Name: Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine in cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Scopri l'analisi pulse-chase delle catene glicidiche N-linked in glicoproteine di cellule di mammifero. Questo metodo consente di tracciare le modifiche metaboliche delle glicani nel tempo mediante marcatura radioattiva e HPLC.

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Ringraziamo Zehavit Frenkel e Sandra Tolchinsky per l&#39;assistenza tecnica. Ricerca nel settore di questo lavoro è supportato anche da finanziamenti la Israel Science Foundation (1229-1207) e il tedesco-israeliano di cooperazione del progetto (DIP-DFG).

Il seguente protocollo è stato progettato per l'analisi delle catene di zuccheri di glicoproteine ​​totale o di una glicoproteina di interesse specifico. La procedura è sostanzialmente la stessa per entrambi i casi con alcune modifiche come affermato in tutto il protocollo. <ol><li> Per l'etichettatura metabolico di N-glicani legati uno ha bisogno di usare una cultura subconfluent di cellule di mammifero coltivate durante la notte in un piatto da 90 mm per ogni campione (i campioni possono rappresentare diversi momenti o trattamenti). Questo protocollo è ottimizzato per le cellule NIH 3T3. </li><li> Affamare le cellule di glucosio da parte incubazione in 5 ml di preparati al momento pre-riscaldato (37 ° C) glucosio senza media, in dotazione con il 10% FCS dializzati e 4 mM di piruvato di sodio per 5-15 minuti. </li><li> Sostituire il supporto fame con 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) glucosio senza supporto contenente 400 μCi di [2 - 3 H]-marcato mannosio (la concentrazione più bassa di 65 μCi / ml viene usato per l'etichettatura di glicoproteine ​​totale), e incubare le cellule in condizioni normali coltura dei tessuti per 1 ora. </li><li> Rimuovere il supporto di etichettatura da ogni campione, ed aggiungere con cautela 2 ml di PBS a 4 ° C per i campioni corrispondenti a impulsi e disporli sul ghiaccio (questi campioni sono indicati come legumi), mentre i campioni corrispondenti alla caccia devono essere risciacquati 3 volte con 2 ml di pre-riscaldato (37 ° C) media normale cultura completa, e quindi posto in un incubatore CO 2 a 37 ° C con 5 ml di pre-riscaldato medio regolare per i periodi di caccia desiderato. </li><li> Sciacquare i campioni di impulsi (precedentemente immessi sul ghiaccio) 3 volte con 2 ml di PBS ghiacciata. Le cellule sono poi raschiato il piatto in 2 ml di PBS usando un raschietto cellula, e messo in una provetta da 2 ml Eppendorf. </li><li> Short-spin le cellule a 16000Xg (6-10 sec), scartare il supernatante e congelare il pellet di cellule a -80 ° C. </li><li> Eseguire i punti 5 e 6 anche per i campioni inseguimento al termine del tempo di caccia. </li><li> Rimuovere le cellule dal congelatore e lisare loro con l'aggiunta di 300 ml di tampone A, vortex brevemente e incubando per 20 minuti sul ghiaccio, o nel caso di totale analisi glicoproteine, mediante incubazione 20 min in ghiaccio con tampone B, seguita dalla sonicazione (4 volte, 10 sec, massima ampiezza), poi far bollire i campioni per 5 minuti. </li><li> Centrifugare i lisati a 16000Xg per 20 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta Eppendorf e scartare il pellet. </li><li> Se l'analisi di glicoproteine ​​totale, procedere alla filtrazione molecolare e deglycosylation (punto 17). Per immunoprecipitazione della glicoproteina H2a dimostrato qui, aggiungere 20l/sample di (Repligen) proteina A-agarosio perline 01:01 sospensione e 3 ml / campione del nostro coniglio policlonale anticorpo anti H2a per la glicoproteina desiderato (nel nostro esempio anticorpi anti-H2a ), per il surnatante dal punto 9. </li><li> Incubare i campioni per 4-16 ore a 4 ° C, mescolando continuamente con rotazione lenta. </li><li> Spin giù le perle al 16000Xg per 30 secondi, e rimuovere con attenzione il vuoto surnatante utilizzando. </li><li> Sciacquare le perline, con l'aggiunta di 500 microlitri di buffer D e vortex. Spin, come nel passaggio 12 e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio per 3 volte. </li><li> Aggiungere 10μl di buffer denaturazione (fornito con il endo-H NEB kit) al