Name: Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Öğrenin fare embriyonik primordial germinal hücrelerinin izolasyon ve türetilmesi yöntemini. Bu protokol üreme sağlığı ve kanser araştırmalarında temel hücre gelişimini anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford ve MSU ALAC akredite fare tesisi, eğitim ve hayvan bakımı ile ilgili yardım için Mike Basett; Dr. Dwayne Wise Dr Neal Birinci ve yazının düzenleme için Kourtney Wilkinson: Yazarlar, paha biçilmez bir yardım kabul etmek istiyorum Cesar Monroy Hannah Swoope ve Bobbie Huddleston MSU video üretimi ile yardım için mikroskopi ve görüntü yakalama ile yaptığı yardım için. Bu araştırma, Mississippi State Üniversitesi Kurumsal Araştırma ve Biyolojik Bilimler Bölümü Ofisi tarafından finanse edildi.

Bölüm 1: Hamile Fare Laparotomi <ol><li> Servikal dislokasyon kullanarak, 10,5-11,5 DPC, hamile bir C57BL6J kadın fare euthanize. </li><li> Karın antimikrobiyal sabun ile temizleyin ve sonra, tıraş. </li><li> Tıraştan sonra karın, bir tuzlu su çözeltisi ile yıkayın. </li><li> Sonra steril bir gazlı bez ile karın kurulayın. </li><li> Yeni bir steril alan fare ile kaplayın. </li><li> Forseps ve diseksiyon makas kullanarak ventral kesi olun. </li><li> Belirlenmesi ve karın boşluğuna kadar tüm rahim kaldırmak. Fare embriyoları rahim içinde görünür olacaktır. </li><li> D-PBS ile dolu bir petri içine rahim transferi ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Steril bir bisturi ve forseps kullanarak, plasenta ve her embriyo ekstra embriyonik dokularda çıkarın. </li><li> D-PBS ile dolu yeni bir petri içine embriyo transferine. </li><li> Fare embriyo uzunluğunu ölçün. Biz boyutları embriyonun yaşına göre farklılık bulundu. 6mm ortalama ölçülen DPC örneğin 8.5, 10.5 DPC 11mm ortalama ölçülen ve 16 mm ortalama 12.5 DPC ölçülür. </li><li> Daha sonra, DNA ekstraksiyonu için kuyrukları kaldırmak. </li></ol> Bölüm 2: Gonadal Ridge Diseksiyon Stereomikroskopta ve Işık kaynağı Schott Fostec altında <ol><li> Petri kabındaki bir filtre kağıdı yerleştirin. Sonra, embriyo kuru ve diseksiyon için hareketsiz fare embriyo filtre kağıdının üstüne koyun. </li><li> Steril bir bistüri kullanarak, fare embriyo göbek kordonu kökeni üzerinde enine kesilmiş olun. </li><li> Stereomikroskop altında, steril ince forseps ve steril bir ince alay iğne kullanarak, üriner sistem görünür olduğunu bu nedenle bağırsak ve karaciğer kaldırmak. Böbrekler yanal karın boşluğunda bulunan ve mesane, böbrekler göre medial ve kaudal bulunmaktadır. Gonadal sırtlar mesane iki tarafında bulunması nedeniyle embriyonun erkek olarak tespit edilebilir. Kadın, gonadal sırtlar böbrekler kaudal lateral sonuna kadar sıkıca bağlıdırlar. </li><li> Arkasında bir iğne kaydırarak gonadal sırt dışarı Peel. Gonadal sırtı destekleyen dokuların kesim tarafından kaldırılır. </li><li> Gonadal sırtlar taze D-PBS ile dolu yeni bir petri kabına aktarın. Mikroskopik, erkek gonadal sırt, büyük ve oval soyulmuş olmalıdır. Buna karşılık, dişi gonadal sırt fark olmalıdır, uzatılmış şekli ve erkek gonadal sırt kıyasla daha küçük olabilir. </li></ol> Bölüm 3: Ridge Sindirim Gonadal Altında stereomikroskopta: <ol><li> Mesonephros Diseksiyon: ince ve keskin bir iğne kullanılarak mesonephros ve sırt gonad ayırın. <ul><li> PGC türetme süreç içinde büyümek bir somatik doku olması nedeniyle gonadal sırt mesonephros kaldırmak için önemlidir. </li></ul></li><li> Gonadal Ridge Sindirim: taze D-PBS 0.5ul açılan temiz gonadal sırtlar toplayın. Kollajenaz / Dispase Çözüm 20 ml (1mg/ml Final konsantrasyon) ekleyin. <ul><li> Embriyolar ayrı ayrı işleme tabi tutulmalıdır. Her embriyo kendi ayrı ve etiketli petri olmalıdır. </li></ul></li><li> Gonadal Ridge kıyma: gonadal sırt, steril bir iğne ve steril ince forseps No 4 kullanarak küçük parçalar halinde kesin. </li><li> Kuluçka: Petri kapları 37 bir kuluçka aktarılır ° C de 15 dakika boyunca. <ul><li> Inkübasyon süresi dokular arasında değişebilir. </li></ul></li><li> Pipetleme: 15 dakika sonra, doku pipetleme ayrışmış olabilir. 40 -100 mm çapları arasında çekilmiş cam kapiller pipetler kullanarak, yukarı ve aşağı pipetleme tarafından parçaları kadar Break. Bu küçük öbekler şeklinde olacaktır. Nihai bir yıkama için bir ön ısındı D-PBS damla 0.5 ml yığınları aktarın. </li><li> Yıkadıktan sonra yığınları, Eppendorf tüplerine transfer. <ul><li> Doku üzerinde kollajenaz maruz bırakmayın. