ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine

Ciao, mi chiamo Francesco Lichi. Sono un ricercatore postdottorato presso il Laboratorio Bioanalitico del Professor Palki all'Università di Roma Tova Gata. Oggi, insieme ai miei colleghi, vi mostrerò la preparazione di un CY elettrochimico per la rilevazione della micotossina TCO in campioni alimentari.

Tra i diversi metodi utilizzati nei test immuno cellulari, l'immunoassay enzimatico è uno dei più diffusi. In questo metodo, l'anticorpo o l'antigene vengono marcati con un enzima. Recentemente, l'uso di metodi elettrochimici per la rilevazione del prodotto enzimatico si è dimostrato particolarmente vantaggioso per alcune applicazioni.

L'elettrochimica è, di fatto, meno soggetta a interferenze, adatta alla miniaturizzazione e alla produzione di massa a basso costo. In questa prospettiva, l'uso di elettrodi a stampa ha una grande importanza per garantire un basso costo e la semplicità della procedura. Inoltre, l'uso di letti magnetici potrebbe essere abbinato a elettrodi a stampa al fine di ottenere la massima sensibilità del metodo.

Oggi, ti mostreremo come preparare un biosensore elettrochimico basato sull'uso di elettrodi a stampa serigrafica e microsfere magnetiche per la rilevazione della micotossina TCO negli alimenti. Le micotossine trichoteceniche sono comunemente presenti nei cereali e, per questo motivo, rappresentano una seria minaccia per la sicurezza degli alimenti e dei mangimi a base di cereali. Le più importanti tossine all'interno del gruppo A sono le tossine T-2 e HT-2.

Come vedremo, questo metodo può essere facilmente eseguito da personale non specializzato e richiede strumentazione a basso costo e portatile. Questo è uno degli obiettivi principali del progetto integrato bio finanziato dalla comunità europea nel cui ambito è stato svolto questo lavoro. Vediamo ora qual è il principio del metodo e quali materiali utilizzeremo?

Iniziamo. Le perle magnetiche verranno utilizzate come supporto per la reazione a catena immunologica. Una striscia di otto elettrodi stampati a schermo sarà utilizzata come elemento sensoriale.

Ogni sensore è composto da un elettrodo di lavoro in grafite, un elettrodo contatore e un elettrodo di riferimento in argento. Questi sensori possono essere azionati in sequenza e singolarmente in un tempo molto breve mediante uno strumento elettrochimico portatile prodotto da palmSens, secondo il principio del metodo. Il principio del metodo è semplice e si basa su una reazione immunologica di competizione.

La tossina coniugata viene immobilizzata sulle perle magnetiche, che successivamente vengono bloccate per prevenire l'assorbimento non specifico. La misurazione vera e propria inizia con la fase di competizione. In questa fase, le perle rivestite vengono lasciate reagire con una quantità fissa di anticorpo monoclonale; la tossina presente nel campione e quella immobilizzata sulle perle magnetiche competono per i siti di legame dell'anticorpo.

La quantità di anticorpo legata ai microsferini codificati sarà inversamente proporzionale alla quantità di tossina in un campione. Al passaggio di competizione segue quindi il passaggio di marcatura. In questo caso, si lasciano reagire i microsferini magnetici con un anticorpo secondario coniugato a un enzima marcatore.

L'anticorpo secondario si lega all'anticorpo monoclonale e garantisce un'etichettatura efficiente. Il passaggio di etichettatura è infine seguito dal passaggio di misurazione. In questo caso, le microsfere magnetiche vengono concentrate sulla superficie dell'elettrodo con l'aiuto della piattaforma magnetica, e si aggiunge semplicemente il substrato enzimatico uno napt fosfato, misurando poi la produzione di uno napta.

La curva di legame ottenuta mostrerà valori di corrente elevati a basse concentrazioni di tossina e segnali bassi ad alte concentrazioni di tossina. La concentrazione di tossina verrà determinata utilizzando una curva di calibrazione generata in soluzioni tampone standard. Per impostare il saggio effettivo, prepariamo un portaprovette con provette Fendor da due mil, una separata per ciascuna soluzione standard della curva di calibrazione, nonché per i campioni.

Successivamente, 10 microlitri di sospensione di perle vengono prelevati con pipetta e aggiunti in ciascun tubo. Questa soluzione contiene perle magnetiche precedentemente rivestite con il tossina coniugata. Tuttavia, prima di eseguire il saggio, il liquido di conservazione deve essere rimosso perché l'azoturo di sodio utilizzato come conservante potrebbe influenzare l'attività enzimatica dell'etichetta.

