traqueali poiché ciò potrebbe danneggiare il cuore.Successivamente, eseguire l'incubazione con l'anticorpo primario, diluito in PVS TX e aggiunto in quantità di 50 microlitri per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Per i ditteri adulti, tenere l'addome dorsale tagliato dai bordi senza toccare il tubo cardiaco situato centralmente e trasferirlo sulla piastra. Posizionare non più di 12 campioni per pozzetto ed eseguire l'incubazione a temperatura ambiente per due ore con agitazione continua.Tenere i campioni larvali per il bordo utilizzando pinzette e trasferirli nel pozzetto riempito con P-B-S-T-X. Ancora una volta, non agitare i campioni larvali alla fine dell'incubazione. Rimuovere la soluzione dell'anticorpo primario.Lavare i cuori tre volte per 10 minuti ciascuna con 100 microlitri di P-B-S-T-X a temperatura ambiente dopo l'ultimo lavaggio con 100 microlitri dell'anticorpo secondario in PBS tx supplementato con Alexa 5 9 4 Phin. Proteggere i campioni dall'esposizione alla luce per evitare il bleaching del fluorocromo da questo momento in poi e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione dell'anticorpo secondario e lavare i cuori tre volte per 10 minuti ciascuna con 100 microlitri di P-B-S-T-X a temperatura ambiente.Infine, rimuovere il TRITTON X 100 lavando i cuori con 100 microlitri di PBS per 10 minuti. I campioni possono essere conservati al buio a quattro gradi Celsius per diversi giorni prima del montaggio. Preparare innanzitutto il vetrino per il montaggio.Applicare tre gocce da 10 microlitri di mezzo di montaggio vector shield, distribuite uniformemente, su un vetrino da microscopio. Posizionare due coprioggetti di dimensioni 18 per 18 millimetri sulle gocce esterne, mantenendo i coprioggetti a una distanza di circa 10-15 millimetri l'uno dall'altro.Inoltre, posizionare 20 microlitri di vettore protettivo al centro di un terzo coprioggetto. Successivamente, afferrare la mosca adulta dissezionata lungo i bordi estremi della cuticola. Per rimuoverla con attenzione dalla soluzione di lavaggio PVS, posizionarla delicatamente con il lato del cuore rivolto verso il basso sulla goccia di mezzo di montaggio presente sul terzo coprioggetto, non più di cinque cuori per goccia sul coprioggetto.Dopo aver posizionato i cuori sulla goccia, che si trova sul cover slip, controllare al microscopio per assicurarsi che tutti i cuori siano rivolti verso il basso. Ora capovolgere con attenzione il cover slip con i cuori e posizionarlo rapidamente sul vetrino che sostiene la coppia di cover slip, in modo che la goccia del cover slip capovolto contenente i tubi cardiaci si fonda con la goccia di scudo vettoriale posta nello spazio tra i cover slip. Accoppiando in questo modo, i tre cover slip formano un ponte.I cuori verranno sospesi tra il coprivetrino centrale e il microscopio. Far scivolare sotto il ponte e controllare al microscopio per assicurarsi che i cuori delle mosche adulte siano ora rivolti verso l'alto utilizzando la colla per unghie. Fissare i coprivetrini ai loro bordi.I cuori sono ora pronti per essere analizzati mediante microscopia fluorescente o confocale. Per montare i cuori larvali, posizionare una goccia di circa 20 microlitri di BTA shield su un vetrino utilizzando pinzette fini. Afferrare le larve ai margini della cuticola e trasferirle con cura nella goccia.Orientare i larve con il lato dorsale verso il basso utilizzando aghi di tungsteno. Posizionare fino a due larve su un unico vetrino. Successivamente, trascinare ogni campione fuori dal mezzo di montaggio e allineare le larve in parallelo.Posizionare un coprioggetto su ciascun lato dei cuori allineati utilizzando pinzette. Posizionare un terzo coprioggetto in alto appoggiandone prima un lato sul coprioggetto anteriore e abbassandolo poi fino al coprioggetto posteriore, formando così un ponte.Le forze capillari provocheranno un flusso del vettore schermo dalla parte posteriore a quella anteriore, il che favorisce un corretto allineamento del cuore larvale. Infine, fissare tutti i vetrini coprioggetti ai loro bordi con smalto per unghie e riempire con attenzione lo spazio tra i vetrini coprioggetti con da 20 a 30 microlitri di sigillante vettore schermo, quindi conservare a quattro gradi Celsius per un immagazzinaggio a breve termine oppure a meno 20 gradi Celsius per un periodo più lungo. Se eseguito correttamente, tutte le componenti e i tessuti associati del vaso dorsale dovrebbero rimanere integri e facilmente visualizzabili.La fluorescenza di fondo dovrebbe essere minima negli adulti. Lo strato muscolare longitudinale ventrale si colora molto bene e produce un segnale consistente. Tuttavia, i cardiomiociti circolari sottostanti tendono a produrre un segnale meno intenso rispetto a quello proveniente dallo strato ventrale sovrastante.I miociti della camera conica anteriore del cuore adulto contengono una notevole quantità di materiale contrattile e, di conseguenza, questa regione appare la più robusta rispetto al resto del tubo cardiaco. L'immagine del cuore larvale mostra un'organizzazione spiraliforme dei miofibrilli. Simile a quella dei cardiomiociti contrattili adulti, abbiamo appena mostrato il tuo protocollo per la preparazione e la colorazione di cuori ovulari per microscopia fluorescente e confocale.Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di limitare qualsiasi manipolazione non necessaria. Ciò garantirà una struttura cardiaca meglio preservata e integra. Questo protocollo serve soltanto come punto di partenza.Come per ogni altra immunocitochimica, diversi anticorpi richiedono condizioni diverse e devono essere ottimizzati singolarmente. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con le vostre colorazioni.