pellet tallone e bollire i campioni per 5 minuti (quando le proteine ​​totali sono analizzati, il deglycosylation viene eseguita sul filtro microcontrollore, punto 17). </li><li> Spin giù le perline (16000Xg per 30 secondi), e trasferire il surnatante in un nuovo tubo Eppendorf. Poi 0.5μl di enzima endo H vengono aggiunti ad ogni campione con 10 ml di buffer di reazione (anche in dotazione con il kit endo ONA H), ei campioni sono incubati a 37 ° C per 3 ore. </li><li> Per separare i glicani rilasciati dalle proteine, il campione viene diluito 5 volte con acqua deionizzata e posto sulla cima di un filtro molecolare (microcontrollore Ultracel YM30), con un 30kDa cut-off, poi centrifugato a 14000Xg per 3 min. Applicare 50μl di acqua deionizzata e ripetere la centrifugazione dei campioni. Questo lavaggio viene ripetuto altre 2 volte, mantenendo la flow-through. </li><li> Se si sta analizzando glicoproteine ​​totale, applicare il sovranatante della lisati (dal punto 9) per il filtro microcontrollore. Lavare l'estratto con 100 l di tampone E, 3 volte per centrifugazione ripetuto a 14000Xg per 3 min. Aggiungere 3 ml di buffer di reazione 10X endo H e 1,5 l di enzima endo H al retentato microcontrollore, e incubare per 3 ore a 37 ° C. I glicani rilasciati vengono eluiti con acqua deionizzata da 3 centrifugazioni ripetute, come al punto 16. </li><li> Se lo si desidera, retentates da passaggi da 16 e 17, contenenti endo H-resistenti glicoproteine ​​vengono poi incubate con 200mU di N-glicosidasi F in 15 ml di tampone C, a 37 ° C per 16 h. Eluizione con acqua deionizzata è fatto come nel passaggio 16. </li><li> Collocare la provetta contenente la reazione endo H flow-through (passaggi da 16 e 17) in un concentratore SpeedVacE asciugare completamente i campioni (questo può essere fatto fino a 45 ° C per accelerare questo processo). </li><li> Per preparare i campioni per HPLC, risospendere il pellet asciutto in 12 ml di solvente per HPLC (acetonitrile: acqua, 60:40, acido fosforico 1%). </li><li> Regolare il dispositivo di HPLC (collegato alla colonna Spherisorb) a flusso costante del solvente (1 ml / min) e pressione (un particolare valore tra 1000 e 2000 psi), e inserire un raccoglitore di frazioni di cambiare un tubo ogni 1 minuto. </li><li> Caricare i campioni nel dispositivo HPLC e avviare il raccoglitore di frazioni contemporaneamente. </li><li> Raccolgono 48 frazioni di 1 ml di ogni campione e correre da una corsa di una miscela standard di oligosaccaridi. </li><li> Trasferire 500 microlitri di ogni frazione di una fiala di scintillazione, e mescolare il contenuto con 3 ml di acqua-liquido miscibile scintillazione. </li><li> Caricare le fiale e leggere in un contatore a scintillazione. </li><li> La lettura cpm viene tracciata in funzione del numero di frazione. </li><li> I valori di cpm all'interno di un picco di rappresentare una determinata specie glycan come segue: frazioni 18-21 corrispondono a M5, M6 frazioni di 22-26, 27-31 frazioni di M7, M8 per 32-35 frazioni, frazioni 36-39 a M9, frazioni 40-42 a 43-45 G1M9 e le frazioni di G2M9. </li><li> La somma dei valori di cpm per le frazioni all'interno di ogni picco riflette la quantità assoluta di una specie glicano specifico. Al fine di compensare il fatto che le specie che contengono più residui di mannosio acquisire più etichetta, la "quantità relativa molare" di ogni specie glicano è calcolato come segue: la quantità assoluta di ciascuna specie glicano è diviso per il numero di residui di mannosio che contiene . Questo valore viene quindi diviso per la somma degli importi relativi molare di tutte le specie glicano ottenute per ottenere il "per cento del totale" per ciascuna specie glycan specifico. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> Chase (h) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> Rilasciato con endo H (cpm) un </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> Rilasciato con N-glicosidasi F (cpm) b </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> Glicoproteine ​​in retentato (cpm) c </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolichol-oligosaccaridi a retentato (cpm) d </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolichol-oligosaccaridi a retentato (%) e </td><td> 1,4 ± 0,7 </td><td> 0,2 ± 0,2 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Analisi del rilascio di N-linked catene di zuccheri con deglycosidases e della presenza di dolichol-oligosaccaridi in campioni glicoproteina. Abbiamo applicato la procedura di pulse-chase ad un lisato di cellule NIH 3T3. Dopo filtrazione microcontrollore, etichettato oligosaccaridi N-linked sono stati rilasciati principalmente con endo H dopo impulso etichettatura (alta tipo di mannosio) e con un ulteriore trattamento con N-glicosidasi F dopo un periodo di caccia, il che corrisponderebbe a tipo complesso (Golgi-lavorati glicani), endo H oligosaccaridi resistenti. Questa analisi quantitativa ha determinato che dolichol-oligosaccaridi, rappresentano una frazione insignificante del marchio nel retentato iniziale. Note: <ol class="lalpha"><li> Cellule NIH 3T3 sono stati etichettati con impulsi [2 - 3 H] mannosio e inseguito con terreno completo. Dopo la lisi cellulare e filtrazione attraverso microcontrollore YM30, alta mannosio oligosaccaridi N-linked sono stati rilasciati da retentates da incubazione con endo H. </li><li> Endo H-materiale resistente in retentates microcontrollore da (a) è stato poi incubato con N-glicosidasi F e rilasciato oligosaccaridi misurata in un contatore a scintillazione. </li><li> Retentates microcontrollore ottenuto come in (a) prima del trattamento endo H, sono stati estratti 4 volte con cloroformio: metanolo: acqua 10:10:03 rimuovere glicolipidi precursore, e il materiale non estratto solubilizzate in NaOH 1N e contate in un contatore a scintillazione. </li><li> Dolichol-oligosaccaridi sono state purificate da estratti (c), come descritto al punto 1 e contate in un contatore a scintillazione. </li><li> Media di 3 esperimenti per cento dei dolichol-oligosaccaridi (d) del cpm totale retentato (c + d). </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pulse-chase analisi del totale delle glicoproteine ​​NIH 3T3 in cellule non trattate e sulla inibizione del proteasoma Dopo 1h impulsi etichettatura con. [2 - 3 H] abbiamo ottenuto un profilo atteso con una certa glucosilatiprecursori rimanenti (Glc 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) e G1M9), ma la maggior parte delle etichette presenti nella M9 e M8 specie, quest'ultima essendo il risultato di taglio di tutte le glucosio e un residuo mannosio (Figura 1 A). Nessun libero precursori mannosio o altri piccoli sono stati rilevati, che attesta la completezza della purificazione. A seguito di un inseguimento piuttosto lungo 8h c'era più ampio taglio di M7-6 e una piccola quantità di M5, ma la specie più importanti hanno continuato ad essere M9 e M8 (Figura 1 B). Se l'inseguimento è stato fatto in presenza di un inibitore del proteasoma (30 mM MG-132), c'era solo un minore accumulo di queste stesse specie rifilato (Figura 1 C). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Analisi quantitativa delle catene di zuccheri di un substrato ERAD glicoproteine ​​rispetto al totale. (A) In un esperimento simile a quello nella Figura 1, relativa quantità molare di ogni specie oligosaccaridi sono stati calcolati in base al contenuto mannosio. Abbiamo convertito i valori di cpm ottenuti per ogni specie glicani, la percentuale di ciascuna specie rispetto alla somma totale degli importi relativi molare di tutte le specie presenti è stata poi rappresentata in funzione del tempo la caccia per una media di due esperimenti. (B) simili a (A), tranne che glicani rilasciati dal substrato ERAD ASGPR H2a sono stati analizzati dopo l'etichettatura di impulsi e la caccia per un massimo di 4 ore, in presenza o assenza di inibitori del proteasoma MG-132. (C) Valori per 4h caccia in presenza di MG-132 da (A) e (B) vengono confrontati per ASGPR H2a e la piscina glicoproteina. (D) Schema di N-linked catena zucchero taglio processi al pronto soccorso. Processi di zucchero taglio che portano alla M6-5 legati alle proteine ​​(R) che sono indirizzate a ERAD rispetto a M9-8 su quelle che escono al Golgi e oltre. I risultati indicano che il processo ERAD è associato con il mannosio taglio di N-glicani cedere specie con 5-6 residui di mannosio rimanenti.

