Name: 一个慢性双光子薄颅骨窗口技术在体内 Neuroinflammation模型小鼠小胶质细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学习使用薄颅骨双光子显微镜技术在小鼠体内实时成像小胶质细胞，观察HIV-1 Tat诱导的神经炎症反应。该方法可长期追踪细胞形态变化，为研究神经免疫机制提供重要工具。

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感谢 Emily A. Kelly 提供的头板设计。
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）对 H.A.G. 的资助：PO1 MH64570、RO1 MH56838、RO1 MH078989、R21 MH03851，以及 Geoffrey Waasdorp 儿科神经病学基金的慷慨支持，若无这些资助，本工作将无法完成。A.K.M. 的研究由 NIH（EY019277）、Whitehall 基金会、Alfred P. Sloan 基金会以及 Burroughs Wellcome 基金会的生物医学科学职业奖资助。M.E.T. 获魁北克健康研究基金会（FRSQ）博士后培训奖资助。D.F.M. 是由 NIH T32 GM07356 和 T32 AI049815 资助的医学科学家培训项目学员。

1. 准备动物以进行成像
<ol>
<li>在实验中，我们使用成年 CX3CR1GFP/+ 小鼠，该小鼠在包括小胶质细胞在内的单核细胞谱系中表达 GFP4。可根据特定项目需求使用不同品系的小鼠。</li>
<li>通过腹腔注射三种药物混合物对小鼠进行麻醉，药物成分为 0.05 mg/kg 芬太尼（Fentanyl）、5.0 mg/kg 咪达唑仑（Midazolam）和 0.5 mg/kg 美托咪啶（Medetomidine）5。当动物对疼痛刺激（如尾部夹捏）不再产生反应时，开始进行经颅成像窗（TSCW）的手术准备。在整个手术和成像过程中，将动物置于加热垫上，以防止麻醉后低体温。如有必要，可追加原始剂量三分之一的麻醉混合剂，以恢复原有的麻醉深度。</li>
<li>使用保护性眼膏覆盖动物的眼睛，以在麻醉期间保持眼球湿润，因为麻醉会抑制动物的眨眼反射。使用剃刀、剪刀或化学方法去除动物头皮上的毛发。使用 10% 聚维酮碘溶液和 70% 乙醇对头皮进行消毒。所有手术器械均需经过高压灭菌、玻璃珠灭菌器灭菌或用 70% 乙醇消毒。</li>
<li>使用小型剪刀从颅骨后方 4–5 mm 处开始，向前延伸至眼睛前方，沿中线切开头皮。该切口必须足够长，以确保皮肤不会干扰用于固定小鼠头部的头板粘接，该头板在双光子成像过程中起到稳定作用（图 1）。在解剖显微镜下确定需要磨薄的区域。应避免直接位于颅骨缝合线上的感兴趣区域，因为这些区域的颅骨稳定性较差，且下方较大的血管和脑膜会干扰成像。</li>
<li>用无菌棉签依次涂抹 100% 乙醇和 10% 氯化铁溶液，以干燥颅骨表面的膜状组织，并使用精细镊子或刀片将其刮除。若未能彻底清除这些膜状组织，将导致头板粘接不稳定。</li>
<li>在头板下方观察窗口边缘周围涂抹一层薄薄的 Permabond 910 胶水。将涂有胶水的头板轻压固定在动物颅骨的感兴趣区域上（图 1）。需注意，头板仅应粘附于颅骨骨面。若皮肤或膜状组织夹在头板与颅骨之间，将降低粘接的稳定性。随后使用注射器在观察窗口周围施加少量丙烯酸酯，以立即固化胶水。最后，在观察窗口边缘涂抹少量 Loctite 454 胶水，以防止液体渗漏。</li>
<li>将头板旋紧至动物固定装置上（图 1），并在解剖显微镜下用镊子轻轻探查，检查头板的稳定性。颅骨相对于头板不应有任何移动。在观察窗口滴加一滴生理盐水，确认无渗漏现象。</li>
</ol>
2. 制备去薄颅骨皮层窗
<ol>
<li>在准备磨薄颅骨之前，使用无菌棉签和压缩空气结合的方式将颅骨表面干燥。我们最初使用Microtorque II钻机（转速设定为4000 rpm）上的无菌IRF 007钻头对颅骨进行磨薄。非常轻柔地开始磨薄直径为2–2.5 mm的圆形区域，仅采用几乎与颅骨表面平行的轻扫动作，切勿施加直接向下的压力。每钻20–30秒暂停一次，使用压缩空气清除骨屑。钻孔过程中的这些间歇有助于颅骨冷却，从而避免对下方脑组织造成热损伤。
<ol class="lalpha">
<li>随着钻孔的进行，注意观察进入更湿润的松质骨层（即“板障”）的转变。一旦到达该层，需对钻头操作格外谨慎。</li>
</ol></li>
<li>通过在磨薄区域滴加生理盐水并在解剖显微镜下观察，可不时检查颅骨的厚度。生理盐水还能进一步促进热量的散发。随着颅骨逐渐变薄，较小的血管结构将变得可见。</li>
<li>在生理盐水覆盖下，使用无菌牙科微刀完成最终的磨薄操作，因为微刀能提供更精确的触觉反馈，反映颅骨的稳定性。这种方法可实现比单独使用钻头更薄的制备效果。根据我们的经验，最佳颅骨厚度为10–30 μm。
<ol class="lalpha">
<li>在初次尝试制作薄颅窗的前几次操作中，多次在落射荧光下检查颅骨厚度非常重要。所观察到的小胶质细胞和血管结构的清晰度与成像深度，可良好地指示颅窗是否已达到适合成像的状态。</li>
