Name: ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Impara a quantificare i foci di γH2AX nei tessuti murini con un saggio di immunofluorescenza in vivo. Questo metodo consente di rilevare le rotture a doppio filamento del DNA e valutare la radiosensibilità nei modelli di malattia.

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Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro. MMT è grata per l&#39;assistenza di esperti e la consulenza del Dr. Olga Sedelnikova dal National Institutes of Health.

Tessuti <ol><li> Tessuto polmonare, incorporati in stampi in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto 4583, è stato sezionato (5 micron) utilizzando un criostato Leica CM 1950, montato su poli-L-lisina diapositive. </li></ol> I campioni congelati sono stati ottenuti dal dottor Simon Royce a bambini di Murdoch Research Institute. Tessuto polmonare è stato ottenuto da Balb non trattata / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree che mostra molte delle caratteristiche patologiche di asma umano 6. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal Comitato Etico della Animal Research Institute Children Murdoch che aderisce al Codice di Pratica australiano per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio per scopi scientifici. <ol start="2"><li> Le sezioni sono stati lasciati asciugare all&#39;aria a temperatura ambiente per 1 ora. </li></ol> Immunofluorescenza <ol><li> Le sezioni sono stati fissati con il 2% (w / v) paraformaldeide in tampone fosfato (PBS) per 20 minuti. </li><li> Sezioni sono state equilibrata con due lavaggi in PBS per 15 minuti ciascuno. </li><li> Le sezioni sono state trattate con etanolo al 70% (refrigerate a -20 ° C) per 20 minuti, seguita da tre lavaggi in PBS per 10 minuti ciascuno. </li></ol> A questo punto i vetrini possono essere conservati in contenitori sigillati a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. <ol start="4"><li> Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS per 10 minuti ciascuna e quindi bloccato con 100μL preparati al momento in PBS contenente 8% di BSA in PBS contenente 0,5% Tween-20 e dello 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) per 1 ora a temperatura ambiente . Tutte le incubazioni sono state eseguite in una vasca colorazione umidificato. </li><li> Sezioni sono state lavate con PBS-TT per 5 minuti e un perimetro idrofobico è stato segnato in tutto il tessuto con una penna Pap. </li><li> Tampone in eccesso è stata una soffiata e 100μl di primario policlonale di coniglio anti-γH2AX anticorpi (diluito 1:500 in 1% BSA in PBS, Millipore), è stata aggiunta ad ogni sezione per un 2 ore di incubazione a temperatura ambiente. Incubazione con anticorpo primario può essere eseguito durante la notte a 4 ° C. Per ulteriori prove, che rappresentano focolai γH2AX DSB, un anticorpo primario riconoscere una proteina riparazione DSB può anche essere usato. Per esempio, co-localizzazione di γH2AX e fosfo-ATM è una combinazione di uso comune. </li><li> Le sezioni sono state lavate due volte in PBS-TT per 5 minuti ciascuno e incubato con 100μl di anticorpo secondario (Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio diluito 1:500 in 1% BSA, Invitrogen) per 1 ora a temperatura ambiente al buio . (Anticorpo diluito è stato tenuto al buio tutta la procedura). </li><li> Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS-TT per 5 minuti ciascuno e incubate con 0.5mg/mL RNase A per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Nucleare di contrasto e di montaggio è stato eseguito con mezzo Vectashield contenenti ioduro di propidio. </li><li> I vetrini sono stati sigillati con smalto e conservato durante la notte a 4 ° C al buio prima dell&#39;analisi. </li></ol> Microscopia / Analisi <ol><li> A Meta Zeiss LSM510 microscopio confocale è stato utilizzato per acquisire immagini utilizzando la GFP standard (per γH2AX - Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio) e PI (543 nm). </li></ol> Le immagini sono state acquisite in una serie Z tracciato con dimensione del passo di 0,5 micron. Durante l&#39;analisi, i piani individuali sono stati deconvoluted e impilati per produrre una immagine proiettata al massimo per minimizzare la sovrapposizione dei focolai. Il metodo di creazione di una immagine proiettata al massimo prima di un numero di particelle deve essere utilizzato solo in circostanze in cui viene utilizzata una sezione sottile (ad esempio 5 micron) e dove la colorazione di fondo è insignificante. Dove più spesso le sezioni con un significativo background deve essere analizzato, una analisi più complesse come Contatore oggetto 3D come descritto da Bolte e Cordelieres (2006) deve essere usato 7. <ol start="2"><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) è stato utilizzato per creare fusi (rosso e verde) immagini per quantificare il numero di focolai. </li></ol> Anche se Metamorph può essere utilizzato per quantificare i numeri focolai, derivante dall&#39;uso di sezioni di tessuto focolai vengono conteggiati manualmente (ad occhio) per una maggiore precisione. Specifici tipi cellulari di interesse possono essere selezionati per la quantificazione, per esempio le cellule epiteliali del polmone. Ciò può essere fatto sulla base di istologia e con riferimento al ematossilina e eosina sezioni colorate seriale.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ai fini di questa dimostrazione abbiamo usato tessuto polmonare del mouse non trattati da Balb / c topi e da un modello murino della malattia allergica cronica delle vie aeree. Abbiamo quantificato differenze nel numero di focolai per cella con medie leggermente più alto osservato nei polmoni danneggiati rispetto a sezioni non trattati. In particolare, la quantificazione indicato per 6,5 focolai / cellulare e del 9,4 per focolai / cella (conteggio manuale di 20 cellule per sezione), nei tessuti non trattati e cronica ma...

