Name: Isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Scopri come isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici utilizzando biopsia, digestione enzimatica e pre-plating ripetuto. Questo metodo supporta la ricerca in medicina rigenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori sono molto riconoscente di Ms. Haiying Pan e Mr. Ian Bellayr per il loro aiuto tecnico su isolamento delle cellule per i film attuali e Mr. Kyle Holden e Jonathan Lucas per il loro aiuto sulla modifica di diapositive. Molte grazie per il seguente elenco di persone che sono stati coinvolti con lo sviluppo delle tecniche preplate modificato nel corso degli ultimi anni: Drs. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, KIMIMASA Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Siamo grati per l&#39;assistenza tecnica da James H. Cummins, Ryan Pruchnic, Giuseppe Feduska, Rebecca C. Schugar, Haiying Pan e Tebbets Jessica. L&#39;autore inoltre desidera ringraziare il sostegno finanziario per questo lavoro dalla Muscular Dystrophy Association (MDA), il National Institutes of Health (NIH), il Dipartimento della Difesa (DOD), Ospedale dei Bambini di Pittsburgh di UPMC, il Dipartimento di Chirurgia ortopedica, e l&#39;Università di Pittsburgh.

In generale, la procedura completa preplate modificata richiede 1-2 giorni di preparazione, 1 settimana di eseguire la procedura tecnica, 2-3 giorni di identificazione delle cellule con immunocitochimica, e un ulteriore 2-3 settimane di espansione popolazione di cellule staminali. Le attrezzature necessarie per la cultura di cellule staminali sono simili a quello di altri sistemi di coltura cellulare che include un banco centrifuga, incubatore CO 2, il flusso laminare cappuccio tessuto cultura e di un microscopio invertito dotato di fluorescenza e una fotocamera digitale. Le cellule staminali isolate anche può essere clonato e possono essere conservati a lungo termine in azoto liquido per i 1,2 attuali o futuri studi. Tutti i reagenti e materiali per la procedura deve essere sterile e trattati in modo asettico. Fase 1: Preparazione <ol><li> Collagene cappotto piatti colture di tessuti e fiaschi: collagene di tipo I derivato da pelle di vitello (0,1 g per 1 litro; Sigma-Aldrich). Il Plasticware per rivestire comprende: T-25 boccette, 6 o 12 piastre, piatti (60 e 100 mm, BD Falcon), come descritto prima di 1,2. Agitare delicatamente il Plasticware ogni mezz&#39;ora, per 4 ore per garantire anche rivestimento del collagene. La soluzione di collagene viene quindi rimosso. E la Plasticware rivestito viene poi lasciato asciugare nel cofano di coltura con la luce UV e il cofano sia, per garantire la sterilità e, infine, richiuso o coperto per un uso successivo. </li><li> Preparare terreno di coltura cellulare: 400mL DMEM (DMEM, glicemia alta, Invitrogen), 50mL di calore inattivato siero fetale bovino (FBS, Invitrogen), 50mL Horse Serum (HS, Invitrogen), e 5 ml di estratto di Chick embrioni (CEE; accurata Chemical Co. ) sarà vuoto filtrata con un usa e getta 0,22-micron da 500 ml sistema di filtro sterile (Corning). Sterile penicillina / streptomicina soluzione (Invitrogen) saranno aggiunti infine 100 Unità / ml. Le soluzioni preparate può essere conservato a 4 ° C per almeno un mese. Questa soluzione è usata per staccare le cellule dal pallone quando culture scissione o la preparazione