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

L&#39;impulso-chase analisi dei glicani in cellule vive con la separazione HPLC fornisce un metodo per studiare la dinamica di oligosaccaridi alterazioni strutturali per tutta la vita di una glicoproteina. È sempre più evidente che tali alterazioni sono coinvolte nella produzione dei segnali per la piegatura ER, controllo qualità e il traffico di 2-5 sistemi. Il metodo può essere applicato non solo per una glicoproteina di interesse specifico, ma anche per analizzare le dinamiche della struttura di glicoprote...

<table><tbody><tr><td>Controller del sistema di erogazione multisolvente 600E</td><td>Waters</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile LiChrosolv (grado cromatografico per cromatografia liquida in gradiente)</td><td>Merck &amp;& Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0,5 ml 30K o Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 o 4208</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore 5301, compreso di rotore fisso angolare da 48 x 1,5 / 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>F dializzato&amp;#8211;tal Calf Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium - privo di glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>sale di sodio e di etilendiamminotetracetico (Titriplex III)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf Kit (1.000.000 unità/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;siero fetale di vitello (FCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Frac-100 raccoglitore frazioni</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di conteggio con scintillazione liquida LS 6500</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>Mannosio, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (Attività specifica: 15-30 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-carbobenzossi-leucil-leucil-leucinale (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-glicosidasi F (1000 unità/ml)</td><td>Gruppo Roche</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-octylglucoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>Cellule NIH 3T3</td><td>Collezione americana di colture cellulari</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido fosforico (49-51%, per HPLC)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Beads di proteina A-Sepharose</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-terminale carbossilico di H2 da coniglio &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deossicolato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecilsolfato</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Spherisorb NH2, 5 &amp;mu;m, 4,6 x 250 mm</td><td>Waters</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Processori ad ultrasuoni Vibra-Cell VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Buffer A:&lt;/strong&gt; 1% Triton X-100, 0,5% p/v deossicolato di sodio, cocktail inibitore delle proteasi 2% v/v in PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Buffer B:&lt;/strong&gt; 0,5% p/v SDS, cocktail inibitore delle proteasi 2% v/v in PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Buffer C:&lt;/strong&gt; Buffer per reazione di N-glicosidasi F: 200 mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8,0, 4 mM EDTA, 1,5% N-octilglucoside</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 che esprimono stabilmente H2a &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Buffer D:&lt;/strong&gt; 0,5% Triton X-100, 0,25% p/v deossicolato di sodio, 0,5% p/v SDS, cocktail inibitore delle proteasi 2% v/v in PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Buffer E:&lt;/strong&gt; 0,5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt&amp;#8211;etanolo, cocktail di inibitori della proteasi 2% v/v in PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

pulse-chase analisi di n-linked catene di zuccheri da glicoproteine ​​in cellule di mammifero