</ol></li>
<li>一旦颅窗准备就绪，将一块定制的矩形#0盖玻片（每边尺寸小于2 mm）粘附于颅窗上方。使用直径为1.0 mm的玻璃移液管，在磨薄的颅骨区域滴加少量氰基丙烯酸酯胶水，然后小心地将小片盖玻片放下，并轻轻按压使其紧贴颅骨，挤出多余的胶水。必须避免在玻璃与胶水之间形成气泡，因为滞留的空气会导致下方区域光学不透明。选用氰基丙烯酸酯胶水是因为其干燥后保持透明，同时可抑制骨组织和膜组织再生，从而维持颅窗下方颅骨的薄而透明状态。若盖玻片表面残留胶水，可在盖玻片就位且胶水干燥后，使用微刀小心将其去除。</li>
<li>手术后应立即给予镇痛剂（例如，皮下注射布托啡诺 2 mg/kg），并在出现任何疼痛迹象（包括活动意愿降低、进食或饮水减少、体重下降、流涎、竖毛、呼吸音异常等）时重复给药。</li>
</ol>
3. 双光子成像
<ol>
<li>进行双光子成像前，用生理盐水覆盖TSCW，并在落射荧光下定位感兴趣区域（图2）。为便于后续成像，使用照相相机拍摄该区域图像。</li>
<li>双光子成像采用自制的双光子显微镜6，配备调谐至920 nm的钛宝石激光器。荧光信号通过光电倍增管在全视野检测模式下收集，并使用580/180发射滤光片。整个成像过程中使用20倍水浸物镜（0.95 N.A.）。物镜处激光输出功率最大设定在50至65 mW之间。</li>
<li>选择皮层I层或II层的感兴趣区域（位于软脑膜表面下最多150 μm深度）。为便于重复成像，以1倍、2倍和3倍数字放大倍率拍摄同一视野的图像。血管可作为解剖标志，便于在后续成像过程中快速定位相同视野。在3倍放大下，每5分钟采集一次z轴堆栈图像，每个堆栈包含80–90个z轴步进，步进间距为0.69 μm，持续时间最长可达30分钟，从而实现对小胶质细胞形态和行为随时间变化的良好采样（图3）。在每次采集z轴堆栈图像之间，应检查TSCW表面生理盐水的覆盖情况以及动物的麻醉深度。</li>
</ol>
4. HIV-1 神经毒素 Tat 的注射
<ol>
<li>首先，对35号针头和10 μL微量注射器的内壁进行硅烷化处理，以防止Tat沉积。吸入硅烷化溶液（Sigmacote），使其充满针头和注射器。室温下静置5分钟。将溶液从注射器中排出，取出活塞，并让注射器和针头完全干燥。最后，用去离子水彻底清洗注射器和针头。</li>
<li>在已获取双光子图像的TSCW区域前方或外侧3 mm处，进行直径为0.5 mm的小型颅骨开窗。使用较小的钻头小心磨薄颅骨，直至可用尖头镊子轻松取下变薄的骨层。我们采用连接35号针头的10 μL微量注射器，由安装在三维微操作仪上的Ultramicropump III微量注射泵控制。将针尖对准颅骨开窗位置后，小心地将其推进至软脑膜表面下700至900 μm深度，并以80 nL/min的速度注入3 μL Tat1-72（或其他促炎剂）或生理盐水（或对照溶剂）。</li>
</ol>
5. 动物饲养
<ol>
<li>若需在同一天内对动物进行多次成像，应在两次成像间隔期间用眼用软膏与凡士林的混合物覆盖颅骨暴露区域，以防止动物不适或颅骨损伤。断开支撑桥与小型头颅固定板的连接（见图1B），并将动物置于加温笼中，确保食物和水易于获取。所有动物在术后必须始终单独饲养。当某只动物在当天的所有成像实验完成后，应小心移除整个头颅固定板，并使用#6或更细的缝合线将皮肤重新缝合覆盖颅骨。在实验间隔日，同样需将动物单独饲养，并确保食物和水易于获取。每天检查动物是否有任何应激、疼痛或感染的迹象。</li>
</ol>
6. 代表性结果
 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="小鼠颅窗实验装置示意图，用于活体光学研究的示意图尺寸。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 手术和双光子成像过程中动物的固定装置（A）及头部固定板设计（B）。
 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="荧光显微镜图像；细胞结构分析中的绿色发射。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过落射荧光观察到的GFP标记的小胶质细胞。
 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="显示对照组与HIV tat作用效果的神经元培养荧光显微镜图像，时间序列比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 植入TSCW后约在软脑膜表面下50 μm处，通过双光子成像观察到GFP标记的小胶质细胞。 在植入TSCW后15–30分钟（第0天）、以及7天和17天后采集的单张双光子切片图像显示，在无炎症刺激的情况下，窗口保持清晰，小胶质细胞维持非激活状态。在注射HIV神经毒素tat后6小时和24小时采集的z轴投影图像则显示出小胶质细胞显著的形态学变化，提示其被激活。比例尺：10 μm。