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu yapmayın. Bu koloni oluşumu için önemlidir. Tek bir hücre süspansiyonu ise, PGCs farklılaştırmak ve göç eğilimindedir. </li><li> Bu işlemi 20 dakika daha uzun olmamalı, ya da hücreler canlılığını kaybedecektir. </li></ul></li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 2000 rpm'de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj sonra, süpernatant kaldırmak ve medya dışında ilave vuruş (37 ° C'de Önceden ısıtılmış) 0.5 ml pelet tekrar süspansiyon. </li></ol> Bölüm 4: İlkel Germinal Hücreler Kültür "Sen, izolasyon ve derivasyon PGCs canlılığını korumak için hızla bir sonraki adımları gerçekleştirmeniz gerekir. <ol><li> Bu süreç 24 saat önce Zhang, J. ve ark 2008 protokolü takip mitotik olarak inaktive MEF-CF1 besleyici tabaka hazırlamalıdır. <ul><li> Bir pregna 20 yemekleri hazırlayınnt dişi fare (6-8 embriyoların). </li><li> MEFS 5-6 pasajlar sonra (büyümeyi teşvik etmek ve önlemek farklılaşma) besleyici tabaka yeteneğini kaybedersiniz. </li><li> 48 saatten daha büyük MEFS kullanmayın. </li></ul></li><li> Kaplama PGCs hemen önce, MEF orta yavaş yavaş MEF besleyici tabaka kaldırılmış olmalıdır. </li><li> Daha sonra, MEF besleyici tabaka üzerine, önceden ısıtılmış takviye nakavt orta / iyi 0,5 ml ekleyin. <ul><li> MEF medya PGCs, farklılaşma indükler fetal sığır serumu içerir. </li><li> Nakavt orta specie özel büyüme faktörleri ile takviye edilmelidir hemen önce büyümeye faktörünün etkinliği sağlamak için kullanmak. </li></ul></li><li> MEF besleyici tabaka üzerinde simetrik dağılımı, plaka PGCs kullanma. <ul><li> Bu parçaları çok yakın iseler, agrega ve kötü eklemek veya ayırt başlamak yoğun koloniler yapmak eğilimindedir. </li><li> Kültür yemekler Embriyonik Germinal hücre hattı adı, geçiş numarası ve tarih ile etiketlenmiş olmalıdır. </li></ul></li><li> Dikkatlice bir inkübatör içine 37 ° C ve% 5 CO 2 kültür kaplarına aktarın. </li><li> Hücreler her 24 saatte bir izleyin. </li><li> 48 saat sonra, koloni eki rahatsız etmemek için 250 ml medya kültürünün en üst çıkarın. Daha sonra, 250 ml taze takviye knock-out medya (37 ° C'de önceden ısıtılmış) ekleyin. </li><li> 7 adım sonra, başka bir 48 saat bekleyin ve sonra, tamamen kaldırmak ve tüm medya taze knock-out takviye medya (37 ° C'de önceden ısıtılmış) ile değiştirin. PGC koloni oluştururlar kadar 8-10 gün boyunca bu 2 günde yapın. </li></ol> Bölüm 5: Embriyonik Germinal Hücreler <ol><li> PGC izolasyon 10 gün sonra, embriyonik germinal hücre kolonileri oluşur. </li><li> Embriyonik germinal hücre hatları manuel geçişleri her 8-10 gün canlı tutulur. Farklılaşmamış bir morfoloji sunmak ve pluripotency belirteçlerinin alkalyne fosfataz, Ekim-4, SSEA-1, ve SOX-2 gibi ifade etmeye devam </li></ol> Notlar <ul><li> Steril / aseptik koşullarda kültür odası gereklidir. </li><li> Türetme ve kültür için, PGCs Arıtma Sınıf II Bio Güvenlik Kabinesi işlenir. </li><li> Inkübatörü nemlendirilmiş bir 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübatör. </li><li> Tüm medya ve reaktifler 4 kayıtlı 0,2 um filtre ° C kullanmak için önce filtre ve kullanmadan önce 37 ° C önceden ısıtılmış. </li><li> Diseksiyonu adımları sırasında, tüm embriyolar ve dokuların buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> Tüm reaktif şişeler, bir kabin içine yerleştirmeden önce etanol ile dekontamine. </li><li> Eldiven, laboratuvar önlüğü ve hemşire kapaklar kullanılması zorunludur. </li></ul> Sonuç Biz izole etmek için nasıl bir video türetmek ve gonadal sırtlar 10,5-11,5 DPC fare embriyo kültür embriyonik germinal hücrelerin sağladı. Embriyonik germinal hücre hatları tekrarlanabilir izolasyon ve uzun vadeli kültürü, erken embriyonik gelişim, genetik ve epigenetik germinal desenleri, gonad oluşumu çalışma için kritik bir temel sağlar, erkek ve dişi embriyolarda gametogenezis gelişim sürecinde organları çevreleyen çevresel etkileri, ve kanser ve kısırlığa neden yollarının belirlenmesi. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Mississippi State Üniversitesi: Bu araştırma, inceleme ve Kurumsal Hayvan Bakım ve fare protokol # 08030 (Reaktif Oksijen germ line gelişimi ve tümör oluşumu Türlerin-ROS Rolü protokol Holding ve üreme) Kullanımı Komitesi (IACUC) onayı sonrası gerçekleştirildi.

