Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome
15 giugno 2010
Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di tradurre ribosomi delle cellule eucariotiche. Una volta estratto, i ribosomi sono separati in monosomes e poliribosomi per frazionamento gradiente di saccarosio per consentire diverse popolazioni ribosomiale da analizzare. Come tale, questo metodo è il gold standard per l'esame della regolamentazione della traduzione.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di separare e confrontare le frazioni mono zona e poliribosoma dai lisati cellulari. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule di interesse. Il secondo passo della procedura consiste nel preparare il lisato cellulare.
Il terzo passo della procedura consiste nella centrifugare il lisato attraverso un gradiente di saccarosio. La fase finale della procedura consiste nel frazionare il gradiente e visualizzare le diverse popolazioni ribosomiali attraverso una traccia UV. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti nella traduzione in diverse condizioni sperimentali attraverso l'analisi del profilo del poliribosoma.
Ciao, sono Anthony Esposito del laboratorio del Dr.Terry Goss Kinsey nel dipartimento di genetica molecolare, microbiologia e immunologia presso l'UMD e la J Robert Wood Johnson Medical School. E io sono Marcus Lewis. Sempre da McKinsey Lab qui a R-W-J-M-S.
Oggi vi mostreremo una procedura per l'analisi dei poliribosomi. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le alterazioni e la sintesi proteica che derivano da mutazioni o fattori ambientali. Quindi iniziamo. Saccarosio.
I gradienti devono essere preparati un giorno prima dell'uso per consentire ai gradienti di diventare continui. Mescolare i volumi appropriati di soluzioni madre di saccarosio al 7% e al 47% per ottenere 48 millilitri di ciascuna delle seguenti concentrazioni di saccarosio, 7%17%27%37% e 47%Aggiungere un DTT molare a ciascuna soluzione di saccarosio fino a una concentrazione finale di un millimolare. Per versare le sfumature, collegare una pipetta per pasta a una siringa da 20 millilitri fissandola e sigillandola con pellicola para.
Aggiungi sette millilitri di saccarosio al 7% sul fondo di una provetta da centrifuga ultra aamer da un pollice per 3,5 pollici. Quindi, aggiungi sette millilitri di soluzione di saccarosio al 17% sotto la soluzione al 7% posizionando lentamente la punta della pipetta per pasta vicino al fondo della pipetta. Dovrebbero volerci non meno di 20 secondi per versare ogni strato.
Ripetere con sette millilitri ciascuna delle soluzioni di saccarosio al 27%37% e al 47% quando il gradiente è stato forato. Dovresti osservare linee chiare tra gli strati che indicano che si è verificata una miscelazione minima. Conservare tutte le pendenze di quattro gradi Celsius durante la notte, insieme ai rotori, alle bottiglie e ai tubi che verranno utilizzati per raccogliere i campioni.
Per preparare estratti da cellule di lievito, inizia coltivando centinaia di 25 millilitri di coltura di lievito fino a un OD 600 di 0,8 a uno. Aggiungere il cicloheide alla coltura fino a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e continuare ad agitare a 30 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, versare la coltura in una bottiglia da centrifuga da 250 millilitri e riempire di ghiaccio.
Da questo punto in poi, tenete tutto in ghiaccio con la centrifuga a 8.000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risalire, sospendere il pellet in 10 millilitri di ghiaccio, lisi a freddo, tamponare e trasferire in tubi di polipropilene da 15 millilitri. Centrifugare a 5.900 volte la gravità per tre minuti di quattro gradi Celsius Resus.
Sospendere il pellet in 0,5 millilitri di tampone di lisi. Trasferire la sospensione in un tubo micro fuge da 1,5 millilitri e quindi aggiungere 0,5 millilitri di perle di vetro refrigerate cotte e lavate con acido. Agitare le celle per quattro intervalli di 32°, chiamando il tubo sul ghiaccio per 30 secondi tra ogni intervallo.