Per fare ciò, viene aggiunto il buffer P-B-S-B-S-A. I tubi vengono agitati, quindi il magnete viene reinserito e il buffer di lavaggio viene aspirato con una pipetta. Il primo passaggio effettivo del saggio è chiamato fase di bloccaggio.

Durante questo passaggio, un mil di soluzione bloccante viene aggiunto a ciascuno dei tubi. Successivamente, i tubi vengono posti sul miscelatore rotante e lasciati incubare per mezz'ora a temperatura ambiente. Dopodiché, la soluzione bloccante viene rimossa per il passaggio successivo, cruciale, ovvero il passaggio di competizione, durante il quale aggiungiamo alle soluzioni nei tubi l'anticorpo monoclonale specifico e la soluzione di tossina.

Per eseguire questa procedura, vengono iniettati 200 microlitri di anticorpo monoclonale alla concentrazione ottimizzata. Successivamente, vengono aggiunti 200 microlitri di ciascuna soluzione standard o campione in ogni provetta. I reagenti verranno lasciati incubare per 30 minuti.

Per ottimizzare il contatto tra i reagenti immobilizzati sulla superficie delle particelle magnetiche e le molecole in soluzione per avviare questo processo, i tubi vengono riposizionati sul miscelatore rotante per procedere con il passaggio di marcatura. È necessario rimuovere la soluzione del passaggio precedente. Successivamente, vengono aggiunti 400 microlitri di anticorpo secondario marcato in ogni tubo, che vengono quindi rimessi sul miscelatore rotante e incubati per 30 minuti.

Successivamente alla rimozione del liquido di marcatura, abbiamo eseguito procedure di lavaggio utilizzando diverse soluzioni tampone al fine di evitare qualsiasi interferenza da parte di reagenti enzimatici non legati. Infine, per prepararsi alle misurazioni effettive, le microsferette magnetiche vengono risospese in 100 microlitri di buffer DEA uno, un buffer adatto ad ottimizzare l'attività enzimatica del marcatore. La misurazione viene effettuata con questo potenziostato palmare collegato a una striscia a otto elettrodi posizionata al di sotto.

È presente un supporto speciale su cui otto magneti potenti sono fissati esattamente al di sotto della superficie di ciascun elettrodo di lavoro. Il magnete serve per concentrare le perle sulla superficie dell'elettrodo di lavoro. Da ciascun EOR pipettiamo un'aliquota di 20 microlitri della dispersione di perle magnetiche reattive e la carichiamo sulla superficie corrispondente dell'elettrodo di lavoro.

Per eseguire la misurazione effettiva, è necessario aggiungere il substrato enzimatico, ma anche la sequenza delle operazioni deve essere attentamente controllata. Aggiungiamo alcune microlitro di soluzione di substrato enzimatico sulla superficie del primo elettrodo. Successivamente, avviamo un conto alla rovescia di due minuti.

Dopo 14 secondi, aggiungiamo la soluzione del substrato sul secondo elettrodo. Dopo altri 14 secondi, aggiungiamo la soluzione del substrato sul terzo elettrodo. Procediamo utilizzando lo stesso intervallo di tempo fino all'ultimo elettrodo.

Di fatto, l'intervallo di 14 secondi viene calcolato come il tempo necessario affinché lo strumento elettrochimico esegua la misurazione. Bene, al termine del conto alla rovescia di due minuti dalla prima aggiunta della soluzione del substrato enzimatico, viene avviato il protocollo di misurazione elettrochimica. La misurazione effettiva del prodotto formato viene eseguita utilizzando la telemetria differenziale postale.

Le curve per gli elettrodi successivi iniziano a comparire sullo schermo in un saggio competitivo. L'intensità della corrente del segnale ottenuto sarà inversamente proporzionale alla concentrazione della tossina presente nel tubo durante la fase di competizione. Il segnale elettrico delle soluzioni standard verrà riportato in una curva sigmoidea e il contenuto di tossina nei campioni sconosciuti sarà determinato per estrapolazione del valore di concentrazione a partire dal segnale registrato.

Beh, spero che questa dimostrazione sia stata chiara e utile per comprendere i vantaggi dei sensori immunoelettrochimici. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.