Forseps No 14 ve 15, neşter 35 mm, diseksiyon makas, cerrahi alanlar, antimikrobiyal sabun, tuzlu solüsyon% 0.9, gazlı bez, buz köpüğü konteyner, jilet, bistüri 35 mm, ince forseps 4 ve 5 sayılı, ince alay iğne ile kağıt yaprak sapı, filtre ve cam pipetler çekti.<br /<br /&gt; Ekipman: diseksiyon stereomikroskopta, ışık kaynağı Schott Fostec, inverted mikroskop, 10 mikropipet ve 200ul, santrifüj, biyo güvenlik Dolabı.

fare embriyonik germinal hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Embriyonik germinal hücrelerin yeteneği (EG), kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresi için mükemmel bir model, erken gelişim aşamalarında, ilkel germinal hücreleri (PGCs) içine ve daha sonra gamet içine ayırt etmek için. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum (DPC) fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir. Fare embriyoları gonadal sırtlar Geliştirme (C57BL6J) sonra daha önce mitotik nakavt medya huzurunda mitomisin C ile inaktive edilmiş ve Lösemi İnhibitörü ile desteklenmiş bir fare embriyo fibroblast besleyici tabaka (MEF-CF1) kaplama kollajenaz ile mekanik parçalanması, ayrışmış edildi Faktörü (LIF), temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF) ve Kök Hücre Faktörü (SCF). PCG kimlik, kültür koşulları, izolasyon, ve kurulması için optimize edilmiş, bu yöntemleri kullanarak, en fazla 40 gün için EG hücreleri uzun vadeli kültürleri izin verir. Embriyonik germinal hücre hatları, pluripotent devletin yaygın olarak kullanılan belirteçlerin embriyonik fenotip ve ifade gösterdi. İzolasyon ve kültür germinal hücrelerin türetme gelişimini anlamak ve in vitro genetik ve epigenetik düzeyde oksidatif strese maruz kaldıktan sonra birikimli hasar izlemek için bir fırsat sunmak için bir araç sağlar.

