Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine ​​in cellule di mammifero

L'analisi delle catene di zuccheri non legate sui glicoproteine inizia con la marcatura dei glicani e delle cellule con manosio triziato. La piastra di marcatura viene raffreddata sul ghiaccio mentre la piastra di chasing è incubata senza marcatura per un periodo desiderato. Successivamente, i campioni vengono lisiati e un glicoproteina di interesse viene immunopurificata, denaturata e i suoi glicani vengono rilasciati enzimaticamente.

Gli oligosaccaridi vengono ulteriormente purificati mediante filtrazione molecolare, che li separa dalle proteine e da altri contaminanti di dimensioni superiori a 30 chilodalton. I glicani vengono quindi separati mediante HPLC. La quantità di ciascuna forma di glicano viene determinata misurando l'intensità del segnale radioattivo in ciascuna frazione eluita.

Ciao, sono Edward Azo del laboratorio di Hi Geraldo Letter Kremer del Dipartimento di Ricerca Cellulare e Immunologia dell'Università di Tel Aviv. Faccio anche parte del laboratorio di Gerardo Letter Kremer. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento e l'analisi di oligosaccaridi marcati metabolicamente e legati.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la dinamica dell'elaborazione delle catene di zucchero sia per i pool totali di glicoproteine cellulari che per singole glicoproteine. Bene, ora iniziamo. Per iniziare questa procedura, utilizzare cellule NIH three T three coltivate durante la notte in una piastra da 90 millimetri.

Per ogni campione, la coltura è subconfluente per privare le cellule di glucosio; preparare un mezzo fresco privo di glucosio due volte, integrato con il 20% di siero fetale bovino dializzato e 8 millimoli di piruvato di sodio. Diluire un volume della quantità desiderata del mezzo 2X con un volume di acqua deionizzata. Riscaldare preventivamente il mezzo, quindi incubare ogni campione cellulare in 5 millilitri di mezzo fresco preriscaldato per 5-15 minuti. Se il tempo di chase supera le 12 ore, le cellule devono essere manipolate in condizioni sterili.

Al termine del periodo di incubazione, contrassegnare le piastre corrispondenti ai campioni di pulse e chase. Per etichettare gli N-glicani per l'analisi dei glicoproteine mediante immunoprecipitazione, sostituire il mezzo di privazione con un millilitro di mezzo privo di glucosio preriscaldato, integrato con 400 microcurie per millilitro di due mannosio marcati con trizio. Utilizzare 65 microcurie per millilitro per l'etichettatura e l'analisi dei glicoproteine totali.

Dopo aver sostituito il mezzo di privazione, incubare le cellule nelle normali condizioni di coltura tissutale per un'ora. Al termine dell'incubazione di un'ora, rimuovere il mezzo di marcatura da tutti i campioni. Aggiungere con attenzione due millilitri di PBS a quattro gradi Celsius ai campioni corrispondenti al pulse e posizionarli sul ghiaccio. Questi campioni sono indicati come pulse.

Utilizzare due millilitri di mezzo di coltura normale completo preriscaldato per risciacquare i campioni di chase tre volte. Quindi aggiungere cinque millilitri del mezzo normale preriscaldato alle cellule.

Collocare i campioni di chase in un incubatore a biossido di carbonio a 37 gradi Celsius per i periodi di chase desiderati. Durante l'incubazione dei campioni di chase, lavare i campioni di pulse, che sono stati lasciati sul ghiaccio, tre volte con due millilitri di PBS freddo di ghiaccio. Quindi utilizzare una spatola per cellule per staccare le cellule dalla piastra.

In due millilitri di PBS, trasferire le cellule rilasciate in una provetta EOR da due millilitri. Centrifugare le cellule a 16.000 ×g per sei-dieci secondi per rimuovere il soprannatante e congelare il pellet cellulare a meno 80 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione dei campioni di chase, lavarli.

Centrifugare e conservare come appena mostrato per i campioni di impulso. Quando si è pronti per proseguire con la lisi cellulare, rimuovere le cellule dal congelatore. Per l'analisi di immunoprecipitazione, lisare le cellule aggiungendo 300 microlitri di tampone.

Vortexare brevemente e incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Per l'analisi dei campioni di glicoproteine totali, utilizzare 300 microlitri di buffer B. Incubare le cellule per 20 minuti sul ghiaccio, seguito da sonificazione per quattro volte, 10 secondi ciascuna, a ampiezza massima. Successivamente, far bollire i campioni per cinque minuti.

Infine, centrifugare tutti i lisati a 16.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il soprannatante in una nuova provetta EOR e scartare il pellet. Procedere con l'IP per esaminare una proteina di interesse mediante immunoprecipitazione della glicoproteina H two A illustrata in questo caso.

Aggiungere 20 microlitri per campione di proteina A agro speeds e 3 microlitri per campione dell'anticorpo policlonale di coniglio anti H two A al sopranatante delle cellule lisate. Incubare i campioni da quattro a 16 ore a quattro gradi Celsius, mescolando costantemente mediante rotazione lenta. Al termine dell'incubazione, centrifugare per sedimentare le perle e rimuovere con attenzione il sopranatante utilizzando un vuoto, quindi lavare le perle quattro volte aggiungendo 500 microlitri di buffer tea.