<ol><li>Mostany, R., &amp, P. ortera-C. ailliau, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li>
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<li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp, U. pender, B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li>
<li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp, M. cA. rthur, C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain%3A+correlations+with+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

人们日益达成共识，即与HIV-1相关的神经认知功能障碍（HAND）的实际病理基础是突触结构的破坏，这可能是由感染HIV-1的单核吞噬细胞释放的促炎介质所引起。小胶质细胞活化、多核巨细胞以及因星形细胞肥大导致的胶质增生，被认为是HIV-1感染及中枢神经系统炎症的非特异性标志。 7相比之下，死前神经疾病的严重程度与突触复杂性的丧失以及中枢神经系统中的巨噬细胞负荷相关。 8,9,10,11然而，单纯依靠传统免疫细胞化学研究获得的静态数据，无法模拟人类免疫缺陷病毒相关神经认知功能障碍（HAND）患者中小胶质细胞、外周浸润的巨噬细胞与神经元之间的动态相互作用。我们实验室近期的研究表明，通过立体定位注射 HIV-1 蛋白 Tat，可在一定程度上部分模拟外周与中枢单核细胞和神经元之间的某些相互作用。1-72 进入脑实质（Lu、Marker、Tremblay、Qi 和 Gelbard，未发表数据）。因此，我们决定应用 体内 双光子成像技术用于研究神经艾滋病（neuroAIDS）可操作的小动物模型中单核细胞来源的巨噬细胞、脑内常驻小胶质细胞与神经元之间的相互作用。尽管开颅或磨薄颅骨制备方法可在短时间内（数小时）实现对皮层结构的单次观察，但对于关注亚急性事件时间进程的研究者而言，这些方法会因对颅窗进行手术操作而人为激活小胶质细胞/巨噬细胞，从而产生干扰。本文展示了一种简单方法，通过在磨薄的颅骨区域上粘附一小片玻璃盖玻片，防止颅骨在经颅窗（TSCW）中再生，同时维持颅窗透光性达≥3周，从而克服上述局限。我们进一步证明，该技术使我们能够监测外周单核细胞进入脑微血管以及脑内常驻小胶质细胞在立体定位注射HIV Tat后的反应行为。1-72 在CX杂合小鼠的大脑皮层中3CR1/GFP（用于鉴定单核细胞系的细胞）。该技术可轻松适用于不同遗传背景的小鼠；例如，我们常规使用杂合型 CX3CR1/GFP X Thy-1 YFP 12 小鼠以研究单核细胞来源的巨噬细胞、脑内常驻小胶质细胞与神经元之间的相互作用 体内 与HIV相关性神经认知功能障碍（HAND）相关的神经炎症模型。我们的经颅窗（TSCW）制备方法使研究者能够在数周时间内研究外周与中枢神经系统之间的细胞间相互作用，并可在实验干预前后对同一动物进行多次成像，从而实现每个动物自身作为对照。该TSCW模型的一个局限性在于，所研究的目标细胞需经过基因改造以表达增强型荧光蛋白（eXFP），或使用荧光染料标记，且在此过程中不得破坏颅骨结构；此外，eXFP的表达水平必须足够强，以确保在数周内经过多次成像后仍能清晰观察到细胞结构。