Ilkel germinal hücrelerin ayırt etmek için erken geliştirme aşamasında, embriyonik germinal hücreler, kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresine yeteneği mükemmel bir model. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

Embriyonik germinal hücrelerin (EG), erken gelişim sürecinde primordial germinal hücrelere (PGC'ler) ve daha sonra gametlere farklılaşma yeteneği...

Merhaba, ben Mississippi Eyalet Üniversitesi Üreme Genetiği ve Kök Hücre Laboratuvarı'ndan Har Moreno. Merhaba, ben de Mississippi Eyalet Üniversitesi Üreme Genetiği ve Kök Hücre Laboratuvarı'ndan Clara St. Primordial germ hücreleri veya PGC'ler, sırasıyla yumurtalıklarda oositlerin ve testislerde spermatogonial kök hücrelerin öncül hücreleridir.Fare embriyolarında PGC'ler, 8,5 ila 9,5 günlerde arka bağırsaktan göç ederek genital sırtı geçerler. Postum PGC'ler ise 10,5 ila 11,5 günlerde genital sırta ulaşırlar.TAs Postum ve D dişisinde gonadal kret oluşmaya başlar. PGC'ler, dişi gonadal kretini oluşturmaya başlamak için böbreğin lateral ucuna göç ederler. Buna karşılık erkeklerde PGC'ler mesanenin her iki yanına göç ederler.Başlamak için; erkek alridge Germ hücreleri, kısırlık ve kanser nedeni olan oksidatif stres varlığında onik gelişimsel yollarını incelemek için mükemmel bir araştırma modelidir. Öyleyse hadi başlayalım.Bugün size, 10,5 ile 11,5 günlük mouse embriyolarının gelişmekte olan gonadal sırtlarından PV Cs'lerin nasıl toplanacağını ve izole edileceğini göstereceğiz. Gonadal sırtlar, mekanik parçalama yoluyla ayrıştırılarak mouse embriyo fibroblast tabakası üzerine ekilir. Optimize edilmiş koşullar altında 10 günlük kültürden sonra, embriyonik germinal koloniler embriyonik fenotipler sergileyecektir. Ayrıca pasajlar sonrası, kloropotent markerların ekspresyonu ile tanımlanabilirler.Steril diseksiyonun bu adımı için aşağıdaki malzemeler gereklidir. Steril alanlar, pensler, makaslar, jiletler, antimikrobiyal sabunlar, salin solüsyonları, buz üzerinde PBS Pep ile doldurulmuş Petri kabı ve gazlı bez içeren paket; servikal dislokasyon ile ötanize edilmiş 10,5 ila 11 günlük postum gebeliğe sahip beş ila yedi BALB/c dişi fare. Karın bölgesini antimikrobiyal sabunla temizleyin ve ardından tıraş edin.Abdomenu salin solüsyonları kullanarak yıkayın. Steril bir gazlı bezle kurulayın. Fareyi yeni bir steril örtü ile kapatın.Pens ve makas kullanarak ventral bir insizyon yapın ve diseksiyonu gerçekleştirin. Uterusun tamamını tanımlayıp abdominal boşluktan çıkarın. Embriyolar uterusun içinde görünür olacaktır.Çok dikkatli bir şekilde. Uterin kornoa hâlâ bağlı olan ligamentlerin arasından geçirin. Vajina boyunca transvers bir kesi yaparak diseksiyonu tamamlayın.Uterusu GPVS içeren bir Petri kabına aktarın ve buz üzerinde tutun. Steril bir bistüri ve pens kullanarak, embriyoları ekstra embriyonik dokulardan ayırın.Ağız embriyolarını DPBS ile doldurulmuş taze bir Petri kabına aktarın. Ağız embriyosunun ölçülebilir uzunluğu. Embriyo yaşına göre boyutların farklılık gösterdiğini tespit ettik.Örneğin, döllemeden 8,5 gün sonra ortalama altı milimetre, döllemeden 10,5 gün sonra ortalama 11 milimetre ve döllemeden 12,5 gün sonra ortalama 16 milimetre ölçülmüştür. DNA ekstraksiyonu yoluyla kuyruklarını çıkarın. Diseksiyon için şu malzemeler gereklidir: stereo mikroskop, biyogüvenlik kabini, PDS steril neşter.Steril ince pens, saplı steril ince ayıklama iğnesi, petri kabı, filtre kağıdı tablaları. Bir petri kabına filtre kağıdı yerleştirin, ardından embriyoyu kurutmak ve diseksiyon için sabitlemek amacıyla ağız embriyosunu filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Stereo mikroskop altında, steril bir bistüri kullanarak ağız embriyosunun göbek kordonu başlangıcının üzerinden transvers bir kesi yapın.Steril ince pens ve steril ince ayırma iğnesi kullanarak bağırsakları ve karaciğeri, boşaltım sistemi görünür hale gelecek şekilde çıkarın. Mesane, medial düzlemde yer alır.Gonadal köprüler mesanenin her iki yanında yer aldığı için