Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

Il sistema del mito si basa sul concetto di ubiquitina divisa, che si riferisce alla capacità dell'ubiquitina di essere separata stabilmente in estremità terminali e UBI e C terminali CUB in grado di ricostituirsi in una molecola di pseudo ubiquitina a lunghezza intera. Sebbene questa ricostituzione sia spontanea quando si utilizza l'introduzione di un ISIN 13 in una mutazione da ISIN 13 a glicina, la produzione di un frammento chiamato NUBG riduce notevolmente la sua affinità per CUV, bloccando così la formazione di ubiquitina pseu. Se il NUBG e il CUB sono fusi rispettivamente con la proteina A e la proteina B e A e B sono in grado di interagire, allora la molecola di ubiquitina pseu può essere nuovamente formata.

Nel mito, le esche a membrana integrale sono fuse per attaccare costituite dal frammento CUB collegato a un fattore di trascrizione artificiale. Mentre le lodi sono fuse al frammento NUBG, un'interazione tra l'esca e la preda porta alla ricostituzione della pseudo ubiquitina, che a sua volta può essere riconosciuta da enzimi citosolici de ubiquitinati illustrati come forbici. Questi enzimi si scindono dopo l'estremità C del CUB rilasciando il fattore di trascrizione, che può quindi entrare nel nucleo e nel sistema reporter dell'attivatore, consentendo l'isolamento selettivo e l'identificazione delle cellule in cui si verificano interazioni con le prede BA.

Ciao, sono Janie Snyder dell'Igor STAARs Lab presso i dipartimenti di genetica molecolare e biochimica dell'Università di Toronto. Oggi vi mostrerò una procedura per l'uso di membrana di due ibridi o miti, e usiamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le interazioni delle proteine integrali di membrana. Quindi iniziamo.

Prima di condurre l'analisi del mito, verifica che la tua proteina esca abbia il suo terminale N e o C nel citosol della cellula. Il tag CUB Lex A VP 16 deve essere fuso con la tua proteina a tale terminale. Poiché gli enzimi de ubiquitinati necessari per il rilascio del fattore di trascrizione si trovano nel citosol, se la topologia della proteina esca non è nota, è possibile generare costrutti etichettati sia all'estremità NNC che utilizzando il test di controllo N-U-B-G-I descritto a breve, vedere se uno di questi è adatto per l'uso nel mito, indicando così che un particolare terminale è citosolico.

Successivamente, decidi quale delle due principali varianti del mito è adatta al tuo esperimento. Per le proteine del lievito autoctone, il mito integrato o immy è il metodo preferito. In Imy Bates sono marcati endogenamente con il CUB Lex un tag VP 16, lasciandoli sotto il controllo del loro promotore nativo.

Questo è vantaggioso in quanto il livello di espressione wild type di Bates aiuta a eliminare i problemi associati alla sovraespressione proteica, come un aumento del numero di falsi positivi per proteine di lievito non native, il mito tradizionale o il mito T possono essere utilizzati in cui l'esca tag CU B Lex A V VP 16 è sovraespressa localmente ECT da un plasmide. Ci concentreremo sul mito T in questo protocollo poiché questa forma di mito è più ampiamente applicabile con l'eccezione della costruzione iniziale dell'esca e dei media utilizzati, entrambe le forme di mito sono eseguite in modo essenzialmente identico. L'esca deve essere clonata in un vettore appropriato per l'etichettatura e l'espressione.

Attualmente sono disponibili una varietà di vettori del mito T come BV four, p, a, BV four e PCM BV four, che consentono la costruzione di c targati terminalmente Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 sotto il controllo di un promotore TF molto forte, A DH forte e CYC 1 debole, rispettivamente. Una volta selezionato l'effettore di squadra, la restrizione digerisce il plasmide nel sito di restrizione appropriato. La scissione deve avvenire solo nelle immediate vicinanze del tag CU B Lxe VP 16 a monte del tag per l'etichettatura del terminale C o a valle per l'etichettatura del terminale N.

Ad esempio, quando si utilizza il vettore PAM BV, SFI one è la scelta ideale, dopo che il plasmide è stato digerito, conservato a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso, il passo successivo è quello di progettare primer per l'amplificazione e il clonaggio del gene di interesse. Le cinque estremità prime del primer in avanti devono corrispondere a circa 35-40 nucleotidi a monte del sito di restrizione. Mentre i tre primi devono corrispondere ai primi 18-20 nucleotidi del gene bersaglio, che è un DRB due che codifica per il beta due e il recettore generico.

