Name: Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri l'analisi del genoma mediante ChIP-Seq per identificare i target genomici della demetilasi istonica KDM5A/RBP2. Questo metodo consente di studiare le interazioni proteina-DNA e la regolazione epigenetica.

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Questo lavoro è stato supportato da 115.347-RSG-08-271-01-GMC da ACS, e da CA138631 borsa di studio NIH.

Il protocollo è stato originariamente adattato da B. Ren, 2001. Esso rappresenta una leggera modifica del protocollo da parte Odom et al. 5 che sono disponibili all'indirizzo <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Pre-blocco e vincolante di anticorpi sfere magnetiche (deve essere eseguita la sera prima del punto successivo) <ol><li> Lavare 100 l di Dynabeads proteina G (per IP, si combinano per IP multipli) in 1 ml di fresca BSA / PBS soluzione (50 mg in 10 ml di BSA PBS-Questa soluzione durerà una settimana). </li><li> Raccogliere le perle utilizzando un supporto magnetico e ripetere la procedura di lavaggio altre due volte. </li><li> Successivamente, aggiungere 10 mg di anticorpo a 250 microlitri della sospensione sfere in PBS / BSA soluzione (per IP) e incubare una notte su una piattaforma rotante a 4 ° C. </li><li> Al termine, lavare le perle tre volte in 1 ml di PBS / BSA soluzione e quindi risospendere in 10 ml di PBS / BSA soluzione (per IP). </li></ol> 2. Cellula di cross-linking <ol><li> Per iniziare questa procedura, crescono di circa 10 8 cellule per immunoprecipitazione, o IP. Qui, diffusa istiocitica cellule U937 linfoma vengono utilizzati e indotto per la differenziazione monocitica con TPA per 96 ore. </li><li> In seguito la crescita cellulare, aggiungere soluzione di formaldeide direttamente sul supporto ad una concentrazione finale di 1%. Poi, agitare brevemente fiaschi e permettere loro di stare a temperatura ambiente per 10 minuti. Poi, aspirare i media e lavare le cellule con 15 ml di PBS ghiacciato. Ripetere questa lavare una volta. </li><li> Successivamente, aggiungere 6 ml di Lysis Buffer 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0.5% NP-40, 0,25% Triton X-100, contenente inibitori della proteasi) ad ogni dei flaconi sul ghiaccio. Poi, il rock i palloni per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Infine, raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare e trasferirli a 15 mL conica. A questo punto le cellule possono essere conservati a -80 ° C. </li></ol> 3. Cellula sonicazione <ol><li> Se le cellule sono state congelate, li disgelo fuori. Una volta scongelato, girare le celle in basso a 3.000 giri per 10 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Poi, risospendere le cellule in 6 ml di Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, contenenti inibitori della proteasi). Roccia delicatamente le provette a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Ripetere centrifugazione e risospendere le cellule in 2,5 ml di Lysis Buffer 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, deossicolato di sodio 0,1%, 0,5% N-lauroylsarcosine, contenenti inibitori della proteasi) . </li><li> Quindi, preparare la sospensione per sonicazione mettendo in un bicchiere di acqua ghiacciata con l'microtip di un 450 Branson Sonifier impostata tra il 50 e il 60% di ampiezza. </li><li> Sonicare la soluzione per 30 secondi una raffica costante e freddo in ghiaccio per 1 minuto. Ripetere questi impulsi 10 a 15 volte. Poi, pipetta il contenuto della provetta su e giù e trasferirli in una nuova provetta. Continuare a impulsi e raffreddare la soluzione di un ulteriore 5 volte. </li><li> A seguito di sonicazione, aggiungere il 10% Triton X-100 a 1 / 10 il volume della soluzione. Trasferire i lisati ai tubi da 1,5 ml per centrifuga, e spin i detriti in microcentrifuga. Poi trasferire il lisato cellulare in una nuova provetta. </li></ol> 4. Immunoprecipitazione della cromatina <ol><li> Prima di immunoprecipitazione della cromatina, o chip, risparmiare 50 ml di lisato cellulare come il campione di ingresso. Poi, unire il lisato cellulare cancellato con Dynabeads pre-legato all'anticorpo che sono stati precedentemente preparato come descritto sopra. Roccia il composto, oltre al campione di ingresso di 50 microlitri, a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare le perline con 1 ml di tampone di lavaggio (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1mM EDTA, sodio desossicolato 0,7%, 1% NP-40). Quindi, utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline e rimuovere il surnatante. Ripetere questa lavare 6 a 8 volte. </li><li> Eseguire un lavaggio finale con 1 ml TE-più-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Spin le perle in una microcentrifuga a 3.000 rpm per 2 minuti a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, aspirare ogni residuo di tampone TE. </li><li> Poi, aggiungere 100 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) per i campioni. Immediatamente dopo, incubare i campioni a 65 ° C per 10 a 15 minuti. Graffiare i tubi contro un rack tubo 1,5 ml ogni 2 minuti per mantenere le microsfere in sospensione. </li><li> Raccogliere le perline mediante centrifugazione e il supporto magnetico, e trasferire il surnatante in una provetta da PCR. Poi, recuperare il campione di input precedentemente salvato e aggiungere 3 volumi di tampone di eluizione. </li><li> Infine, posizionare i campioni di IP e di ingresso nel termociclatore notte a 65 ° Cinvertire la cross-legami. </li><li> Il giorno seguente, aggiungere 1 volume di tampone TE ai campioni. Quindi, aggiungere RNase A per una concentrazione finale di 0,2 mg / mL. Incubare i campioni nel termociclatore per 1 o 2 ore a 37 ° C. </li><li> Dopo l'incubazione, aggiungere proteinasi K alla concentrazione finale di 0,2 mg / mL. Poi, incubare campioni nel termociclatore a 55 ° C per 2 ore. </li><li> Successivamente, estrarre i campioni di una volta con un volume di fenolo. Estrarre i campioni per la seconda volta con un volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico. Infine, estrarre i campioni ancora una volta con un volume di cloroformio: alcool isoamilico. </li><li> Poi, aggiungere 30 mg di glicogeno per ogni campione. Inoltre, aggiungere NaCl ad una concentrazione finale di 0,2 volumi molari e due di etanolo ai campioni. Incubare per 30 minuti a -80 ° C. Dopo l'incubazione, spin i campioni e decantare il surnatante. Lavare il pellet con 500 ml di etanolo 75%. Poi, asciugare il pellet e li risospendere in 40 ml di acqua. </li><li> Per controllare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di sonicazione, carico 5 mg del campione in ingresso purificato in un gel di agarosio 1,8% ed eseguire il gel. La procedura di sonicazione dovrebbe produrre frammenti nel range di 150-350 paia di basi. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere regolata variando il numero di scoppi e l'ampiezza. </li><li> Per controllare la robustezza e la specificità di ChIP, l'arricchimento nelle regioni di controllo vincolanti eseguendo gene-specifico PCR con 1 ml di campioni IP e una serie di diluizioni del campione in ingresso. Due o tre "legato" le regioni e una regione controllo non associato devono essere selezionati in modo da testare la qualità dei campioni di IP e di ingresso. </li></ol> 5. Amplificazione del DNA genomico <ol><li> A partire con 34 ml di campione IP o 200 ng di campione di input, effettuare la riparazione fine, 'A' aggiunta la coda e la legatura di adattatori per frammenti di DNA utilizzando DNA genomico Sample Prep Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc., San Diego, CA). </li><li> Purificare il DNA con un MinElute PCR Purification Kit e poi eluire nel buffer EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) che è stato pre-riscaldato a 50 ° C. Ad esempio, utilizzare 23 microlitri e 46 microlitri per l'eluizione finale di IP e di campioni di DNA di ingresso, rispettivamente. </li><li> Fai la reazione di PCR utilizzando 23 ml di DNA con adattatori, e 25 microlitri DNA polimerasi Phusion dal kit, 1 ml di 20 mM Sol_PCR_1 e 1 ml di 20 mM Sol_PCR_2. Eseguire la reazione di PCR come segue: 1) 30 secondi a 98 ° C; 2) 10 secondi a 98 ° C; 3) 30 secondi a 65 ° C; 4) 30 secondi a 72 ° C, ripetendo i passaggi passo 2-4 18 volte e poi 5 minuti a 72 ° C, infine, tenendo a 4 ° C. </li><li> A seguito di amplificazione PCR, purificare il DNA con il kit di purificazione QIAGEN MinElute PCR. Preriscaldare 15 ml di tampone EB a 50 ° C ed eluire il DNA. Diluire 0,5 ml di campione 1:4 e di eseguire una lettura NanoDrop. </li></ol> 6. Purificazione gel di prodotti amplificati <ol><li> Per purificare i prodotti amplificati, preparare un gel di agarosio 1,8% di 50 ml utilizzando HPLC acqua. Aggiungi TAE e bromuro di etidio dopo l'agarosio si è sciolto. Poi, versare il gel. Caricare il gel dopo l'aggiunta di 4 ml di tampone di caricamento per l'ingresso e campioni IP. Quindi, eseguire il gel a 120 volt per 45 minuti. </li><li> Analizzare il gel dopo la sua esecuzione. Il