Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

Il sistema myth si basa sul concetto di ubiquitina divisa, che si riferisce alla capacità dell'ubiquitina di essere stabilmente separata in due metà: la terminale N e UBI e la terminale C e CUB, capaci di ricostituirsi in una molecola completa di pseudo-ubiquitina. Mentre questa ricostituzione è spontanea quando si utilizza l'NUBI di tipo selvaggio, l'introduzione di una mutazione da isoleucina 13 a glicina, che produce un frammento chiamato NUBG, riduce notevolmente la sua affinità per CUV, bloccando così la formazione della pseudo-ubiquitina. Se NUBG e CUB sono fusi rispettivamente alla proteina A e alla proteina B, e se A e B sono in grado di interagire, allora la molecola di pseudo-ubiquitina può essere nuovamente formata.

Nella tecnica MYTH, le esche integrali di membrana sono fuse a un dominio di attacco costituito dal frammento CUB legato a un fattore di trascrizione artificiale. Mentre i bersagli sono fusi al frammento NUBG, un'interazione tra l'esca e il bersaglio porta alla ricostituzione della pseudo ubiquitina, che a sua volta può essere riconosciuta da enzimi citosolici deubiquitinanti, rappresentati come forbici. Questi enzimi scindono dopo il C-terminale del CUB, liberando il fattore di trascrizione, il quale può quindi entrare nel nucleo e attivare un sistema reporter, consentendo l'isolamento selettivo e l'identificazione delle cellule in cui avvengono interazioni tra BA e bersagli.

Ciao, sono Janie Snyder del laboratorio Igor STAARs dei dipartimenti di genetica molecolare e biochimica presso l'Università di Toronto. Oggi vi mostrerò un procedimento per il membrane use two hybrid o myth, e utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le interazioni delle proteine di membrana integrali. Cominciamo dunque.

Prima di eseguire l'analisi myth, verificare che la proteina esca abbia il suo estremo N e/o C nel citosol della cellula. Il tag CUB LexA VP16 deve essere fuso alla proteina in corrispondenza di tale estremità. Poiché gli enzimi deubiquitinanti necessari per il rilascio del fattore di trascrizione si trovano nel citosol, se la topologia della proteina esca non è nota, è possibile generare costrutti marcati sia all'estremità N che a quella C e utilizzare il test di controllo N-U-B-G-I descritto brevemente qui di seguito, per verificare se uno di questi è adatto all'uso in myth, indicando così che un particolare estremo è localizzato nel citosol.

Successivamente, decidere quale delle due varianti principali di myth è adatta al proprio esperimento. Per le proteine di lievito native, il metodo integrato myth, o immy, è la scelta preferita. In Imy, i Bates sono marcati endogenamente con il tag CUB Lex a VP 16, lasciandoli sotto il controllo del loro promotore nativo.

Questo è vantaggioso poiché il livello di espressione del tipo selvatico di Bates contribuisce ad eliminare i problemi associati alla sovraespressione proteica, come un aumento del numero di falsi positivi per proteine di lievito non native; può essere utilizzato il tradizionale myth o T myth, in cui l'esca con i tag CU B Lex A V VP 16 viene sovraespressa in modo ectopico da un plasmide. In questo protocollo ci concentreremo sul T myth, poiché questa forma di myth è più ampiamente applicabile; a parte la costruzione iniziale dell'esca e il tipo di mezzo utilizzato, entrambe le forme di myth vengono eseguite in maniera sostanzialmente identica. L'esca deve essere clonata in un vettore appropriato per l'aggiunta del tag e l'espressione.

Sono attualmente disponibili diversi vettori T myth, come BV four, p, a, BV four e PCM BV four, che permettono la costruzione di Bates etichettati a livello della coda C-terminale, Beit Cub Lexie, VP 16 sotto il controllo di un promotore TF uno molto forte, A DH uno forte e CYC uno debole, rispettivamente. Una volta selezionato l'effettore desiderato, si esegue una digestione con enzimi di restrizione sul plasmide nel sito di restrizione appropriato. Il taglio deve avvenire esclusivamente nelle immediate vicinanze del tag CU B Lxe VP 16 a monte del tag per l'etichettatura C-terminale o a valle per l'etichettatura N-terminale.

Ad esempio, quando si utilizza il vettore PAM BV, SFI one rappresenta una scelta ideale; dopo aver digerito il plasmide, conservarlo a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Il passaggio successivo consiste nel progettare primer per l'amplificazione e il clonaggio del gene di interesse. L'estremità cinque primi del primer diretto deve corrispondere approssimativamente a 35-40 nucleotidi a monte del sito di restrizione, mentre l'estremità tre primi deve corrispondere ai primi 18-20 nucleotidi del gene bersaglio, ovvero un DRB due che codifica per il recettore beta due e generico.