<table><tbody><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>L'BSA (1%) viene utilizzato per bloccare qualsiasi legame non specifico degli anticorpi. Gli anticorpi primari e secondari vengono diluiti in BSA.</td></tr><tr><td>PBS (senza Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; e Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Composto OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Vetrini Polysine</td><td>Menzel-Glaser</td><td>SF41296SP</td><td>Attrae elettrostaticamente sezioni di tessuto congelato e riduce la necessità di rivestimenti e adesivi aggiuntivi.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reagente</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (0,5%) è un detergente utilizzato per permeabilizzare le cellule</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1%) utilizzato per permeabilizzare le cellule.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-&amp;#947;H2AX (anticorpo policlonale da coniglio)</td><td>Anticorpo primario</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>Diluizione dell'anticorpo primario (1:500) in BSA al 1%.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo caprino anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Anticorpo secondario</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>Diluizione dell'anticorpo secondario (1:500) in BSA al 1%.</td></tr><tr><td>Etanolo (70%)</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Reagente</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield PI</td><td>Reagente</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>Un mezzo di montaggio a base di glicerolo contenente ioduro di propidio (un colorante nucleare rosso). Questo mezzo deve essere utilizzato con un obiettivo a immersione in olio che corrisponda al suo indice di rifrazione.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Nota: colorante per DNA comunemente utilizzato: 4,6-diamidino-2-fenilindolo diidrocloruro (DAPI). Può essere utilizzato solo con microscopi dotati del laser di eccitazione appropriato.</td></tr><tr><td>Mini penna PAP</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (22x50 mm)</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Vaso Coplin, in vetro</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Vasca di colorazione</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocale</td><td></td><td>Microscopio confocale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM Leica 1950 Criostato</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software per l'analisi delle immagini</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Γh2ax quantificazione dei foci, a campioni di tessuto