delle cellule per il trapianto. </li><li> Warm up soluzioni per l&#39;isolamento delle cellule: I seguenti reagenti devono essere riscaldati a 37 ° C prima del loro utilizzo per l&#39;isolamento delle cellule: soluzione salina tampone di Hank (HBSS, Invitrogen), 0,2% (peso / volume) collagenasi di tipo XI (Sigma -Aldrich), con una media di 3.200 unità di collagene digestione per mL HBSS; dispasi 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (peso / volume) tripsina (Invitrogen). </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici in preparazione: procedura chirurgica richiede sterili strumenti chirurgici, tra cui: diverse dimensioni pinze, micro-forbici, forbici iris e / o lame di bisturi. Inoltre, 15 e 50 mL provette in polipropilene (BD Falcon); filtro cella (diametro dei pori 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - e 27-gauge aghi (BD PrecisionGlide), e 10 - o 20-ml siringhe sterili (BD). </li></ol> Fase 2: biopsie dei tessuti, l&#39;isolamento e dissociazione meccanica 1-4 Le biopsie dei tessuti vengono eseguite sotto una cappa sterile e cultura sono appena raccolte e tendini dei muscoli scheletrici sono ottenuti dai muscoli soleo della tibia o della arti posteriori di topi wild-type (femmina C57BL/6J, 4-5 settimane di età o più giovani, Jackson di laboratorio). Qualsiasi tessuto connettivo visibile, vasi sanguigni e tessuto adiposo vengono poi rimossi dai campioni bioptici. I tessuti dei tendini e muscoli vengono poi accuratamente identificata al microscopio da dissezione chirurgica per rimuovere residui di pelle e ossa e posti in un piatto contenente freddo (4 ° C) HBSS (integrata con aggiungere il 5% di FBS). I tessuti isolati sono poi separatamente posti su piatti di collagene rivestito contenente HBSS freddo e sarà tritata (&lt;1x1 mm 3) in un impasto grossolano con micro-forbici e / o lame di bisturi. Fase 3: la digestione enzimatica dei tessuti: Il tessuto viene poi macinato dissociato enzimaticamente attraverso una serie di passi 2,4,5 <ol><li> Trasferire il tessuto fanghi di macinazione in separata da 15 ml, tubi e centrifugare a ~ 3500 rpm a 4 ° C per 5 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante, lavare con HBSS e ripetere la centrifugazione di nuovo. </li><li> Rimuovere il surnatante, e digerire questi fanghi con l&#39;aggiunta di 10 ml di preriscaldata 0,2% collagenasi di tipo XI (Sigma). Incubare per 60 minuti a 37 ° C, mentre continuo a dondolo delicatamente i tubi. In alternativa, agitare a mano ogni 10 min. </li><li> Centrifuga e risospendere questi fanghi in 10 ml dispasi (2,4 Unità / mL, Gibco) soluzione. Incubare per 45 minuti a 37 ° C, agitando dolcemente con le mani o dondolo ogni 10 min. </li><li> Centrifuga e risospendere questi fanghi in 10 ml di soluzione 0,2% HBSS tripsina. L&#39;incubazione può variare in base alla misura in cui vengono rilasciate le singole cellule dai tessuti che possono essere eseguite osservando la sospensione al microscopio. Si sconsiglia di superare i 30 minuti a 37 ° C con invertendo i tubi o delicatamente a dondolo ogni 10 min. </li><li> Centrifugare la cellula con conseguentes e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di proliferazione Media (PM). </li><li> Dissociare la sospensione cellulare facendo passare l&#39;estratto attraverso una serie di aghi. Le cellule sono poi passati 2 volte attraverso un 18G, poi un 