Nel nostro esempio, l'estremità 5' del primer inverso deve corrispondere al complemento inverso di circa 35-40 nucleotidi a valle del sito di restrizione. L'estremità 3' deve corrispondere al complemento inverso degli ultimi 18-20 nucleotidi del gene bersaglio, escludendo il codone di stop, se il tag CU B Lex VP 16 viene inserito al termine C, come mostrato nell'esempio. A seconda che l'etichettatura avvenga all'estremità N o C, assicurarsi che i 35-40 nucleotidi selezionati della sequenza plasmidica utilizzati nel primer diretto o inverso determinino il clonaggio del gene bersaglio in frame con CU B Lex e il tag VP 16. Poiché nel nostro esempio verrà etichettata l'estremità C della proteina A DRB due.

Le 35 basi della sequenza di A MBV nel primer inverso sono state selezionate in modo che le sequenze del gene A DRB due e del gene CUB si trovino nello stesso frame di lettura; amplificare il gene di interesse mediante PCR utilizzando i primer selezionati. I parametri della PCR dipenderanno dall'enzima specifico e dai primer utilizzati, al fine di fornire un ambiente in cui possa avvenire il ripristino della lacuna mediante ricombinazione omologa. Il plasmide precedentemente digerito e il gene di interesse amplificato vengono trasformati in una ceppa di lievito appropriata utilizzando un protocollo standard di trasformazione del lievito, come quello descritto da Geets e Woods.

Dopo che il lievito trasformato è cresciuto sulla piastra, selezionare una singola colonia del ceppo e usarla per inoculare cinque millilitri di SD privo di leucina. Far crescere il mezzo liquido a 30 gradi Celsius durante la notte, dopo che la coltura ha raggiunto la crescita notturna e la saturazione. Centrifugare le cellule a 700 ×g per cinque minuti ed eliminare il soprannatante; isolare il DNA plasmidico dell'esca dal pellet cellulare utilizzando un qualsiasi kit commerciale per mini-prep.

Seguire il protocollo standard con una modifica per garantire un'adeguata lisi delle cellule di lievito, aggiungendo un volume ridotto di 0,5 millimoli di perle di vetro al sodio-calcio al pellet dopo la risospensione iniziale e vortexare vigorosamente per cinque minuti. Procedere quindi con il protocollo commerciale in modo normale. Trasformare il DNA di lievito isolato in un ceppo di e coli chimicamente competente, adatto alla propagazione del plasmide, con un'efficienza di trasformazione di almeno 1 × 10⁷ cellule per microgrammo di DNA.

Dopo aver raccolto il DNA plasmidico dagli e. coli trasformati, verificare la corretta costruzione del plasmide esca mediante sequenziamento prima dell'uso; le ceppi esca devono essere analizzati per assicurare che le proteine esca siano correttamente localizzate nella membrana del lievito. La localizzazione viene determinata mediante microscopia a fluorescenza. L'inclusione di una molecola YFP nella sequenza del tag esca permetterà la visualizzazione diretta di cellule vive ed è comunemente utilizzata nell'imy.

In alternativa, dopo aver stabilito una corretta localizzazione dell'esca, può essere utilizzato un approccio standard di immunofluorescenza con un anticorpo diretto contro i componenti Lex A o VP16 del marcatore. È necessario verificare che l'esca non attivi autonomamente l'IE, ovvero che non attivi il sistema di reporter da sola o in presenza di proteine di controllo non interagenti. Per assicurare che l'esca non sia autoattivante, impieghiamo il test N-U-B-G-I. In questo test.

L'esca viene trasformata con un controllo positivo interagente e un controllo negativo non interagente, quindi vengono seminate su appositi mezzi selettivi diverse diluizioni di ciascun trasformante. L'esca deve svilupparsi sul mezzo selettivo in presenza del controllo positivo e non deve svilupparsi in presenza del controllo negativo per essere adatta all'uso nel test MYTH. Una volta che l'esca è stata convalidata, il ceppo reporter MYTH contenente l'esca può essere trasformato con una libreria di prede di interesse per eseguire lo screening di interazioni proteina-proteina.

Per iniziare questa trasformazione su larga scala di lievito, inoculare una singola colonia del ceppo con il reporter myth contenente l'esca in cinque millilitri di mezzo SD privo di leucina e incubare tutta la notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Diluire la coltura notturna in 200 millilitri di mezzo SD privo di leucina e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione fino a raggiungere un OD 600 compreso tra 0,6 e 0,7. Una volta raggiunto l'OD 600 desiderato, dividere la coltura da 200 millilitri in quattro provette da centrifuga con tappo a vite da 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Dopo aver lavato i pellet con acqua sterile doppiamente distillata e soluzione di acetato di litio trissy DTA, sospendiamo ciascun pellet in 600 microlitri di soluzione di acetato di litio trissy DTA in ciascuna di quattro provette centrifughe a vite da 15 millilitri. Aggiungere 2,5 millilitri di soluzione di PEG-acetato di litio a 600 microlitri di cellule risospese, 100 microlitri di soluzione di DNA di sperma di salmone e sette microgrammi di DNA della libreria preda quattro. Vortexare le provette per un minuto per assicurare un'accurata miscelazione, quindi incubare in un bagno termico a 30 gradi Celsius per 45 minuti.