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA a doppio filamento (DSB) sono lesioni particolarmente letali e genotossici, che possono derivare sia da processi endogeni (fisiologici o patologici) o da fattori esogeni, in particolare le radiazioni ionizzanti e composti radiomimetici. Fosforilazione della variante dell&#39;istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX, è una risposta precoce al DNA a doppio filamento<sup&gt; 1</sup&gt;. Questo evento fosforilazione è mediata dalla fosfatidil-inosito 3-chinasi (PI3K) famiglia di proteine, atassia telangiectasia mutati (ATM), DNA-proteina chinasi subunità catalitiche e ATM e RAD3-correlate (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Nel complesso, i risultati induzione DSB nella formazione di discreto nucleare γH2AX focolai che può essere facilmente individuato e quantificato mediante microscopia di immunofluorescenza<sup&gt; 2</sup&gt;. Data la specificità unica e la sensibilità di questo marcatore, l&#39;analisi di focolai γH2AX ha portato ad una vasta gamma di applicazioni nella ricerca biomedica, in particolare in biologia e medicina nucleare radiazioni. La quantificazione di γH2AX focolai è stata più ampiamente studiato in sistemi di colture cellulari nel contesto delle radiazioni ionizzanti indotte DSB. Oltre radiosensibilità cellulare, immunofluorescenza test basato sono stati utilizzati anche per valutare l&#39;efficacia di radiazione che modificano composti. Inoltre, γH2AX è stato utilizzato come marcatore molecolare per esaminare l&#39;efficacia di vari composti che causano DSB ed è recentemente annuncia come importante marker di invecchiamento e malattie, in particolare il cancro<sup&gt; 3</sup&gt;. Inoltre, immunofluorescenza metodi basati sono stati adattati per soddisfare il rilevamento e la quantificazione delle foci γH2AX<em&gt; Ex vivo</em&gt; E<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Qui, dimostriamo un metodo tipico di immunofluorescenza per il rilevamento e la quantificazione di γH2AX focolai nei tessuti del mouse.

La quantificazione di DNA a doppio filamento sulla base di γH2AX focolai è diventato uno strumento prezioso, in particolare in biologia radiazione, per la valutazione della radiosensibilità dei tessuti e gli effetti dei composti radiazione modificando. Qui mostriamo l&#39;utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione del γH2AX focolai in campioni di tessuto.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

Le rotture del doppio filamento (DSB) del DNA sono lesioni genotossiche e particolarmente letali, che possono derivare sia da cause endogene (fisiologiche o patologiche) ...