<table><tbody><tr><td>枸橼酸芬太尼</td><td>Hospira 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸咪达唑仑</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸美托咪啶（Domitor）</td><td>辉瑞制药有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>超越宝迪加热</td><td></td><td></td></tr><tr><td>妥布霉素和地塞米松眼膏（TobraDex）</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘 10% 溶液</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化铁 10% 溶液</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸甲酯 910</td><td>Permabond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯 454</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEETS 义齿材料交联甲基丙烯酸甲酯</td><td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtorque II 手柄套件</td><td>Pearson 评估工具</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>IRF 007 钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Norland 可弯曲微刀全弧度</td><td>Salvin Dental</td><td>BLAD-NORLAND-69</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯</td><td>最初的超级胶水</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#0 玻片盖片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>63750-01</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;微量注射器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ILS010LT</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>35号微型针头（NanoFil）</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NL35BL-2</td><td></td></tr><tr><td>球磨机，碳化钨钻头 #1/4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501860</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100</td><td></td></tr><tr><td>光电倍增管 </td><td>滨松公司</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sapphire 激光器 Mai-Tai</td><td>Newport 公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于慢性双光子成像的薄颅窗技术 体内 神经炎症模型中鼠类小胶质细胞的成像

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

在神经科学领域，传统上对小鼠中枢神经系统进行体内双光子成像时，通常采用开颅1,2或磨薄颅骨3的制备方法。尽管开颅技术具有很高的灵活性，但由于其侵入性较强，可能引发小胶质细胞活化，因此并不适合用于小胶质细胞的研究。而虽然磨薄颅骨法侵入性较小，但在长期成像过程中需反复重新磨薄颅骨，这会增加组织损伤和小胶质细胞活化的风险，并限制成像次数。本文介绍一种慢性薄颅骨窗技术，结合双光子显微镜，可用于在较长时间内对小鼠小胶质细胞进行体内动态监测。我们展示了如何制备一种稳定、可重复访问的薄颅骨皮层窗（TSCW），并在其上覆盖玻璃盖玻片，使该窗口在数周间歇性观察期间始终保持透光性。与开颅手术或反复磨薄颅骨相比，该TSCW制备方法在免疫反应性方面更惰性，对小胶质细胞活化的影响极小，并可在数周时间内进行任意次数的成像。我们在CX3CR1 GFP/+小鼠4中制备TSCW，利用增强型绿色荧光蛋白将小胶质细胞可视化至软脑膜表面下≤150 μm深度。此外，我们还证明该方法可与立体定位脑内注射技术联合使用，在TSCW邻近区域注射HIV-1神经毒性蛋白Tat，从而诱导持久的小胶质细胞增生。因此，该方法在研究HIV相关性神经认知障碍（HAND）及其他具有神经炎症成分的神经退行性疾病模型中，对于活体大脑中小胶质细胞形态与运动性的时程变化观察具有极高的应用价值。

我们描述了一种用于反复观察小鼠小胶质细胞和循环单核细胞的方法 体内 数小时、数天或数周内，利用经颅双光子显微镜进行观察。我们展示了如何制备减薄颅骨窗，以实现对静息状态小胶质细胞的间歇性观察，并可通过邻近立体定位注射HIV-1调控蛋白Tat来激活这些细胞。