Mescolare brevemente ogni 15 minuti dopo l'incubazione di 45 minuti. Aggiungere 160 microlitri di dimetilsulfossido o DMSO in ogni provetta e mescolare immediatamente capovolgendo le provette. Incubare in un bagno termico a 42 °C per 20 minuti.

Al termine dello shock termico, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere. Sospendere ciascun pellet in tre millilitri di due X-Y-P-A-D. Riunire tutti i campioni in un'unica provetta da centrifuga da 50 millilitri con tappo a vite.

Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per 90 minuti per il recupero cellulare. Centrifugare le cellule e risospendere il pellet cellulare in 4,9 millilitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9% utilizzando 100 microlitri di cellule risospese. Preparare diluizioni seriali decrescenti in cloruro di sodio sterile allo 0,9%, da 10 x a 10.000 x, piastrando 100 microlitri delle diluizioni 100 x e 1000 x su terreno selettivo e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.

Queste piastre fungono da controllo e vengono utilizzate per calcolare in modo equivalente l'efficienza della trasformazione. Dividere i restanti 4,8 millilitri di cellule risospese e distribuirli su piastre grandi da 150 millimetri, quindi incubare a 30 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Una volta cresciute le colonie, risospendere singole colonie, ciascuna rappresentante cellule contenenti una potenziale coppia esca-prede in interazione, in 100 microlitri di cloruro di sodio allo 0,9% e piastrare aliquote di cinque microlitri in terreno selettivo contenente XG, lasciando crescere per due o quattro giorni soltanto.

Si selezionano le colonie che mostrano una crescita robusta e un colore blu per ulteriori analisi. Dopo aver isolato e sequenziato i plasmidi dalle colonie di lievito positive, raccogliere e analizzare tutti i dati di sequenziamento per assemblare un elenco preliminare di interattori. Per verificare nuovamente queste interazioni, si utilizza il test di dipendenza dall'esca.

In questo test, tutti i plasmidi preda che esprimono gli interattori identificati vengono trasformati nuovamente nel ceppo originale di esca e nel ceppo contenente un’esca artificiale di controllo costituita da un singolo dominio transmembrana fuso al CUB Lex, un tag VP16. Sospendere singole colonie provenienti da queste trasformazioni in 100 microlitri di acqua sterile doppiamente distillata e depositare volumi di cinque microlitri sui rispettivi terreni selettivi aggiunti di X sc. Idealmente, dovrebbero essere selezionati più trasformanti per ogni preda e sia l’esca originale che l’esca artificiale dovrebbero essere inoculate sulla stessa piastra. Incubare le piastre da due a quattro giorni a 30 gradi Celsius. I lieviti che portano l’esca artificiale e in cui la preda provoca l’attivazione del sistema reporter sono considerati promiscui e quella specifica preda viene rimossa dall’elenco degli interattori.

Lodi che inducono crescita e colorazione blu nel lievito con l'esca di interesse, ma non con l'esca artificiale. Confermare un'interazione specifica. Se tuttavia il lievito che ospita la preda e la vostra esca di interesse non cresce.

Questa preda viene rimossa dall'elenco degli interattori. Le prede rimanenti costituiscono l'elenco completo degli interattori identificati nel test mito. Al termine della procedura mito, si otterrà una mappa degli interattori.

Questa rappresenta una raccolta di interazioni candidate che il ricercatore deve ulteriormente analizzare mediante studi specifici determinati caso per caso. Per valutare il significato biologico di ciascuna, vi abbiamo appena mostrato come eseguire la procedura di membrana E due ibrida o myth per identificare i partner interagenti di una proteina di interesse. Quando si esegue la procedura myth, è importante verificare che la proteina di interesse abbia il suo estremo N-terminale o C-terminale localizzato nel citoplasma della cellula e progettare di conseguenza la strategia di marcatura.

Inoltre, è fondamentale valutare attentamente che i ceppi contenenti l'esca esprimano correttamente l'esca stessa e che questa sia localizzata in modo appropriato. Inoltre, è importante eseguire il test di controllo NUB GI poiché risulta utile per stabilire le condizioni di screening. Infine, assicurarsi di verificare in modo indipendente tutte le interazioni rilevate mediante myth.

Seguendo questi semplici passaggi si dovrebbe garantire di ottenere i migliori risultati possibili dalla procedura myth. Bene, è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.