Ciao, mi chiamo Michelle Tang dei Laboratori di Medicina Epigenomica e Epigenetica Umana. Diretto dal dottor Tom Carianne, professore associato ASAM Holster presso l'Istituto Baker IDI per il Cuore e il Diabete. Oggi illustrerò un saggio di immunofluorescenza gamma H2AX in vivo per determinare la quantità di danno al DNA nei tessuti malati.H2AX è una variante dell'istone, che rappresenta circa dal 2 al 10% dell'istone H2A totale nelle cellule mammifere e viene rapidamente fosforilata sul serina 139 in risposta a danni al DNA. La forma fosforilata di H2AX è nota anche come gamma-H2AX ed è stato stabilito che esiste una correlazione diretta tra il numero di rotture a doppio filamento e la quantità di gamma-H2AX. Gamma-H2AX è un marcatore molecolare sensibile ed è stato dimostrato essere un indicatore precoce di rottura del doppio filamento. Pertanto, rappresenta una tecnica utile per rilevare i danni al DNA.La gamma H2AX può essere visualizzata come fuochi nucleari nei siti di danno del DNA mediante microscopia fluorescente. Ai fini di questo esperimento, utilizzerò tessuti polmonari di topo ottenuti dal dottor Simon Royce presso il Murdoch Children's Research Institute. Studierò il danno del DNA in tessuti polmonari provenienti da un modello murino di malattia cronica delle vie aeree di tipo allergico, che presenta molte delle caratteristiche patologiche dell'asma umana, tra cui iperreattività delle vie aeree, rimodellamento delle vie aeree e infiammazione delle vie aeree.Iniziamo quindi l'esperimento. Cominciamo ponendo i campioni a meno 20 gradi Celsius inserendoli nel criostato per circa 20 minuti. Per una temperatura ottimale di taglio, si utilizzano vetrini SRO in modo che le sezioni di tessuto non si stacchino dai vetrini.Durante la colorazione immunofluorescente, l'OCT viene utilizzato per fissare i campioni al mandrino, posizionare il mandrino sul blocco di taglio, assicurandosi che sia saldamente attaccato. Impostare il criostato per tagliare sezioni tissutali di cinque micrometri, iniziare con attenzione il taglio tirando i campioni verso di sé con un pennello e posizionare il vetrino microscopico sopra le sezioni, che dovrebbero aderire alla superficie di vetro. Lasciare asciugare le sezioni a temperatura ambiente per un'ora per garantire la completa rimozione dell'umidità prima di procedere.Prima di tutto, fissiamo i preparati istologici utilizzando paraformaldeide al 2% preparata in PBS senza calcio e magnesio per 20 minuti. Rimuoviamo il paraformaldeide in eccesso e poniamo i vetrini in un barattolo Copeland per due lavaggi di 15 minuti ciascuno in PBS per la permeabilizzazione. Successivamente alla permeabilizzazione, i campioni vengono trattati con etanolo al 70% a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. I campioni vengono lavati tre volte in PBS per 10 minuti ciascuno.Rimuovere ogni sito singolarmente per evitare che i preparati istologici si secchino. Bloccare l'eccesso di PBS dal vetrino e quindi bloccare le sezioni con BSA all'8% in PBS contenente da 0,5% a 0,1% di Triton X-100, noto anche come P-B-S-T-T. Questi vetrini vengono lasciati incubare per un'ora a temperatura ambiente; dopo l'incubazione, i campioni vengono lavati con P-B-S-T-T per cinque minuti.PBS TT viene utilizzato per facilitare la penetrazione dell'anticorpo nel nucleo. I vetrini vengono quindi lavati e asciugati per rimuovere l'eccesso di P-B-S-T-T. Un cerchio viene tracciato attorno alle sezioni con una penna da microscopio per ridurre la quantità di reagenti utilizzati.È stato utilizzato un anticorpo primario, un anticorpo policlonale rapido anti fosfo gamma H tox. È stata preparata una diluizione 1:500 in BSA al 1% in P-B-S-T-T. Queste sezioni sono state collocate in una camera umida e lasciate incubare per due ore a temperatura ambiente.Eliminare l'anticorpo primario in eccesso prima di eseguire due lavaggi di cinque minuti ciascuno in P-B-S-T-T per rimuovere l'anticorpo primario in eccesso. Rimuovere le lamelle e asciugare il P-B-S-T-T in eccesso. È stato utilizzato l'anticorpo secondario caprino anti-Reid IJJ 488. È stato aggiunto ai campioni un'anticorpo secondario diluito 1:500 in BSA al 1% in P-B-S-T-T. Le sezioni sono quindi state incubate per un'ora in una camera umida, quindi l'anticorpo secondario è stato rimosso prima di eseguire tre lavaggi di cinque minuti ciascuno in N-P-B-S-T-T per eliminare l'eccesso di anticorpo secondario.Coprire il barattolo di Copeland con carta d'alluminio per evitare esposizioni alla luce durante ciascun passaggio di lavaggio. Rimuovere i vetrini ed asciugare l'eccesso di P-B-S-T-T. L'aggiunta di 0,5 milligrammi per millilitro di RNAsa A in PBS è stata utilizzata per ridurre qualsiasi colorazione citoplasmatica.I campioni vengono quindi incubati a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Dopo l'incubazione, l'RNA A viene rimosso e i campioni vengono lavati brevemente in P-B-S-T-T per evitare che le sezioni si secchino. Mantenere i campioni avvolti nella carta d'alluminio prima dell'aggiunta del mezzo di montaggio.Rimuovere un vetrino alla volta e asciugare l'eccesso di P-B-S-T-T. Aggiungere il mezzo di montaggio Vector Shield contenente ioduro di propidio, un colorante nucleare rosso, su ciascuna sezione. Quindi abbassare con cura un coprioggetto cercando di evitare di intrappolare bolle d'aria, rimuovendo l'eccesso di Vector Shield su carta assorbente.Quindi, levigare ora i bordi del vetrino per sigillarli ed evitare che i campioni si secchino. Infine, conservare i campioni al buio a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo per la microscopia. Un microscopio confocale LSM 510 META è stato utilizzato per acquisire immagini digitali mediante un obiettivo ad immersione da 63 volte, impiegando un laser a argon e un laser a elio-neon rispettivamente a una lunghezza d'onda di 488 nanometri per Alexa Fluor 488 e 543 nanometri per il colorante ioduro di propidio.Ogni campo era composto da otto a quindici sezioni ottiche in serie Z con un incremento di 0,5 micrometri e un ingrandimento singolo. Le immagini vengono esportate come file TIF individuali e analizzate utilizzando Metamorph. Le immagini acquisite dal microscopio confocale Zeiss LSM 510 Meta vengono aperte nel programma Metamorph per l'analisi delle immagini e il conteggio iniziale ad occhio nudo. Le immagini fluorescenti acquisite in serie Z vengono deconvolute e sovrapposte per produrre un'immagine 2D mediante filtri di proiezione massima.Questo è stato fatto per minimizzare la perdita di fuochi meno intensi. Le immagini proiettate al massimo vengono trasformate in un'immagine binaria e vengono applicati filtri morfologici come il top hat per ridurre lo sfondo e migliorare anche la sensibilità nella rilevazione dei fuochi. Vengono caricate le corrispondenti immagini al propidio ioduro e vengono identificate le regioni nucleari.Queste regioni vengono evidenziate disegnando manualmente delle aree attorno ai nuclei per contare il numero di foci per campo. Le regioni vengono trasferite sulle immagini top hat e vengono applicati filtri di soglia luminosa. La soglia è stata scelta attentamente mediante confronto visivo in accordo con i foci, al fine di evitare l'inclusione di qualsiasi segnale di fondo all'interno di ciascun campo.Per contare i fuochi è stata utilizzata l'analisi morfologica integrata per IMA. In alternativa, i conteggi possono essere effettuati manualmente per garantire l'affidabilità dei risultati. Con questo si conclude il protocollo di colorazione immunofluorescente in vivo per determinare la quantità di danni al DNA nei tessuti malati.Questa tecnica è adatta per il rilevamento dei danni al DNA causati da diversi stimoli. Tuttavia, è particolarmente indicata per valutare le risposte alle radiazioni ionizzanti e alla radiosensibilità. È tutto.Grazie per aver guardato.

