Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare i bersagli genomici di KDM 5, uno Jared, un RBB, due istone demetilasi. Ciò si ottiene mediante la preparazione di cromatina reticolata che viene sonicata per produrre frammenti di DNA della dimensione appropriata come seconda fase. I frammenti di DNA legati a due RBB sono immunoprecipitati con due anticorpi RBB.

Successivamente, il DNA genomico recuperato viene amplificato mediante PCR per il sequenziamento. Infine, le letture brevi sequenziate di Illumina sono allineate in modo univoco al genoma umano e i picchi significativi vengono identificati e annotati ai geni più vicini. Al fine di identificare rbbb due geni bersaglio, si ottengono risultati che mostrano funzioni molecolari associate a Rrb B due geni bersaglio basati sull'identificazione a livello di genoma di Rbbb due regioni arricchite.

Ciao, sono Mike. Proviene dal laboratorio della Dott.ssa Elizabeth Bencia presso il Dipartimento di Biochimica e Genetica Molecolare dell'Università dell'Illinois a Chicago. E sono anche del laboratorio di genomica biomedica guidato dal Dr.NGA presso il BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea.

E io sono Danielle Dal. E io sono William Richter. Entrambi siamo anche nel Laboratorio delle Abilità di Benevolenza.

Oggi vi mostreremo una procedura per la cromatina, l'immunoprecipitazione e il sequenziamento. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il sito di legame del suo dermatologo. Quindi iniziamo.

Per iniziare questa procedura, far crescere circa 10-8 cellule. Per ogni immunoprecipitazione o ip. Qui, linfoma osteolitico diffuso.

Le cellule U 9 37 vengono utilizzate e indotte per la differenziazione monocitica con TPA per 96 ore dopo la crescita cellulare in soluzione di formaldeide direttamente nel terreno fino a una concentrazione finale dell'1%, quindi agitare brevemente il pallone e lasciarle riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi aspirare il terreno e sciacquare le cellule con 15 millilitri di PBS ghiacciato. Ripetere questo lavaggio una volta.

Quindi, aggiungere sei millilitri di tampone di lisi uno a ciascuno dei palloni su ghiaccio. Quindi agitare le fiasche per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Infine, raccogliere le cellule utilizzando un raschiatore cellulare e trasferirle in provette coniche da 15 millilitri.

A questo punto, le celle possono essere conservate a meno 80 gradi Celsius. Se le celle erano congelate, espellerle. Una volta scongelato, fai girare le cellule verso il basso e scarta lo snat.

Quindi risospendere le cellule in sei millilitri di tampone di lisi due, far oscillare delicatamente le provette a temperatura ambiente per 10 minuti. Ripetere la centrifugazione e risospendere le cellule in 2,5 millilitri di tampone di lisi tre. Successivamente, preparare la sospensione per la sonicazione posizionandola in un becher di acqua ghiacciata con la micro punta di un sonier Branson 450 impostata su un'ampiezza compresa tra il 50 e il 60%.

Sonicare la soluzione per una 32a raffica costante e raffreddare sul ghiaccio. Per un minuto, ripetere questi impulsi da 10 a 15 volte, quindi pipettare il contenuto della provetta su e giù e trasferirlo in una nuova provetta. Continuare a frullare e raffreddare la soluzione.

Altre cinque volte dopo la sonicazione, aggiungere il 10% di Triton X 100 a un decimo del volume della soluzione. Quindi trasferire i lisati in provette da centrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare i detriti in una microcentrifuga prima della cromatina, dell'immunoprecipitazione o del chip. Conservare 50 microlitri di lisato cellulare come campione di input.

Quindi ha combinato il lisato cellulare eliminato con perle di dyna legate all'anticorpo che era stato precedentemente preparato come descritto nel protocollo scritto. Agitare la miscela in aggiunta al campione di input da 50 microlitri a quattro gradi Celsius durante la notte. Lavare le perline con un millilitro di tampone di lavaggio.

Quindi utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline e rimuovere il surnatante. Ripeti questo lavaggio da sei a otto volte. Eseguire un lavaggio finale con un millilitro di TE più 50 millimolari di cloruro di sodio.

Centrifugare le perle in una microcentrifuga dopo la centrifugazione, aspirare l'eventuale tampone TE residuo. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone elu ai campioni. Subito dopo.

Incubare i campioni a 65 gradi Celsius per 10-15 minuti. Grattare i tubi contro un brack da 1,5 millilitri ogni due minuti per mantenere le perle in sospensione. Raccogliere le perle utilizzando la centrifugazione e il supporto magnetico e trasferire lo SNAT in una provetta per PCR.

Quindi recupera il campione di input salvato in precedenza e aggiungi tre volumi del buffer di eluizione. Infine, posizionare l'IP e inserire i campioni nel termociclatore durante la notte a 65 gradi Celsius. Per invertire i collegamenti incrociati il giorno successivo, aggiungere un volume di tampone TE ai campioni.

Quindi aggiungere gli RNA A a una concentrazione finale di 0,2 microgrammi per microlitro. Incubare i campioni nel termociclatore per una o due ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere la proteinasi K a una concentrazione finale di 0,2 microgrammi per microlitro.