embriyo erkek olarak tanımlanabilir. Steril ince bir pens ve steril ince bir iğne kullanarak, destekleyici dokuyu kesip çıkararak sağ erkek gonadal sırtını uzaklaştırın. Sol erkek genital sırtını çıkarmak için aynı prosedürü uygulayın.Her iki erkek genital sırtını, taze DPDS içeren küçük bir Petri kabına mikroskobik olarak aktarın. Erkek gonadal sırtının mezonefrik kreste tutunmuş olduğunu görebilirsiniz. Erkek gonadal sırtları, stereo mikroskop altında çizgili, büyük ve oval şeklinde görünmelidir.Steril ince pensler ve steril ince bir ayırma iğnesi kullanarak bağırsakları çıkarın. Böbrekler abdominal boşluğun lateralinde yer alır; mesane ise böbreğe kıyasla daha medial ve kudal konumdadır. Dişi gonadal sırt, morfolojisi ve anatomik konumu nedeniyle erkek gonadal sırttan farklıdır.Dişi gonadal sırtlar, böbreğin kaudal lateral ucuna sıkıca tutunmuştur. Steril ince pens ve steril ince bir iğne kullanarak, sol dişi gonadal sırtı böbreğe bağlayan dokuları keserek çıkarın.Sağ dişi gonadal sırtı çıkarmak için aynı prosedürü tekrarlayın. Her iki dişi genital sırtını mikroskop altında taze PDS içeren küçük bir Petri kabına aktarın. Neso Nera'ya tutunmuş olan erkek gonadal sırtını görüntüleyebilirsiniz.Steril, ince ve keskin iğneler kullanılarak, dişi gonadal sırtların uzamış bir şekle sahip olduğu ve erkek gonadal sırtlara kıyasla daha küçük olduğu tespit edilmelidir. Steril, ince ve keskin iğneler yardımıyla dişi gonadal sırtlar, mezonefros ve diğer somatik dokulardan ayrılmalıdır. Erkek gonadal sırtlar mezonefros ve diğer somatik dokulardan ayrılmalıdır.PGC türetme sürecinde aşırı büyüme gösterecek bir somatik doku olduğu için meso Neros'un ne Natal ridge kısmından çıkarılması önemlidir. Gonad ridge, kollagenaz içeren taze DPVS damlacığı içinde toplanır. Stereo mikroskop altında, gonad dokuları steril, ince ve keskin iğneler kullanılarak küçük parçalara ayrılır.Petri kapları, 37 °C'deki bir inkübatöre 15 dakika boyunca yerleştirilir. 15 dakika sonra, doku, 40 ile 100 mikron arasında farklı çaplara sahip çekilmiş cam kapiler pipetler kullanılarak pipetleme yoluyla disosiye edilebilir. Parçalar, aşağı yukarı pipetleme yaparak parçalanır.Bu işlem küçük topakların oluşmasını sağlayacaktır. Bu küçük topaklar, yıkama işleminden sonra 0.5 µL DPDX ile yıkanır. Ardından bunlar, 2000 RPM hızında beş dakika boyunca Eend küplerine aktarılır.Santrifüj sonrası oda sıcaklığında süpernatan uzaklaştırılır ve pelet, 37 °C'de 24 saat boyunca ısıtılmış, takviyeli knockout medyasının 0.5 mL'sinde yeniden süspanse edilir. Bu işlemden önce, PGC ekiminden hemen önce inaktive edilmiş fare embriyo fibroblastları (MEF) CCF1 feeder tabakası hazırlamalısınız. Hazırlanan feeder tabakasındaki medya uzaklaştırılmalıdır.Ardından, önceden 37 °C'de ısıtılmış olan takviyeli nakavt medyasından belirli mililitreler meth feeder tabakasının üzerine ekleyin. Stereo mikroskoplar altında, simetrik bir dağılım kullanarak, küçük PT GC pompaları meth feeder tabakaları üzerine ekilir. Bu parçalar birbirine yakın olursa, agregasyon eğilimi göstererek kötü tutunan veya diferansiyasyon kültürünü başlatan yoğun koloniler oluştururlar.Kaplar; embriyonik germ hücresi hattı adı, pasaj numarası ve tarih ile etiketlenmelidir. Kültür kaplarını dikkatlice 37 °C ve %5 CO₂ içeren bir inkübatöre aktarın; izolasyondan 10 gün sonra, embriyonik germinal hücre kolonilerini karakteristik morfolojilerine göre tanımlayabilirsiniz. Ayrıca, ilk pasajdan sonra, bu koloniler alfa laktamin fosfataz, OCT4, SSEA-1 ve SSEA-4 gibi plüripoten markerların ekspresyonu ile de tanımlanabilirler.Bugün size PGC'den embriyonik germinal hücrelerin nasıl izole edileceğini ve kültüre edileceğini göstereceğiz; 10.5 ve 11.5 günlük post-konsepsiyon fareleri kullanılacaktır. Embriyonik germinal hücrelerin gametlerin öncülleri olarak karakterize edilmesi, gametogenez, fertilite ve kanserle ilgili araştırmalar için temel önem taşımaktadır.Videomuzu izlediğiniz için teşekkür ederiz. Deneyinizde başarılar dileriz.