Nel nostro esempio, le cinque estremità prime del primer inverso devono corrispondere al complemento inverso di circa 35-40 nucleotidi a valle del sito di restrizione. Con le tre estremità prime che corrispondono al complemento inverso degli ultimi 18-20 nucleotidi del gene bersaglio, omettendo il codice di arresto se il CUB, ad esempio, il tag VP 16 viene posizionato all'estremità C come viene fatto nell'esempio mostrato, a seconda che venga eseguita la marcatura terminale N o C, garantire che i 35-40 nucleotidi selezionati della sequenza plasmidica utilizzata nel primer diretto o inverso comportino la clonazione del gene bersaglio in frame con il CU B Lex, un tag VP 16. Poiché nel nostro esempio verrà marcato il C terminale della proteina A DRB due.

Le 35 basi della sequenza A MBV nel primer inverso sono state selezionate in modo tale che le sequenze geniche A DRB due e CUB si trovino all'interno dello stesso frame di lettura, amplificando il gene di interesse mediante PCR utilizzando i primer selezionati. I parametri della PCR dipenderanno dal particolare enzima e dai primer specifici utilizzati per fornire un ambiente in cui può avvenire la ricombinazione omologa di riparazione del gap. Il plasmide precedentemente digerito e il gene amplificato di interesse vengono trasformati in un ceppo di lievito appropriato utilizzando un protocollo di trasformazione del lievito standard come quello descritto da geets e woods.

Una volta che il lievito trasformato è cresciuto sulla piastra, raccogli una singola colonia del ceppo e inoculala in cinque millilitri di SD meno leucina. I terreni liquidi crescono a 30 gradi Celsius durante la notte dopo che la coltura è cresciuta durante la notte e ha raggiunto la saturazione. Centrifugare le cellule a 700 GS ogni cinque minuti e rimuovere il DNA del plasma esca isolato surnatante dal pellet cellulare utilizzando qualsiasi mini kit di preparazione commerciale.

Seguire il protocollo standard con una sola modifica al fine di garantire una lisi cellulare di lievito sufficiente a un volume ridotto di 0,5 millimolari di perle di vetro soda-calcico sul pellet dopo la sospensione iniziale di resus, e vorticare vigorosamente per cinque minuti. Quindi procedi con il protocollo commerciale come di consueto. Trasformare il DNA di lievito isolato in un ceppo di e coli chimicamente competente adatto alla propagazione del plasmide con un'efficienza di trasformazione di almeno una volta 10 alla settima cellula per microgrammo di DNA.

Dopo aver raccolto il DNA plasmatico dall'e coli trasformato, verificare la corretta costruzione del plasmide esca mediante sequenziamento prima dell'uso I ceppi di esca devono essere analizzati per garantire che le proteine dell'esca siano correttamente localizzate sulla membrana del lievito. La localizzazione viene determinata utilizzando la microscopia a fluorescenza. L'inclusione di una molecola YFP nella sequenza del tag esca consentirà la visualizzazione diretta di cellule vive ed è comunemente usata in imy.

In alternativa, è possibile utilizzare un approccio standard di immunofluorescenza che utilizza anticorpi contro i componenti Lex A o VP 16 del tag dopo che è stata stabilita la corretta localizzazione dell'esca. È necessario assicurarsi che l'esca non sia autoattivante IE, non attivi il sistema reporter da solo o in presenza di lodi non interagenti per garantire che l'esca non sia autoattivante, impieghiamo il test N-U-B-G-I. In questo test.

L'esca viene trasformata con elogi di controllo positivi e negativi non interagenti, quindi diverse diluizioni di ciascun trasformante vengono individuate su mezzi selettivi appropriati. L'abate deve crescere su terreni selettivi in presenza del controllo positivo e non cresce in presenza del controllo negativo per essere adatto all'uso nel mito. Una volta che l'esca è stata convalidata, il ceppo reporter del mito contenente l'esca può essere trasformato con una libreria di prede di interesse per lo screening delle interazioni proteico-proteiche.

Per iniziare questa trasformazione del lievito su larga scala, inoculare una singola colonia del ceppo reporter del mito contenente l'esca in cinque millilitri di SD meno leucina e incubare per una notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Diluire la coltura notturna in 200 millilitri di SD meno leucina e incubare a 30 gradi Celsius agitando fino a raggiungere un OD 600 da 0,6 a 0,7. Quando l'OD target di 600 è stato raggiunto, dividere la coltura da 200 millilitri tra quattro provette da centrifuga con tappo a vite da 50 millilitri e raccogliere le cellule tramite centrifugazione.