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La quantificazione di DNA a doppio filamento striature formazione γH2AX utilizzando come marcatore molecolare è diventata uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione della γH2AX focolai dopo l'esposizione delle cellule alle radiazioni.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

Analisi al microscopio di γH2AX focolai, che formano in seguito alla fosforilazione di H2AX a livello della serina-139 in risposta a DNA a doppio filamento, è diventato uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui abbiamo usato un anticorpo mono-istone H3 metilato in lisina 4 come marker epigenetici attivamente eucromatina di trascrizione, di valutare la distribuzione spaziale della radiazione indotta formazione γH2AX all'interno del nucleo.

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a immunofluorescenza per rilevare specifiche proteine di risposta al danno del DNA localizzate nei siti di rottura del doppio filamento di DNA nelle cellule mononucleate umane. Le proteine sono riconosciute da specifici anticorpi primari, che a loro volta si legano agli anticorpi secondari marcati con fluorofori che emettono fluorescenza durante la visualizzazione microscopica, consentendo la visualizzazione delle proteine come focolai...

Microscopia a immunofluorescenza per l'analisi delle rotture del DNA a doppio filamento

senescenza cellulare, lo stato irreversibile di arresto del ciclo cellulare, può essere indotta da vari stress cellulari. Qui, descriviamo i protocolli per indurre la senescenza e metodi per valutare cellulare marcatori di senescenza.

Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

Questo manoscritto fornisce un protocollo per l'analisi delle rotture del doppio filamento di DNA da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

Il metodo presentato combina l'analisi quantitativa delle interruzioni del DNA a doppio filamento (DSB), la distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi per consentire la valutazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché le conseguenze del fallimento della riparazione.

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Questo protocollo presenta la preparazione del vetrino e il punteggio automatico del test dei fuochi γ-H2AX sui linfociti del sangue periferico. Per illustrare il metodo e la sensibilità del test, i linfociti isolati sono stati irradiati in vitro. Questo metodo automatizzato di rilevamento del DNA DSB è utile per applicazioni di dosimetria biologica rapida e ad alto rendimento.

Un metodo di punteggio microscopico automatizzato per il test foci γ-H2AX nei linfociti del sangue periferico umano

Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.

Doppia immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei linfociti periferici umani

Qui, presentiamo un protocollo semplice e rapido per il rilevamento dell'interazione proteica nei siti di danno al DNA.

Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

Impara a quantificare i foci di γH2AX nei tessuti murini con un saggio di immunofluorescenza in vivo. Questo metodo consente di rilevare le rotture a doppio filamento del DNA e valutare la radiosensibilità nei modelli di malattia.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

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