isolation-and-derivation-of-mouse-embryonic-germinal-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, fare embriyolarının dorsolateral telensefalonundan birincil serebral korteks hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için bir protokolü göstermektedir.

Fare Embriyo Dorsolateral Telenefalonlarından Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Son yıllarda, in vitro kültür yöntemler kullanılarak germ hücre oluşumunu somatik kök hücrelerin birkaç farklı türde kullanılarak gösterilmiştir. Bu makale, görsel erken oosit benzeri hücrelere yeni doğan fare edilen kök hücrelerin farklılaşma sunacak.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Kendi kendine organizasyon, simetri kırılması ve eksenel gelişime paralel uzama gösteren fare embriyonik kök hücrelerinin agregalarını oluşturmak için bir protokol geliştirdik. Bu teknik, eksenel gelişimsel süreçlerin incelenmesine ve tek katmanlı kültürde gerçekleştirilmesi zor olan hücre tiplerinin üretilmesine izin verir.

Fare Embriyonik Kök Hücre Agregaların Üretimi Simetri Kırma, Polarizasyon ve Acil Toplu Davranış göster o<em&gt; İn Vitro</em

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Bu makale, yarı klonlanmış embriyoların yapımında sperm yerine partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Öğrenin fare embriyonik primordial germinal hücrelerinin izolasyon ve türetilmesi yöntemini. Bu protokol üreme sağlığı ve kanser araştırmalarında temel hücre gelişimini anlamak için kullanılır.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

Daha fazla video keşfet