Dopo aver lavato i pellet con acqua sterile a doppia distillazione e soluzione trissy DTA di acetato di litio, sospendiamo ogni pellet in 600 microlitri di soluzione trissy DTA di acetato di litio a ciascuna delle quattro provette da centrifuga a vite da 15 millilitri. Aggiungere 2,5 millilitri di soluzione di acetato di litio PEG, due 600 microlitri di cellule risospese, 100 microlitri di soluzione di DNA spermatico di salmone e sette microgrammi di DNA della libreria delle prede, quattro. Inviare i tubi con un testo per un minuto per garantire una miscelazione completa, quindi incubare a bagnomaria a 30 gradi Celsius per 45 minuti.

Mescolare brevemente ogni 15 minuti dopo i 45 minuti di incubazione. Aggiungere 160 microlitri di dimetilsolfossido o DMSO a ciascuna provetta e mescolare immediatamente capovolgendo le provette. Incubare a bagnomaria a 42 gradi Celsius per 20 minuti.

Quando lo shock termico è completo, raccogliere le celle mediante centrifugazione e risus. Sospendere ciascuno dei pellet in tre millilitri di due X-Y-P-A-D. Raccogli tutti i campioni in un'unica provetta da centrifuga da 50 millilitri con tappo a vite.

Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per 90 minuti per il recupero cellulare. Centrifugare le cellule e risospendere il pellet cellulare in 4,9 millilitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9% utilizzando 100 microlitri di cellule risospese. Preparare una diluizione seriale dieci volte in cloruro di sodio sterile allo 0,9% da 10 x a 10.000 x piastra, 100 microlitri della diluizione 100 x e 1000 x su terreno selettivo e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.

Queste piastre fungono da controllo e vengono utilizzate per calcolare equamente l'efficienza della trasformazione. Dividere i restanti 4,8 millilitri di cellule risospese e piastrarli su grandi piastre da 150 millimetri e incubare a 30 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Una volta che le colonie sono cresciute, sospendere singole colonie, ciascuna delle quali rappresenta cellule contenenti una potenziale coppia di prede esca interagenti in 100 microlitri di cloruro di sodio allo 0,9% e immergere aliquote di cinque microlitri in terreni selettivi contenenti XG per consentire la crescita solo per due o quattro giorni.

Le colonie che mostrano una crescita robusta e un colore blu vengono selezionate per ulteriori analisi. Dopo aver isolato e sequenziato i plasmidi dalle colonie di lievito positive, compila e analizza tutti i dati di sequenziamento per assemblare il tuo elenco preliminare di interattori. Per ricontrollare queste interazioni, viene utilizzato il test di dipendenza esca.

In questo test, tutti i plasmi di preda che esprimono gli interattori identificati vengono trasformati nuovamente nel ceppo di esca originale e nel ceppo che ospita un'esca artificiale di controllo costituita da un singolo dominio transmembrana fuso al CUB Lex, un tag VP 16 risospendere singole colonie da queste trasformazioni in 100 microlitri di acqua sterile doppiamente distillata e individuare volumi di cinque microlitri sotto il terreno selettivo appropriato più X sc. Idealmente, Più trasformanti dovrebbero essere selezionati per ogni preda e sia l'esca originale che l'esca artificiale dovrebbero essere individuate sullo stesso piatto. Incubare le piastre per due-quattro giorni a 30 gradi Celsius il lievito che trasporta l'esca artificiale nelle prede che causano l'attivazione del sistema reporter sono considerate promiscue e quella preda specifica viene rimossa dall'elenco degli interattori.

Lode che causano la crescita e la colorazione blu nel lievito con l'esca di interesse ma non l'esca artificiale. Conferma un'interazione specifica. Se invece il lievito che ospita la preda e la tua esca di interesse non crescono.

Questa preda viene rimossa dall'elenco degli interattori. Gli elogi rimanenti costituiscono l'elenco completo degli interattori identificati nella schermata del mito. Al termine della procedura del mito, avrai una mappa di casa interagire.

Si tratta di una raccolta di interazioni candidate che il ricercatore deve analizzare ulteriormente utilizzando studi specifici determinati caso per caso. Per valutare il significato biologico di ciascuno, vi abbiamo appena mostrato come eseguire la procedura ibrida o mito di membrana E due per identificare i partner interagenti di una proteina di interesse. Quando si esegue la procedura del mito, è importante verificare che il proprio essere di interesse abbia la sua estremità e/o il terminale C situati nel cito della cella e progettare la strategia di tagging di conseguenza.

Inoltre, è importante valutare attentamente che i ceppi dell'esca esprimano correttamente l'esca e che l'esca sia localizzata correttamente. Inoltre, è importante eseguire il test NUB GI Control in quanto è utile per aiutare a stabilire le condizioni di screening. Infine, assicurati di verificare in modo indipendente tutte le interazioni che rilevi utilizzando il mito.

Seguire questi semplici passaggi dovrebbe assicurarti di ottenere i migliori risultati possibili dalla procedura del mito. Bene, questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.