23G e, infine, un ago 27G. </li><li> Passare l&#39;estratto delle cellule attraverso un 70-micron filtro cellulare. </li></ol> Fase 4: Preplating isolare diverse popolazioni cellulari basato sul tasso di adesione delle cellule 1-3 <ol><li> Centrifuga e risospendere il pellet cellulare in media proliferazione. </li><li> Piastra di miscele la cellula su una collagene rivestito T-25 pallone (o 60 piatti mm) e contrassegnarlo come PP1. La sospensione cellulare dovrebbe essere osservato come in possesso di un gran numero di nuclei di rifrazione e altri detriti sotto il microscopio. </li><li> Incubare a 37 ° C in un umidificata, 5% CO 2 incubatore per 2 ore. </li><li> Trasferire le cellule non aderenti ad un nuovo collagene rivestito T-25 pallone (o parabola di 60 mm) e marchio è come PP2. Aggiungere 5 ml di PM nella piastra etichettato PP1. Le cellule primi aderenti che attribuiscono al pallone sono per lo più miofibroblasti 3. </li><li> Riportare la palloni per l&#39;incubatore per altre 24 ore, il trasferimento di cellule non aderenti ad un nuovo collagene rivestito T-25 pallone (o un piatto) e segnare come PP3. Aggiungere 5 ml di Media proliferazione nella piastra etichettato PP2. Queste cellule aderenti che attribuiscono a questo fiasco sono prevalentemente fibroblasti 2,3. </li><li> Ritorno di palloni l&#39;incubatore e ripetere la procedura in un altro 24 ore fino a PP6 popolazione è creato. Mantenere ogni gruppo di cellule sospese e consentire loro di proliferare e di esaminare regolarmente utilizzando un microscopio invertito. PP3-PP4 sono per lo più mioblasti mentre le cellule satelliti muscolari sono spesso visti per lo più in PP5 2. </li><li> La maggior parte delle cellule lentamente aderendo tipicamente da allegare PP6. In questa fase, le cellule appaiono piccole, rotonde, rifrazione della luce e sono molto sparse in numero e sono considerati una cellula staminali 1,2 popolazione. </li></ol> Fase 5: Identificazione ed espansione delle cellule staminali isolate <ol><li> L&#39;isolato PP6 cellule sono molto pochi e devono essere mantenuti in media FBS ricca proliferazione (20% FBS in DMEM) che viene cambiata ogni giorno. La maggior parte delle cellule presenti nello stampo PP6 cultura durante i successivi 1-2 settimane di coltura, ma una grande, sana PP6 popolazione è di solito creato dopo un ulteriore 1-2 settimane di espansione. Le cellule staminali isolate da topi altamente esprimere cellule staminali antigene 1 (SCA1), CD34, fegato fetale chinasi 1 (Flk1), e marcatori staminali altri 1,2,6,7 che possono essere visualizzati tramite colorazione immunocitochimica. Queste cellule staminali mostrano anche le capacità di differenziazione più 3,6,8. </li><li> Le cellule isolate sono mantenuti e ampliati a bassa densità cellulare in coltura (12-bene piatti a 50-100 cellule / pozzetto o confluenza &lt;20-30% nel pallone o un piatto) per evitare 1,2 differenziazione. Cellule molto pochi cloni forma durante l&#39;espansione, e queste cellule staminali clonate possono subire proliferazione lungo tempo (LTP) per qualsiasi studio di competenza di altri. Le cellule staminali clonate possono anche essere conservare in azoto liquido mediante le procedure generali di conservazione delle cellule p.es. PM con il 10% di DMSO. Fare un numero di stock a basso passaggio delle cellule staminali per qualsiasi altro studio backup. </li></ol>