Quindi aggiungere altri 0,5 millilitri di tampone di lisi nella centrifuga per provette da 1,5 millilitri a 5.000 volte. Gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare alla massima velocità per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Infine, trasferire il supinato in una nuova provetta micro centri da 1,5 millilitri. L'estratto può essere conservato a meno 80 gradi Celsius per trasferire il lisato al gradiente di saccarosio. Posizionare la punta della pipetta contro la parete della provetta vicino alla superficie del gradiente e sovrapporre delicatamente il lisato sopra il gradiente.
Per un gradiente di 35 millilitri, in genere vengono caricati 500 microlitri di lisato. Utilizzando una pinza, abbassare con cautela la pendenza nella benna di un rotore a benna oscillante. Centrifugare i gradienti a 100.000 volte la gravità per quattro ore a quattro gradi Celsius.
Circa 30 minuti prima del completamento del giro di quattro ore. Collegare l'ago al perforatore di tubi e collegare la penna al monitor di fluorescenza ad assorbanza online. Accendere il monitor dell'assorbanza per consentire il raggiungimento di una linea di base stabile prima dell'analisi dei campioni.
L'acquisizione elettronica del profilo PolyZone può essere facilmente ottenuta in tempo reale collegando un'unità di acquisizione dati DI 1 48 U. Al registratore grafico, riempire la pompa a siringa con 50 millilitri di dadi fiorini utilizzando l'impostazione rapida a flusso inverso. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria.
Collegare il tubo dalla siringa al perforatore di tubi. E accendere brevemente il flusso di Flo inerte a sei millilitri al minuto in avanti. Per liberare il tubo da eventuali bolle d'aria, posizionare una serie di tubi sotto il tubo all'estremità della cella di flusso per raccogliere il deflusso del campione.
Preparare un secchiello per il ghiaccio con una fontana preformata per contenere la provetta da centrifuga contenente il gradiente di saccarosio. Al termine della centrifugazione di quattro ore, rimuovere con cautela le provette da centrifuga dal rotore della centrifuga e metterle sul ghiaccio. Facendo attenzione a non disturbare le pendenze.
Per analizzare gli estratti cellulari, posizionare il tubo a gradiente sul perforatore di tubi e collegare la parte superiore del tubo all'uscita e fissarlo. Sollevare lo stadio inferiore fino alla provetta da centrifuga in modo che l'ago fori il fondo della provetta. Iniziare il flusso di allerta Fiorin in avanti a sei millilitri al minuto.
Una volta che il flut ha iniziato a fluire nel tubo, monitorare il movimento dell'ago sul monitor di assorbanza UV online. Una volta che l'ago inizia a muoversi, attivare il movimento del grafico su un'impostazione di velocità di 60. Quando è stata raggiunta la fine del profilo del poliribosoma, chiudere il flusso di Flo inerte alla provetta da centrifuga e arrestare il movimento del grafico sul monitor di fluorescenza ad assorbanza.
Ritrarre l'inerte Flo dalla provetta da centrifuga nella siringa iniziando il flusso nella direzione inversa a una velocità elevata, facendo attenzione a non aspirare il saccarosio dalla provetta nella siringa. Svitare la provetta da centrifuga dal perforatore, abbassare l'ago e rimuovere la provetta. Qui viene mostrata una traccia rappresentativa di un estratto di ribosoma preparato dal lievito in presenza di cicloheide.
Sono indicati picchi di assorbanza UV contenenti poliribosomi e ribosomi A TS 60 s e 40 s. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire l'analisi del poliribosoma quando esegui questa procedura. È importante ricordarsi di lavorare rapidamente, mantenendo i campioni freddi e privi di RNA.
Quindi questo è tutto. Grazie per l'attenzione e buona fortuna per i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di ribosomi in fase di traduzione da cellule eucariotiche, che permette l'analisi di diverse popolazioni ribosomiali. Il metodo prevede la separazione dei ribosomi in monosomi e poliribosomi mediante frazionamento su gradiente di saccarosio, essenziale per lo studio della regolazione della traduzione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genetica
Sfondo
- Comprendere la funzione dei ribosomi è fondamentale per lo studio della sintesi proteica.
- Il profilo dei poliribosomi fornisce informazioni sulla regolazione della traduzione.
- Le tecniche di estrazione dei ribosomi rappresentano un fondamento della ricerca in biologia molecolare.