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Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Questo protocollo presenta un metodo efficiente per l'imaging del neuroepitelio dell'occhio pupale di Drosophila. Questo metodo compensa il movimento dei tessuti e la topologia irregolare, migliora la visualizzazione dei confini cellulari attraverso l'uso di più proteine di giunzione marcate con GFP e utilizza un impianto di imaging facilmente assemblabile.

Live-imaging del Drosophila Pupa Eye

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

Nel primo embrione di Drosophila , molti organelli sono mobili. In linea di principio, possono essere ripresi dal vivo tramite specifiche sonde fluorescenti, ma il guscio d'uovo impedisce l'applicazione diretta all'embrione. Questo protocollo descrive come introdurre tali sonde tramite microiniezione e quindi analizzare il movimento degli organelli di massa tramite velocimetria dell'immagine delle particelle .

Visualizzazione del traffico citoscheletro-dipendente di organelli contenenti lipidi in embrioni di Drosophila

Il presente protocollo descrive la generazione di Drosophila melanogaster che esprime le opsine eNpHR2.0 o ReaChR nel cuore per l'imaging OCT e la stimolazione cardiaca optogenetica. Sono riportate istruzioni dettagliate per l'imaging OCT di Drosophila e la modulazione del battito cardiaco, compresa la simulazione di arresto cardiaco ripristinabile, bradicardia e tachicardia in animali vivi in diversi stadi di sviluppo.

Sviluppo di modelli di Drosophila melanogaster per l'imaging e il controllo optogenetico della funzione cardiaca

Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Il protocollo di imaging a fluorescenza e sezionamento cardiaco di Drosophila semplifica lo studio della struttura e delle patologie cardiache. Questo approccio prevede il sezionamento, la colorazione e l'imaging semplici, bypassando le competenze tecniche necessarie per la dissezione tradizionale. Migliora l'accessibilità, rendendo la Drosophila un modello più ampiamente utilizzabile per la ricerca cardiaca all'interno della più ampia comunità scientifica.

Metodo nuovo ed efficiente per la colorazione a fluorescenza cardiaca di Drosophila con criosezione

Scopri la marcatura fluorescente delle strutture cardiache in Drosophila melanogaster larve e adulti. Questo protocollo consente l'analisi morfologica dettagliata del tubo cardiaco mediante microscopia confocale.

Etichette fluorescenti di Drosophila Cuore Strutture

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