<ol><li>Gharaibeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu-Petersen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+population+of+muscle+stem+cells+in+mice%3A+potential+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.</a> J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).</li>
<li>Li, Y. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+muscle-derived+cells+into+myofibroblasts+in+injured+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle.</a> Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).</li>
<li>Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &amp, Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+donor+muscle+precursor+cells+into+an+area+of+muscle+regeneration+in+the+host+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse.</a> J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).</li>
<li>Lu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+progenitor+populations+from+Pax7-deficient+skeletal+muscle+based+on+adhesion+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics.</a> Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+muscle-derived+cells+capable+of+enhancing+muscle+regeneration+and+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing.</a> J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptors+in+the+maturation-dependent+adenoviral+transduction+of+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers.</a> Gene Ther. 8, 627-637 (2001).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells+differentiate+into+haematopoietic+lineages+but+retain+myogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential.</a> Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).</li>
<li>Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+based+on+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine based on muscle stem cells.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).</li>
<li>Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+for+the+musculoskeletal+system+based+on+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells.</a> J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

E 'stato riconosciuto che alcuni tessuti adulti contengono cellule staminali multiple. Nel corso degli ultimi anni di studio, le cellule staminali sono state rilevate nei tessuti molli muscoloscheletrici, tra tendine e muscolo scheletrico. Questo protocollo corrente dettagli una procedura, nota come la tecnica preplate modificata, che è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio di isolare le cellule staminali adulte da tendini e muscoli scheletrici. Utilizzando la tecnica sopra descritta preplate modificato l...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11995-073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Serum di cavallo inattivato per il calore</td><td>Invitrogen</td><td>#26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di embrione di pollo</td><td>Accurate Chemical</td><td>#CE650T-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina 100 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco</td><td>Invitrogen</td><td>#14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone di Hank</td><td>Invitrogen</td><td>#24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo XI 0,2% (p/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C7657</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi 2,4 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,5% (p/v) (10x; 5 g/litro di tripsina (1:250))</td><td>Invitrogen</td><td>#15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Collagene per rivestimento di fiasche: collagene di tipo I derivato dalla pelle di vitello 0,1 g/litro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C-9791</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>#D-2650</td><td></td></tr></tbody></table>

isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Le cellule staminali adulte sono stati a lungo discussi in quanto alla loro applicazione nella medicina rigenerativa. Le cellule staminali adulte hanno generato una grande eccitazione per il trattamento di tessuti danneggiati e malati a causa della loro capacità impressionante di sottoporsi a più lignaggio differenziazione delle cellule e la loro capacità di auto-rinnovamento. Ancora più importante, queste qualità ne hanno fatto vantaggioso per l&#39;utilizzo nelle terapie di trapianto autologo di cellule. L&#39;attuale protocollo introduce i lettori alla tecnica preplate modificato i tessuti molli del sistema muscolo-scheletrico, tendini e muscoli per esempio, sono 1<sup&gt; St</sup&gt; Dissociato enzimaticamente e poi messe in flaconi collagene rivestito con media. Il surnatante, che è composto da medie e le restanti celle galleggianti, è in serie trasferite al giorno per fiaschi nuovo. Le cellule staminali sono il più lento di aderire ai fiaschi che si prende di solito 5-7 giorni (trasferimenti di serie o preplates). Utilizzando questa tecnica, le cellule staminali adulte presenti in questi tessuti possono essere facilmente raccolte attraverso abbastanza procedure non invasive.

Isolare le cellule staminali adulte da muscolo-scheletriche tessuti molli in base alla velocità rispetto della cellula di pallone.

Isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici

Le cellule staminali adulte sono oggetto di discussione da tempo in relazione alla loro applicazione nella medicina rigenerativa. Le cellule staminali adulte hanno generato un grande numero di ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali adulte da tessuti molli muscoloscheletrici, come il muscolo scheletrico. Questo viene ottenuto prelevando innanzitutto una biopsia del tessuto molle, rimuovendo le parti necrotiche e tritandolo finemente. Il secondo passaggio della procedura consiste nel digerire enzimaticamente il tessuto.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'isolare le cellule staminali mediante ripetuti passaggi di pre-piastratura. L'ultimo passaggio della procedura è l'identificazione delle cellule staminali isolate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano il comportamento morfologico e cellulare delle cellule mediante immunofluorescenza, microscopia e/o citometria a flusso.Ciao, sono y Lee del Laboratorio di Patologia Molecolare del Dipartimento di Chirurgia Ortopedica dell'Università di Pittsburgh. Oggi vi mostrerò come isolare una cellula staminale adulta dai tessuti molli del sistema muscolare di Mus, come il muscolo scheletrico. Ciao, sono il Dottor Johnny Ward.Sono un professore presso la School of Medicine dell'Università di Pittsburgh, nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica. Ho lavorato, come sa, a stretto contatto con il dottor Young Lee a queste procedure per isolare, sa, diversi tipi di cellule staminali dal muscolo scheletrico e da tessuti connettivali come il tessuto adiposo. Utilizziamo queste procedure nel nostro laboratorio per isolare cellule staminali principalmente per studi di ricerca sulle applicazioni in medicina traslazionale.Quindi cominciamo lo studio. I tessuti dai quali è possibile isolare cellule staminali includono tendini e muscoli scheletrici prelevati dai muscoli tibiali o soleo dell'arto posteriore di topi di tipo selvaggio. Dopo aver rimosso i residui di pelle e osso, posizionare i tessuti in una piastra contenente HBSS freddo integrato con FBS al 5%.Successivamente, posizionare il tessuto separatamente in piatti rivestiti di collagene contenenti HBSS freddo. Utilizzeremo tessuti muscolari scheletrici per dimostrare le procedure di base per la dissociazione e la digestione dei tessuti. Usare forbici microchirurgiche e/o lame di bisturi per tritare i tessuti scheletrici in una poltiglia grossolana prima della digestione enzimatica dei tessuti.Trasferire innanzitutto le sospensioni di tessuto MIT in provette da 15 millilitri separate e centrifugare a circa 3.500 giri al minuto a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il lavaggio SANE risospendendo in HBSS e ripetere la centrifugazione. Dopo aver rimosso il soprannatante, digerire le sospensioni aggiungendo 10 millilitri di collagenasi 0,2% preriscaldata.Incubare il tipo 11 per 60 minuti a 37 gradi Celsius, agitando i tubi a mano ogni 10 minuti. Al termine dell'incubazione di 60 minuti, centrifugare quindi risospendere i sospensati in 10 millilitri di soluzione DYS. Incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius, agitando a mano ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione di 45 minuti, centrifugare e quindi risospendere i sospensati in 10 millilitri di trips 0,2% in soluzione HBSS.Di solito si incuba per 15-20 minuti a 37 gradi Celsius, capovolgendo i tubi ogni 10 minuti, fino al completamento dell'incubazione. Quando un numero sufficiente di cellule singole è stato rilasciato dai tessuti, come illustrato qui, centrifugare le cellule ottenute e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo di proliferazione PM. Dissociare la sospensione cellulare facendo passare l'estratto attraverso una serie di aghi: due volte attraverso un ago da 18 gauge, una volta attraverso un ago da 23 gauge e infine una volta attraverso un ago da 27 gauge.Infine, far passare l'estratto cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron per iniziare la tecnica prepl. Centrifugare l'estratto cellulare appena preparato e risospendere i pellet in mezzo di proliferazione. Piastrare cinque millilitri della miscela cellulare in una fiasca T25 rivestita di collagene e identificare come PP1, incubando a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per due ore.Dopo due ore, trasferire le cellule non aderenti in un nuovo fiasco T 25 rivestito di collagene e identificarlo come PP due. Aggiungere cinque millilitri di PM nel precedente fiasco T 25 etichettato PP uno.Rimettere entrambi i flaconi nell'incubatore per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire le cellule non aderenti da PP due a un nuovo flacone T 25 rivestito con collagene ENC e contrassegnarlo come PP tre. Aggiungere cinque millilitri di mezzo di proliferazione nel flacone etichettato PP due.Rimettere le fiasche nell'incubatore. Ripetere la procedura ogni 24 ore fino alla popolazione PP sei. La popolazione di cellule staminali è stata creata.Le cellule PP6 isolate sono molto poche e devono essere mantenute in un mezzo di proliferazione ricco di FBS, che va cambiato quotidianamente. Tuttavia, la maggior parte delle cellule nella coltura PP6 morirà durante la successiva una-due settimane di coltivazione.Una popolazione sana e ampia di PP sei viene solitamente ottenuta dopo un'ulteriore espansione di una o due settimane. Mantenere anche tutti gli altri gruppi di cellule in sospensione, permettendo loro di proliferare ed esaminandoli regolarmente mediante microscopio invertito. Le cellule adesive precoci che si attaccano alle fiale PP uno e PP due sono per lo più cellule fibrotiche.Cellule che aderiscono a fiasche rivestite con collagene dopo un periodo di tempo più lungo, compreso tra 48 e 96 ore. PP tre e PP quattro sono per lo più mioblasti. Mentre le cellule satelliti muscolari si osservano spesso prevalentemente in PP cinque, le cellule prepl successive, a 96 ore o oltre (PP sei), sono considerate cellule staminali adulte e appaiono piccole, rotonde e traslucide.All'inizio del loro isolamento, possono essere ulteriormente caratterizzati mediante immunohistochemia per l'espressione di marcatori delle cellule staminali come cellula staminale, antigene uno e CDC 34. Vi abbiamo appena mostrato come isolare cellule staminali da una seconda massa del topo. Durante questa procedura, è importante ricordare di mantenere lo steroid durante tutti i passaggi.Dopo aver isolato la cellula staminale, assicurarsi di coltivare tali cellule a bassa densità per mantenere le caratteristiche delle cellule staminali. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento e vi auguro buona fortuna nell'utilizzare questo metodo nel vostro esperimento.Grazie.