Eseguire quattro centrifugazioni per far sedimentare le perle e rimuovere il soprannatante, al fine di rilasciare le proteine legate alle perle. Aggiungere 10 microlitri di tampone denaturante del kit endo H al pellet di perle e far bollire i campioni per cinque minuti. Centrifugare nuovamente le perle e trasferire il soprannatante in una nuova provetta EOR.

I proteine ellu sono ora pronte per la deglicosilazione. I glicani vengono rilasciati sia dai campioni di IP che dai campioni totali di proteine utilizzando l'enzima e OH. Per i campioni di IP, aggiungere 0,5 microlitri di enzima endo H a ciascun campione insieme a 10 microlitri del buffer di reazione endo H 2x. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per tre ore.

Per le glicoproteine totali, applicare il sopranatante dei lisati cellulari su un filtro MicroCon con cutoff di 30 chilodalton. Lavare l'estratto proteico totale tre volte con 100 microlitri di tampone E mediante centrifugazioni ripetute a 14.000 G per tre minuti. Aggiungere tre microlitri di tampone di reazione endo H 10x e 1,5 microlitri dell'enzima endo H al MicroCon in cui rimangono le proteine lavate e incubare per tre ore a 37 gradi Celsius insieme ai campioni di immunoprecipitazione.

Al termine dell'incubazione di tre ore, diluire il campione di immunoprecipitazione di cinque volte con acqua deionizzata e posizionarlo sopra un nuovo filtro MicroCon, quindi centrifugare a 14.000 G per tre minuti. Procedere al lavaggio sia del campione di immunoprecipitazione che dei campioni di proteine totali aggiungendo 50 microlitri di acqua deionizzata e centrifugando i campioni. Ripetere altre due volte. Conservare il flusso passante contenente i glicani scissi, se desiderato, attraverso provette contenenti glicoproteine resistenti all'endo H. I glicoproteine resistenti vengono quindi incubate con 200 unità milli di N-glicosidasi F in 15 microlitri di tampone C a 37 gradi Celsius per 16 ore.

L'eluizione con acqua deionizzata viene eseguita come appena mostrato. Asciugare completamente i campioni utilizzando un concentratore a vuoto con riscaldamento fino a 45 gradi Celsius per accelerare il processo. Ri-sospendere i pellet secchi in 12 microlitri di solvente HPLC e caricare i campioni su una colonna sphero o ammino installata nel dispositivo HPLC.

Eseguire i campioni come descritto nel protocollo scritto allegato. Raccogliere 48 frazioni per ogni corsa del campione. Utilizzare un contatore a scintillazione per misurare i valori di CPM delle frazioni raccolte e tracciare il valore di CPM in funzione del numero di frazione.

Calcolare la percentuale di residui di manos di tutte le specie di glicani come descritto nel protocollo scritto allegato. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi dell'analisi delle catene zuccherine di glicoproteine totali da un campione sottoposto a marcatura pulsata di un'ora. Il valore di CPM delle frazioni HPLC è riportato in funzione del numero di frazione nel profilo risultante.

In ogni picco rappresenta una specifica specie di glicano identificata mediante una corsa HPLC di standard glicanici noti. Per ogni specie di glicano, la sua percentuale molare rispetto al totale dei glicani viene riportata in funzione del tempo di chase. Il tempo mostrato qui è un'analisi di questo tipo relativa a un particolare glicoproteina malripiegata isolata mediante immunoprecipitazione da un campione trattato con l'inibitore del proteasoma MG 1 32.

La specie di glicano trimmato M cinque sei si accumula durante il periodo di chase, portando alla conclusione che gli oligosaccaridi presenti su una proteina malripiegata subiscono un esteso trimming di mannosio prima della degradazione. Questo risultato contrasta con quello osservato per gli oligosaccaridi presenti sui glicoproteini totali provenienti da campioni trattati nello stesso modo: in questo caso, M nove otto rimane la principale specie di glicano durante il chase, con solo un lieve aumento della quantità di M cinque sei. Ciò porta alla conclusione che solo una piccola frazione dell'intero pool di glicoproteine è indirizzata alla degradazione delle proteine associate al reticolo endoplasmatico (ERAD).

Rad. abbreviato. Come spiegato più dettagliatamente nel protocollo scritto allegato, abbiamo appena mostrato come utilizzare una combinazione di palase in cellule vive e analisi HPLC per seguire la dinamica della composizione di oligosaccaridi non legati durante il ciclo di vita di una glicoproteina. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di evitare contaminazioni dei campioni di chase con tracce di sostanze radioattive, che comporterebbero un'etichettatura indesiderata dei glicani durante i periodi di chase durante la separazione per dimensione.

È inoltre importante regolare l'HPLC a una pressione costante per garantire la coerenza della frazionatura dei glicani. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.