Quindi incubare i campioni nel termociclatore a 55 gradi Celsius per due ore. Quindi, estrarre i campioni una volta con un volume di fenolo. Estrarre i campioni una seconda volta con un volume di alcol isoamilico fenil cloroformio.

Infine, estrarre nuovamente i campioni con un volume di alcol isoamilico cloroformio. Quindi aggiungere 30 microgrammi di glicogeno a ciascun campione. Inoltre, aggiungere ai campioni cloruro di sodio a una concentrazione finale di 0,2 molari e due volumi di etanolo.

Incubarli per 30 minuti a meno 80 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni e decantare lo snat. Lavare i pellet con 500 microlitri di etanolo al 75%, quindi asciugare i pellet e rimetterli in sospensione in 40 microlitri di acqua.

Per verificare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di SONICAZIONE, caricare cinque microgrammi del campione di input purificato in un gel agro all'1,8% ed eseguire il gel. La procedura di sonicazione dovrebbe produrre frammenti nell'intervallo da 150 a 350 coppie di basi. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere regolata variando il numero di raffiche e l'ampiezza prima dell'amplificazione del DNA genomico.

Controllare le dimensioni, la concentrazione e l'arricchimento dei campioni come descritto nel protocollo scritto. Per iniziare l'amplificazione del DNA genomico, ottenere 34 microlitri del campione IP e 200 nanogrammi del campione di input. Eseguire e riparare l'aggiunta e la legatura di adattatori ai frammenti di DNA utilizzando un kit di preparazione del campione di DNA genomico Illumina come descritto nel protocollo scritto.

Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR mini lut e poi eluirlo nel tampone EB che è stato preriscaldato a 50 gradi Celsius. Utilizzare rispettivamente 23 microlitri e 46 microlitri per l'IP e i campioni di DNA in ingresso. Effettuare la reazione PCR utilizzando 23 microlitri di DNA con adattatori 25 microlitri di fusione, DNA polimerasi dal kit.

Un microlitro da 20 micromolari, suola PCR, uno e un microlitro da 20 micromolari. Quindi la PCR due esegue la reazione PCR come descritto nel protocollo scritto dopo l'amplificazione PCR. Purifica il DNA con il kit di purificazione Qiagen mini loop PCR.

Preriscaldare 15 microlitri di tampone EB a 50 gradi Celsius e diluire il DNA, diluire 0,5 microlitri del campione da uno a quattro ed eseguire una lettura NanoDrop per purificare i prodotti amplificati. Preparare un gel AGROS all'1,8% da 50 millilitri utilizzando acqua di grado HPLC, aggiungere TAE e bromuro dopo che l'agros si è sciolto. Quindi versare il gel, caricare il gel.

Dopo aver aggiunto quattro microlitri di tampone di caricamento ai campioni di input e IP, eseguire il gel a 120 volt per 45 minuti. Analizza il gel dopo averlo eseguito. Dovrebbe rivelare che vengono prodotti frammenti nell'intervallo tra 150 e 350 paia di basi.

Rappresentano frammenti di DNA genomico di lunghezza compresa tra 50 e 250 paia di basi. E un adattatore asporta la regione di gel contenente il materiale nell'intervallo da 150 a 350 coppie di basi con un bisturi. Fare attenzione a evitare di asportare la fascetta dell'adattatore dell'adattatore, che funziona a circa 120 coppie di basi.

Recupera il DNA utilizzando un kit di estrazione rapida del gel per kayak secondo le istruzioni del produttore. Asciugare il campione fino a 11 microlitri precisi in una velocità di ritorno senza calore. Rimuovere un microlitro del campione e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.

Infine, identificare i prodotti genici arricchiti utilizzando l'analizzatore di genoma Illumina e analizzare i siti di legame e i geni bersaglio come descritto nel protocollo scritto. Le coordinate genomiche della proteina legante RB arricchita identificata due o delle regioni leganti RBP due sono presentate in un formato cromosomico. Le occupazioni dei geni d'insieme nei cromosomi possono essere visualizzate come VAR neri.

Qui vengono mostrate le occupazioni del cromosoma 10 rbp, due regioni di legame sono mostrate come linee verticali. Il pannello centrale mostra tutte le regioni di legame di due isoforme rbp sul cromosoma 10 e il pannello inferiore mostra rbp due grandi regioni di legame di isoforma. Queste informazioni forniscono una panoramica della sovrapposizione e dell'occupazione specifica delle due isoforme RBP sul cromosoma 10.

Qui viene mostrata una mappa di calore con il tasso di false scoperte o l'ontologia genica significativamente arricchita corretta da FDR o le categorie di funzione molecolare go tra i geni legati da rbp. Due colori verso il rosso indicano un'elevata significatività statistica. Il giallo indica una bassa significatività statistica e il grigio indica nessuna significatività statistica.

L'analisi dell'arricchimento mostra la sovrapposizione e le funzioni molecolari specifiche dell'isoforma di due geni bersaglio di R BP. Ti abbiamo appena mostrato come identificare i siti di legame del fattore di trascrizione durante questa procedura. È importante produrre frammenti di DNA della gamma di dimensioni e resa appropriate.

Ciò può essere ottenuto seguendo le nostre linee guida durante la fase di SONICAZIONE. Quindi questo è tutto. Buona fortuna con i tuoi esperimenti e grazie per aver guardato.