isolating-stem-cells-from-soft-musculoskeletal-tissues

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra come micro-sezionare il sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione da embrioni e l'uso di citometria a flusso per ordinare le cellule staminali ematopoietiche.

Isolamento delle prime cellule staminali emopoietiche da murini sacco vitellino e AGM

Il micro-dissezionato tecnica espianti è un metodo robusto e affidabile per isolare proliferativa delle cellule del muscolo scheletrico da giovani, adulte o embrionali muscoli come fonte di cellule staminali del muscolo scheletrico. Unicamente, queste cellule sono state derivate clonazione per la produzione di muscolo scheletrico linee di cellule staminali utilizzate per trapianto in vivo.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

L'isolamento e la coltura di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti, una popolazione di cellule staminali muscolari, è essenziale per la comprensione del muscolo biologia delle cellule staminali e rigenerazione, nonché trapianto di cellule staminali per terapie in distrofia muscolare e altre malattie degenerative.

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

I vasi sanguigni all'interno del porto muscolo scheletrico diverse popolazioni precursori multi-lignaggio umane che sono ideali per applicazioni rigenerative. Questo metodo di isolamento permette la purificazione simultanea di tre popolazioni di cellule precursori multipotenti rispettivamente da tre strati strutturali dei vasi sanguigni: cellule endoteliali da miogenici intima, periciti dai media, e le cellule avventiziali da avventizia.

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

Questo protocollo descrive le tecniche per l'isolamento di cellule vive e la coltura primaria di linee cellulari miogeniche e fibroblastiche da tessuto muscolare o cutaneo.  Viene anche descritta una tecnica per l'immortalizzazione di queste linee cellulari.  Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

L'identificazione precisa delle cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) e delle cellule staminali muscolari (MuSC) è fondamentale per studiare la loro funzione biologica in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo fornisce linee guida per l'isolamento, la purificazione e la coltura di FAP e MuSC da muscoli di topo adulti.

FACS-isolamento e coltura di progenitori fibro-adipogeni e cellule staminali muscolari da muscolo scheletrico di topo imperturbato e ferito

Presentiamo un protocollo passo-passo per l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.

Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule staminali muscolari e dei progenitori fibro-adipogeni dai singoli muscoli scheletrici nei topi. Il protocollo prevede la dissezione di un singolo muscolo, l'isolamento delle cellule staminali mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza, la valutazione della purezza mediante colorazione con immunofluorescenza e la misurazione quantitativa dell'ingresso in fase S mediante saggio di incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina.

Isolamento di popolazioni di cellule staminali quiescenti da singoli muscoli scheletrici

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per isolare e arricchire mioblasti primari da muscoli scheletrici di topo adulti e neonati attraverso dissociazione tissutale, filtrazione sequenziale, preplaccatura e condizioni di coltura definite, consentendo l'istituzione e il mantenimento di colture mioblastiche derivate da cellule satellitari per applicazioni sperimentali a valle.

Isolamento delle cellule satelliti muscolari scheletrici per studi in vitro sulla miogenesi

Scopri come isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici utilizzando biopsia, digestione enzimatica e pre-plating ripetuto. Questo metodo supporta la ricerca in medicina rigenerativa.

Isolare cellule staminali da tessuti molli muscoloscheletrici

Esplora altri video