传统上，在神经科学领域，对小鼠中枢神经系统进行活体双光子成像时，通常采用开颅1,2 或……

在感染 HIV 的成年患者中，神经炎症会干扰正常的突触信号传导，导致神经认知功能障碍，表现为抽象思维、语言流畅性、注意力、学习新信息和记忆等方面的困难。HIV 的 Tat 蛋白可诱导炎症分子的分泌，从而模拟 HIV 患者中观察到的突触功能障碍。本研究使用在单核细胞（包括小胶质细胞）中表达 GFP 的成年小鼠，通过颅骨变薄的双光子显微镜技术来研究 HIV Tat 蛋白诱导的神经炎症。通过注射 tat 后的小胶质细胞反应可以在体内进行成像。所得图像显示小胶质细胞突起缩短增粗，形成类似吞噬杯的结构，以及外周单核细胞在脑微血管中的迁移。大家好，我是来自罗切斯特大学哈里斯·加尔巴德实验室及神经发育与疾病研究中心的 Dan Marker。大家好，我是来自罗切斯特大学神经生物学与解剖学系Esca实验室的EF Trombley。大家好，我是Shain Luu，也来自Albas实验室。今天我们将向您展示一种使用薄颅骨制备方法进行双光子成像的实验操作流程。我们采用此方法研究慢性神经炎症。现在开始本实验。本实验使用在包括小胶质细胞在内的单核细胞系中表达GFP的OT小鼠。可使用不同品系的小鼠以满足特定项目的需求。开始准备用于手术的芬太尼、咪达唑仑混合麻醉小鼠。首先，确保动物对尾部夹捏等疼痛刺激不再有反应。将动物放置在加热垫上，以防止麻醉后低体温。然后用保护性眼膏覆盖动物的眼睛，以保持眼睛湿润。所有手术器械应经过高压灭菌或使用玻璃珠灭菌器进行灭菌，并通过浸泡在70%乙醇中进一步消毒器械。使用剪刀去除动物头皮上的毛发，然后用 10% 聚维酮碘溶液和 70% 乙醇对区域进行消毒。用小剪刀开始手术，在头皮上做一正中切口，从颅骨后方 4 至 5 毫米处开始，向前延伸至眼睛前方。该切口应足够长，以确保皮肤不会干扰在双光子成像过程中用于固定小鼠头部的固定板的粘贴。接着，用无水乙醇润湿无菌棉签，擦干颅骨顶部的膜组织，然后用精细镊子将其刮除。如果未清除这些膜组织，头固定板的安装将不稳固。在解剖显微镜下，确定需要减薄的区域。应避免直接位于颅缝上方的区域，因为这些部位的颅骨稳定性较差，且下方较大的血管和脑膜会干扰成像，影响目标区域在观察窗口中的显示效果。然后，再次使用棉签，以10%的氯化铁溶液处理颅骨。在头板下方的观察窗边缘周围均匀涂抹一层薄薄的Perma Bond九一〇胶。然后将头板轻轻按压在动物颅骨的目标区域上，以使胶水粘合牢固。使用注射器在观察窗边缘周围施加少量丙烯酸树脂。最后，在观察窗边缘涂抹少量 Tite 4 54 以防止泄漏。将头板拧紧至动物固定器上，并在解剖显微镜下检查其稳定性；用镊子轻轻探触，颅骨相对于头板应无任何移动。在观察窗处滴加一滴生理盐水，以确保在进行颅骨变薄前无渗漏。使用无菌棉签和压缩空气相结合的方式干燥颅骨。使用微钻上的红外线 0 0 7 钻头将颅骨变薄。在 4,000 RPM 下，非常轻柔地开始减薄直径为 2 至 2.5 毫米的圆形区域。仅使用轻微的扫动动作，动作方向几乎与颅骨平行。不要施加直接向下的压力。每钻孔20至30秒后暂停一次，使用压缩空气清除骨屑。钻孔过程中的这些间歇有助于颅骨冷却，从而避免因热量导致 underlying 脑组织受损。随着钻孔的进行，注意观察向较湿润的棘状骨层（称为Diplo层）的转变。一旦到达此层，需对钻头格外小心。可通过在较薄区域滴加生理盐水，并在解剖显微镜下观察，以定期检查颅骨的厚度。生理盐水将进一步促进散热。随着颅骨变薄，更小的血管结构会变得可见。在生理盐水环境下使用牙科微刀完成最终的薄化操作。微型刀片能够提供关于颅骨稳定性的更多触觉反馈，从而实现比单独使用钻头更薄的制备。成像的最佳颅骨厚度为10至30微米。整个减薄过程通常需要15到30分钟。在制作薄颅窗时，需多次在落射荧光下检查颅骨的薄度。