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Fissaggio del Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Uomo<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</subPrecursore&gt; oligosaccaride di polipeptidi nascenti al Pronto Soccorso è una modifica comune per le proteine ​​secretorie. Anche se questa modifica è stato coinvolto in diversi processi biologici, ulteriori aspetti della sua funzione stanno emergendo, con recenti evidenze del suo ruolo nella produzione di segnali per il controllo della glicoproteina della qualità e del traffico. Così, fenomeni collegati alla N-glicani legati e la loro elaborazione si stanno intensamente investigato. Metodi che sono stati recentemente sviluppati per l&#39;analisi proteomica hanno notevolmente migliorato la caratterizzazione di glicoproteina N-linked glicani. Tuttavia, essi non forniscono informazioni sulla dinamica del trattamento catena zucchero coinvolti. Per questo, l&#39;etichettatura e la pulse-chase protocolli di analisi che vengono utilizzati di solito sono complesse e danno rese molto basse. Descriviamo qui un metodo semplice per l&#39;isolamento e l&#39;analisi di metabolicamente etichettati oligosaccaridi N-linked. Il protocollo si basa sulla etichettatura delle cellule con [2 -<sup&gt; 3</sup&gt; H] mannosio, lisi enzimatica denaturazione e il rilascio del oligosaccaridi sia da una proteina specifica immunoprecipitato di interesse o dalla piscina glicoproteina generale di trattamenti sequenziali con endo H e N-glicosidasi F, seguita da filtrazione molecolare (Amicon). In questo metodo il oligosaccaridi isolati servire da input per l&#39;analisi HPLC, che consente la discriminazione tra le varie strutture glicani in base al numero di unità di monosaccaride che ne fanno parte, con una risoluzione di un monosaccaride singolo. Usando questo metodo siamo stati in grado di studiare alto mannosio profili oligosaccaridi N-linked di glicoproteine ​​cellulare totale dopo pulse-chase in condizioni normali e sotto l&#39;inibizione del proteasoma. Questi profili sono stati confrontati con quelli ottenuti da un immunoprecipitati ER-associata degradazione (ERAD) substrato. I nostri risultati suggeriscono che la maggior parte NIH 3T3 glicoproteine ​​cellulari sono relativamente stabili e che la maggior parte di loro oligosaccaridi sono tagliata per l&#39;uomo<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. Al contrario, i substrati ERAD instabili sono tagliata per l&#39;uomo<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; E glicoproteine ​​cuscinetto queste specie si accumulano su di inibizione della degradazione del proteasoma.

Descriviamo un metodo per l&#39;analisi dell&#39;alterazione di N-glicani legati attraverso la vita inizi di glicoproteine ​​dopo la loro biosintesi in cellule di mammifero. Ciò si ottiene pulse-chase analisi di metabolicamente glicani etichettati, rilascio enzimatico da glicoproteine ​​e l&#39;esame mediante HPLC.

Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine ​​in cellule di mammifero

L'attacco dell'oligosaccaride precursore Glc3Man9GlcNAc2 alle polipeptidi nascenti nel reticolo endoplasmatico (ER) è una modifica comune per le proteine secretorie. Sebbene ...

L'analisi delle catene di zuccheri non legate sui glicoproteine inizia con la marcatura dei glicani e delle cellule con manosio triziato. La piastra di marcatura viene raffreddata sul ghiaccio mentre la piastra di chasing è incubata senza marcatura per un periodo desiderato. Successivamente, i campioni vengono lisiati e un glicoproteina di interesse viene immunopurificata, denaturata e i suoi glicani vengono rilasciati enzimaticamente.Gli oligosaccaridi vengono ulteriormente purificati mediante filtrazione molecolare, che li separa dalle proteine e da altri contaminanti di dimensioni superiori a 30 chilodalton. I glicani vengono quindi separati mediante HPLC. La quantità di ciascuna forma di glicano viene determinata misurando l'intensità del segnale radioattivo in ciascuna frazione eluita.Ciao, sono Edward Azo del laboratorio di Hi Geraldo Letter Kremer del Dipartimento di Ricerca Cellulare e Immunologia dell'Università di Tel Aviv. Faccio anche parte del laboratorio di Gerardo Letter Kremer. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento e l'analisi di oligosaccaridi marcati metabolicamente e legati.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la dinamica

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Determinare la posizione del ciclo cellulare di una popolazione di cellule, o la comprensione di come i segnali influenzano la proliferazione, può essere facilmente misurato mediante citometria di flusso utilizzando questo protocollo. Riportiamo un semplice approccio sperimentale alla colorazione delle cellule e quantificare la loro posizione nel ciclo cellulare.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

Proteine ​​di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine ​​per facili analisi proteomica basati LC-MS.