- Fattori ambientali e mutazioni possono alterare la sintesi proteica.
Scopo dello studio
- Separare e confrontare le frazioni di monoribosomi e politribosomi da lisati cellulari.
- Visualizzare diverse popolazioni ribosomiali mediante tracciamento con raggi UV.
- Analizzare le variazioni nella traduzione in diverse condizioni sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Coltivazione di cellule eucariotiche e preparazione di lisati cellulari.
- Centrifugazione attraverso un gradiente di saccarosio.
- Frazionamento del gradiente per isolare popolazioni di ribosomi.
- Visualizzazione dei profili ribosomiali mediante monitoraggio dell'assorbanza UV.
Risultati principali
- Separazione riuscita di monosomi e politribosomi.
- Visualizzazione chiara delle popolazioni ribosomiali mediante tracciamento UV.
- Analisi della regolazione della traduzione in diverse condizioni.
- Informazioni sull'impatto delle mutazioni sulla sintesi proteica.
Conclusioni
- Il protocollo è uno standard di riferimento per lo studio della regolazione della traduzione.
- Consente ai ricercatori di analizzare efficacemente la dinamica dei ribosomi.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi molecolari della traduzione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi del profilo di poliribosomi consente ai team del settore biofarmaceutico di indagare i meccanismi di controllo della traduzione e di rilevare difetti nella sintesi proteica in punti critici della scoperta. Questo metodo fornisce informazioni quantitative sulla traduzione globale e specifica per trascritto, sostenendo una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi e nella riduzione dei rischi meccanicistici. La sua adattabilità a diversi sistemi eucariotici garantisce un'ampia rilevanza per portafogli di ricerca e sviluppo preclinica e di ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente una valutazione diretta della regolazione traduzionale in condizioni di perturbazioni genetiche o ambientali.
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica distinguendo i difetti nell'inizio da quelli nella elongazione/terminazione.
- Facilita la validazione funzionale del bersaglio quantificando i cambiamenti nei rapporti tra poliribosomi e monosomi.
- Fornisce una piattaforma per valutare l'impatto di interventi sperimentali sulla sintesi proteica.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture quantitative validate dell'impegno ribosomiale per la standardizzazione dei saggi.
- Permette una frazionamento riproducibile e il rilevamento basato su UV delle popolazioni ribosomiali.
- Prepara estratti biologici adatti per analisi a valle di mRNA o proteine.
- Supporta lo screening di composti che modulano il macchinario traduttivo o le vie regolatorie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la scoperta di biomarcatori traduzionali a intuizioni meccanicistiche sulla regolazione della sintesi proteica.
- Garantisce continuità dai modelli cellulari ai sistemi preclinici adattando protocolli attraverso specie eucariotiche.
- Informa decisioni di avanzamento proporzionate al rischio rivelando difetti traduzionali associati a modelli di malattia.
- Fornisce un contesto meccanicistico per i fenotipi osservati negli studi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il profiling dei poliribosomi si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica permettendo un'analisi guidata da ipotesi della traduzione, sostenendo sia la validazione del bersaglio che l'identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Quantifica l'output traduttivo e chiarisce i meccanismi regolatori specifici per pathway.
- Screening: Offre una frazionamento robusto e quantitativo e output di assorbanza UV pronti per saggi.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative in tempo reale delle popolazioni ribosomiali per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega modelli cellulari e preclinici consentendo l'adattamento dei protocolli e l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per diversi studi traslazionali e meccanicistici in vari programmi di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sul controllo traduttivo.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro di estrazione, frazionamento e rilevamento per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione rivelando colli di bottiglia traduttivi e supportando una selezione efficiente del portafoglio in termini di investimenti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli e dei modelli in base alla fedeltà traduttiva, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in biologia dei ribosomi e tecniche di frazionamento su gradiente.
- Richiede l'accesso a strumentazione per ultracentrifugazione e misurazione dell'assorbanza UV.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i gruppi di lavoro per ottenere risultati riproducibili.
- Adattabile a sistemi di lievito e mammiferi con modifiche al protocollo secondo necessità.
- L'integrità del campione e condizioni prive di RNasi sono fondamentali per risultati affidabili.
