Isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali adulte da tessuti molli muscoloscheletrici, come il muscolo scheletrico. Questo viene ottenuto prelevando innanzitutto una biopsia del tessuto molle, rimuovendo le parti necrotiche e tritandolo finemente. Il secondo passaggio della procedura consiste nel digerire enzimaticamente il tessuto.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'isolare le cellule staminali mediante ripetuti passaggi di pre-piastratura. L'ultimo passaggio della procedura è l'identificazione delle cellule staminali isolate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il comportamento morfologico e cellulare delle cellule mediante immunofluorescenza, microscopia e/o citometria a flusso.

Ciao, sono y Lee del Laboratorio di Patologia Molecolare del Dipartimento di Chirurgia Ortopedica dell'Università di Pittsburgh. Oggi vi mostrerò come isolare una cellula staminale adulta dai tessuti molli del sistema muscolare di Mus, come il muscolo scheletrico. Ciao, sono il Dottor Johnny Ward.

Sono un professore presso la School of Medicine dell'Università di Pittsburgh, nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica. Ho lavorato, come sa, a stretto contatto con il dottor Young Lee a queste procedure per isolare, sa, diversi tipi di cellule staminali dal muscolo scheletrico e da tessuti connettivali come il tessuto adiposo. Utilizziamo queste procedure nel nostro laboratorio per isolare cellule staminali principalmente per studi di ricerca sulle applicazioni in medicina traslazionale.

Quindi cominciamo lo studio. I tessuti dai quali è possibile isolare cellule staminali includono tendini e muscoli scheletrici prelevati dai muscoli tibiali o soleo dell'arto posteriore di topi di tipo selvaggio. Dopo aver rimosso i residui di pelle e osso, posizionare i tessuti in una piastra contenente HBSS freddo integrato con FBS al 5%.

Successivamente, posizionare il tessuto separatamente in piatti rivestiti di collagene contenenti HBSS freddo. Utilizzeremo tessuti muscolari scheletrici per dimostrare le procedure di base per la dissociazione e la digestione dei tessuti. Usare forbici microchirurgiche e/o lame di bisturi per tritare i tessuti scheletrici in una poltiglia grossolana prima della digestione enzimatica dei tessuti.

Trasferire innanzitutto le sospensioni di tessuto MIT in provette da 15 millilitri separate e centrifugare a circa 3.500 giri al minuto a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il lavaggio SANE risospendendo in HBSS e ripetere la centrifugazione. Dopo aver rimosso il soprannatante, digerire le sospensioni aggiungendo 10 millilitri di collagenasi 0,2% preriscaldata.

Incubare il tipo 11 per 60 minuti a 37 gradi Celsius, agitando i tubi a mano ogni 10 minuti. Al termine dell'incubazione di 60 minuti, centrifugare quindi risospendere i sospensati in 10 millilitri di soluzione DYS. Incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius, agitando a mano ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione di 45 minuti, centrifugare e quindi risospendere i sospensati in 10 millilitri di trips 0,2% in soluzione HBSS.

Di solito si incuba per 15-20 minuti a 37 gradi Celsius, capovolgendo i tubi ogni 10 minuti, fino al completamento dell'incubazione. Quando un numero sufficiente di cellule singole è stato rilasciato dai tessuti, come illustrato qui, centrifugare le cellule ottenute e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo di proliferazione PM. Dissociare la sospensione cellulare facendo passare l'estratto attraverso una serie di aghi: due volte attraverso un ago da 18 gauge, una volta attraverso un ago da 23 gauge e infine una volta attraverso un ago da 27 gauge.

Infine, far passare l'estratto cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron per iniziare la tecnica prepl. Centrifugare l'estratto cellulare appena preparato e risospendere i pellet in mezzo di proliferazione. Piastrare cinque millilitri della miscela cellulare in una fiasca T25 rivestita di collagene e identificare come PP1, incubando a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per due ore.

Dopo due ore, trasferire le cellule non aderenti in un nuovo fiasco T 25 rivestito di collagene e identificarlo come PP due. Aggiungere cinque millilitri di PM nel precedente fiasco T 25 etichettato PP uno.

Rimettere entrambi i flaconi nell'incubatore per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire le cellule non aderenti da PP due a un nuovo flacone T 25 rivestito con collagene ENC e contrassegnarlo come PP tre. Aggiungere cinque millilitri di mezzo di proliferazione nel flacone etichettato PP due.

Rimettere le fiasche nell'incubatore. Ripetere la procedura ogni 24 ore fino alla popolazione PP sei. La popolazione di cellule staminali è stata creata.

Le cellule PP6 isolate sono molto poche e devono essere mantenute in un mezzo di proliferazione ricco di FBS, che va cambiato quotidianamente. Tuttavia, la maggior parte delle cellule nella coltura PP6 morirà durante la successiva una-due settimane di coltivazione.

Una popolazione sana e ampia di PP sei viene solitamente ottenuta dopo un'ulteriore espansione di una o due settimane. Mantenere anche tutti gli altri gruppi di cellule in sospensione, permettendo loro di proliferare ed esaminandoli regolarmente mediante microscopio invertito. Le cellule adesive precoci che si attaccano alle fiale PP uno e PP due sono per lo più cellule fibrotiche.

Cellule che aderiscono a fiasche rivestite con collagene dopo un periodo di tempo più lungo, compreso tra 48 e 96 ore. PP tre e PP quattro sono per lo più mioblasti. Mentre le cellule satelliti muscolari si osservano spesso prevalentemente in PP cinque, le cellule prepl successive, a 96 ore o oltre (PP sei), sono considerate cellule staminali adulte e appaiono piccole, rotonde e traslucide.

All'inizio del loro isolamento, possono essere ulteriormente caratterizzati mediante immunohistochemia per l'espressione di marcatori delle cellule staminali come cellula staminale, antigene uno e CDC 34. Vi abbiamo appena mostrato come isolare cellule staminali da una seconda massa del topo. Durante questa procedura, è importante ricordare di mantenere lo steroid durante tutti i passaggi.

Dopo aver isolato la cellula staminale, assicurarsi di coltivare tali cellule a bassa densità per mantenere le caratteristiche delle cellule staminali. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento e vi auguro buona fortuna nell'utilizzare questo metodo nel vostro esperimento.

Grazie.