Glicopeptide Capture per Proteomica cellulari di superficie

Al fine di esplorare in modo completo la diversità dei glicani legati all'O, una nuova procedura per l'eliminazione riduttiva della β in gel, combinata con la permetilazione e un metodo di partizione di fase rapida, viene applicata all'analisi dei glicani legati all'O rilasciati direttamente dalle glicoproteine risolte mediante SDS-PAGE e suscettibili di successiva analisi glicomica mediante spettrometria di massa.

Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa

È stato sviluppato un protocollo ad alto rendimento per la purificazione combinata di proteomica e glicomica e la quantificazione LC-MS/MS nel plasma. L'analisi della deamidazione dei motivi di glicosilazione legati all'N era specifica per i siti deglicosilati. La quantificazione accurata degli N-glicani è stata ottenuta accoppiando la separazione degli N-glicani assistita dal filtro alla normalizzazione dell'individualità durante la marcatura con la strategia dei tag glicano idrazide.

Un quantitativo Glycomics e proteomica combinata strategia Purificazione

Questo articolo presenta una forma migliorata di una nuova tecnica di glicomica bottom-up progettata per analizzare il profilo composizionale aggregato dei glicani in biofluidi non frazionati attraverso la scomposizione chimica dei glicani nei loro monosaccaridi specifici per il linkage costituente per il rilevamento mediante GC-MS. Le potenziali applicazioni includono la diagnosi precoce del cancro e di altri disturbi affettivi dei glicani.

Glycan Nodo Analisi: un approccio bottom-up per Glycomics

Descriviamo un metodo modificato per l'isolamento frazione di membrana da cellule umane e preparazione del campione per la rilevazione di -glycosylation SCAP N e proteine totali mediante western blot. Introduciamo inoltre un metodo GFP-etichettatura per monitorare il traffico di SCAP usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in laboratori di biologia regolare.

Analisi di SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation E il traffico nelle cellule umane

Qui descriviamo un protocollo per un metodo generale di pulse-chase che permette l'analisi cinetica di pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine da seguire in cellule vive.

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

ImmunoglobulinG (IgG) N-glican è caratterizzato utilizzando l'interazione idrofila cromatografica UPLC. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata. Presentato qui è un'introduzione a questo metodo sperimentale in modo che possa essere ampiamente utilizzato nelle impostazioni di ricerca.

Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography

Le modifiche post-traduzionali (PTM) modificano le strutture e le funzioni delle proteine. I metodi per l'arricchimento simultaneo di più tipi di PTM possono massimizzare la copertura nelle analisi. Presentiamo un protocollo che utilizza cromatografia di affinità metallica immobilizzata Ti(IV) a doppia funzionalità seguita da spettrometria di massa per l'arricchimento e l'analisi simultanei della proteina N-glicosilazione e fosforilazione nei tessuti pancreatici.

Una strategia di arricchimento spin-tip per l'analisi simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi da tessuti pancreatici umani

Qui, proponiamo un semplice protocollo che combina l'ingegneria degli oligosaccaridi metabolici, la chimica dei clic e la microscopia ad espansione che consente il bioimaging di N-glicoproteine sialilate intracellulari con una migliore risoluzione utilizzando apparecchiature di microscopia di routine.

Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

Scopri l'analisi pulse-chase delle catene glicidiche N-linked in glicoproteine di cellule di mammifero. Questo metodo consente di tracciare le modifiche metaboliche delle glicani nel tempo mediante marcatura radioattiva e HPLC.

Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine ​​in cellule di mammifero

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