可见的小胶质细胞和血管结构的清晰度与成像深度可良好地指示颅窗何时已准备好进行成像。待窗口制备完成后，使用直径为1毫米的玻璃移液管将少量Cy丙烯酸胶滴加至颅骨较薄区域，并小心地将一片盖玻片轻轻覆盖其上。然后轻压盖玻片，使多余的胶水挤出，注意避免在盖玻片与颅骨之间产生气泡，以免影响观察视野。待胶水完全干燥后，使用微型刀片仔细去除残留在盖玻片表面的胶水，为双光子成像做好准备。用生理盐水覆盖颅骨薄层皮层窗，并在落射荧光下定位目标区域。为便于后续成像，使用相机拍摄一张图像。此处展示的是定制的双光子显微镜，其钛宝石激光器调谐至 920 纳米。使用光电倍增管（PMT）在全视野检测模式下检测荧光，并采用581/80发射滤光片。成像过程中使用20倍水浸物镜。将物镜的激光功率最大输出设置在50至65毫瓦之间。接下来，选择一个感兴趣的区域，即果皮表面下方深达150微米的皮层第一层或第二层。为了便于重新成像，可在1倍、2倍和3倍数字放大下对同一视野拍摄图像。在后续成像过程中，血管可作为解剖标志，帮助快速定位相同的视野。在3倍放大倍数下，每次以80至90个Z轴步进采集多个Zacks，每步0.69微米，每隔5分钟采集一次，持续最长30分钟。这可在Zacks采集间隔期间实现对小胶质细胞形态和行为随时间变化的良好采样。在采集过程中，需验证生理盐水水平及麻醉深度。如有必要，可在操作期间给予原始麻醉混合剂剂量三分之一的追加剂量，以防止注射前数天内麻醉剂在注射器和针头表面沉积。通过抽吸定径溶液直至其充满35号针头和10微升微量注射器的内腔，对二者进行内壁硅化处理。室温下静置五分钟，然后将注射器中的溶液排空，取出活塞，并让注射器和针头完全干燥。最后，用去离子水彻底清洗注射器和针头。经过硅化处理后，注射器和针头可在需要重新处理前使用超过六个月。在注射当天，将一滴TAT溶液置于硅化玻璃载片上。使用硅化移液枪头，从此液滴中吸取所需体积的溶液，注入微量注射器中。使用钻头，在双光子成像所获得的薄颅骨皮层窗前方或外侧 3 毫米处，进行直径为 0.5 毫米的小型颅骨开窗。操作时，先小心磨薄颅骨，然后用锋利的镊子去除薄层骨组织。使用显微操作器将选定的35号针头和注射器与颅骨开孔对齐。然后小心地将针头推进至剥离表面以下700至900微米的深度。使用微处理器控制的注射泵，以每分钟80纳升的速度注入3微升液体。该图显示了在植入薄颅骨皮层窗后，通过双光子成像观察到的GFP标记的小胶质细胞，成像深度位于剥离表面下方约50微米处。在植入薄颅骨皮层窗后的第0天（即植入后15至30分钟）、第7天以及第17天所获取的单层双光子图像表明，窗口保持清晰，且在无炎症刺激的情况下小胶质细胞仍处于激活状态。这凸显了该方法在研究免疫效应细胞与其他神经细胞类型之间正常及炎症状态下相互作用方面的实用性。体内实验显示，在注射 HIV 神经毒素 TAT 后 6 小时和 24 小时拍摄的 Z 轴投影图像中，小胶质细胞呈现出显著的活化形态学变化。这进一步证明了我们能够在急性和慢性神经炎症模型中实时研究小胶质细胞的形态学改变。刚才我们向您展示了如何制备薄颅窗并利用它来研究神经炎症。在进行该操作时，请注意以下事项。在处理颅骨时，务必记住要耐心操作，以避免因制备过程本身造成任何损伤。就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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学习使用薄颅骨双光子显微镜技术在小鼠体内实时成像小胶质细胞，观察HIV-1 Tat诱导的神经炎症反应。该方法可长期追踪细胞形态变化，为研究神经免疫机制提供重要工具。

一种用于慢性双光子成像的薄颅窗技术体内神经炎症模型中鼠类小胶质细胞的成像

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