Isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule staminali adulte dai tessuti molli muscoloscheletrici come il muscolo scheletrico. Ciò si ottiene prelevando prima una biopsia dei tessuti molli, debriding e tagliandola finemente. Il secondo passo della procedura consiste nel digerire enzimaticamente il tessuto.

La terza fase della procedura consiste nell'isolare le cellule staminali attraverso ripetute fasi di pre-placcatura. La fase finale della procedura è l'identificazione delle cellule staminali isolate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i comportamenti morfologici e cellulari delle cellule utilizzando l'immunofluorescenza, la microscopia e/o la citometria a flusso.

Ciao, sono y Lee del Laboratorio di Patologia Molecolare del Dipartimento di Chirurgia Ortopedica dell'Università di Pittsburgh. Oggi ti mostrerò come isolare una cellula staminale adulta dai tessuti molli del sistema scheletrico Mus come il muscolo scheletrico. Ciao, sono il dottor Johnny Ward.

Sono professore presso la University of Pittsburgh School of Medicine all'interno del Dipartimento di Chirurgia Ortopedica. Ho lavorato a stretto contatto con il Dr. Young Lee e queste procedure per isolare, sai, diversi tipi di cellule staminali dal muscolo scheletrico e alterare i tessuti come standard. Utilizziamo le procedure nel nostro laboratorio per isolare le cellule staminali per studi di ricerca sulle applicazioni della medicina traslazionale.

Quindi studiamo. I tessuti da cui possono essere isolate le cellule staminali includono i tendini e i muscoli scheletrici raccolti dalla tibia o dai muscoli soleo dell'arto posteriore di topi di tipo selvatico. Dopo aver rimosso i resti di pelle e ossa, mettere i fazzoletti in un piatto contenente HBSS freddo integrato con il 5% di FBS.

Quindi, posizionare il tessuto separatamente su piatti rivestiti di collagene contenenti HBSS freddo. Utilizzeremo i tessuti muscolari scheletrici per dimostrare le procedure di base per la dissociazione e la digestione dei tessuti. Utilizzare micro forbici e/o lame di bisturi per tritare i tessuti scheletrici in una digestione enzimatica grossolana dei tessuti a pH liquame.

Iniziare trasferendo i fanghi di tessuto MIT in provette separate da 15 millilitri in centrifuga a circa 3.500 giri/min a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il lavaggio SANE by Resus sospendendo un HBSS e ripetere la centrifugazione. Dopo aver rimosso il supernat, digerire i fanghi aggiungendo 10 millilitri di preriscaldare.0,2% di collagenasi.

Incubare il tipo 11 per 60 minuti a 37 gradi Celsius, agitando le provette a mano ogni 10 minuti al termine dell'incubazione di 60 minuti. Centrifugare e quindi risospendere i fanghi in 10 millilitri di soluzione spaziale DYS. Incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius, agitando a mano ogni 10 minuti dopo i 45 minuti di centrifuga di incubazione e sospendere nuovamente i fanghi in 10 millilitri di 0,2% trips in soluzione HBSS.

Di solito incubiamo per 15-20 minuti a 37 gradi Celsius mentre capovolgiamo le provette ogni 10 minuti, l'incubazione è completa. Quando un numero sufficiente di singole cellule viene rilasciato dai tessuti, come illustrato qui, centrifugare le cellule risultanti e sospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di proliferazione. Il PM medio dissocia la sospensione cellulare facendo passare l'estratto attraverso una serie di aghi due volte attraverso un ago calibro 18, poi una volta attraverso un ago calibro 23 e infine una volta attraverso un ago calibro 27.

Infine, passare l'estratto cellulare attraverso un colino cellulare da 70 micron per iniziare la tecnica di prepl. Centrifugare l'estratto cellulare appena preparato e risospendere i pellet in proliferazione. Piastra media cinque millilitri della miscela cellulare su un pallone T 25 rivestito di collagene e commercializzato come PP uno incubato a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per due ore.

Dopo due ore. Trasferire le cellule di non aderenza in un nuovo pallone T 25 rivestito di collagene e commercializzare come PP due. Aggiungere cinque millilitri di PM al precedente pallone T 25 etichettato PP.

Rimettere entrambe le fiasche nell'incubatrice per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire le cellule non aderenti dal PP 2 a un nuovo pallone T 25 rivestito con ENC di collagene e contrassegnarlo come PP tre. Aggiungere cinque millilitri di terreno di proliferazione nel pallone etichettato PP due.

Rimetti le borracce nell'incubatrice. Ripetere la procedura ogni 24 ore fino alla popolazione PP sei. Viene creata la popolazione di cellule staminali.

Le sei cellule PP isolate sono molto poche e devono essere mantenute in un terreno di proliferazione ricco di FBS. Questo è cambiato ogni giorno. Sebbene la maggior parte delle cellule nella coltura PP 6 morirà durante le successive una o due settimane di coltura.

Una grande popolazione sana PP 6 viene solitamente creata dopo un'ulteriore una o due settimane di espansione. Mantenere anche tutti gli altri gruppi di cellule sospese, permettendo loro di proliferare ed esaminandole regolarmente con un microscopio invertito. Le prime cellule aderenti che si attaccano ai flaconi di PP uno e PP due sono per lo più cellule fibrotiche.

Cellule che aderiscono ai palloni rivestiti di collagene dopo un periodo di tempo più lungo entro 48-96 ore. PP tre e PP quattro sono per lo più mioblasti. Mentre le cellule satelliti muscolari sono spesso osservate principalmente in PP 5, le cellule prepl successive 96 ore o PP 6 successive sono considerate cellule staminali adulte e appaiono piccole, rotonde e traslucide.

All'inizio del loro isolamento, possono essere ulteriormente caratterizzati mediante immunoistochimica per la loro espressione di marcatori di cellule staminali come la cellula staminale, l'antigene e il CDC 34. Ti abbiamo appena mostrato come isolare le cellule staminali da una seconda massa del topo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere gli steroidi durante tutte le procedure.

Una volta che la cellula staminale è stata isolata, assicurati di coltivare quelle cellule a bassa densità per mantenere le caratteristiche delle cellule staminali delle cellule. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con la tua esperienza E ti auguro buona fortuna per provare a usarlo nel tuo esperimento.

Grazie.