gel dovrebbe rivelare che i frammenti della gamma sono prodotti tra 150 e 350 paia di basi. Essi rappresentano frammenti di DNA genomico tra 50 e 250 paia di basi di lunghezza e un adattatore. </li><li> Accise della regione di gel contenente il materiale nella 350 150 serie di coppie di basi con un bisturi. Fate attenzione a non asportare l'adattatore adattatore fascia, che corre a circa 120 paia di basi. Recuperare il DNA utilizzando un kit di Gel QIAquick estrazione secondo le istruzioni del produttore. In particolare, utilizzare una colonna del kit di estrazione Gel QIAquick per una fetta di gel di 400 mg o meno. Per iniziare il processo di estrazione, aggiungere 3 volumi di tampone QG di 1 volume di gel. Aggiungere 1 volume di isopropanolo e caricare il composto sulla colonna. L'uso 0,5 ml di QG per lavare la colonna, seguita da procedura standard descritta in kit manuale. Usare H 2 O pre-riscaldato a 50 ° C per eluire il DNA. Incubare la colonna con 30 ml di H 2 O per 5 minuti a 37 ° C prima della filatura verso il basso. </li><li> Secco il campione fino a 11 microlitri con precisione in un Speedvac senza calore. Togliere 1 ml di campione e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. </li><li> Infine, identificare i prodotti genici arricchito usando il AnalyzerIIe Illumina genoma come descritto in <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di identificare bersagli genomici di KDM5A/JARID1A/RBP2 demetilasi istoni. (P1) Questo risultato è ottenuto dalla preparazione di cross-linked cromatina che è sonicato per la produzione di frammenti di DNA di dimensioni adeguate. (P2) In una seconda fase, RBP2 frammenti di DNA legato RBP2 sono immunoprecipitati con anticorpi. (P3) Successivamente, i frammenti di DNA recuperato vengono riparati alle estremità e gli adattatori sono legatura alle estremità del DNA genomico per preparare librerie di DNA genomico per l'analisi sulle cellule del flusso nella stazione Cluster Illumina. Le librerie di DNA sono amplificati mediante PCR utilizzando basso numero di cicli. (P4), infine, illumina in sequenza breve legge sono unicamente allineati al genoma umano, picchi significativi sono identificati e annotati al più vicino geni in modo da identificare RBP2 regioni arricchito. (P5) i risultati sono ottenuti che mostrano le funzioni molecolari associati RBP2 geni bersaglio sulla base genoma identificazione di RBP2 regioni arricchito. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Verifica dei risultati di sonicazione cromatina Per controllare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di sonicazione, 5 mg (1 / 10) del campione in ingresso purificato è stato caricato su gel di agarosio 1,8%. Come previsto, la nostra procedura di sonicazione prodotta frammenti nel range di 150-350 bp. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere adeguato di conseguenza, variando il numero di scoppi e l'ampiezza. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Purificazione gel di prodotti amplificati. I prodotti della PCR vengono eseguiti su un gel per rimuovere gli adattatori e selezionare un intervallo di dimensioni di template per la piattaforma generazione cluster. Questo gel mostra che i frammenti nel range tra 150 e 350 paia di basi sono state prodotte. Essi rappresentano frammenti di DNA genomico tra 50 e 250 paia di basi di lunghezza e un adattatore. Noi accise della regione selezionata del gel con un bisturi. Si deve prestare attenzione per evitare l'adattatore adattatore fascia, che corre a circa 120 paia di basi. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Isoforma-specifici anticorpi isoforme permette di distinguere tra grandi e piccoli di RBP2. RBP2 struttura della proteina è presentata in vista del dominio. RBP2 contiene numerosi domini: il catalizzatore degli istoni demetilazione JmjC dominio e associati JmjN dominio, un dominio ARIDE capace di sequenza-specifico legame con il DNA, un dito di zinco C5HC2 che potenzialmente possono interagire con il DNA o di altre proteine, e più domini PHD. I due anti-RBP2 anticorpi che permettono di distinguere tra RBP2 isoforme sono stati ottenuti contro i RBP2 frammenti indicata da linee spesse. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Figura 5a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5a"> Figura 5 bis. Panoramica delle regioni RBP2 vincolante insieme dei cromosomi e geni Ensembl. Coordinate genomiche dei identificato arricchito RBP2 (tutte le isoforme e isoforma grandi) le regioni vincolanti sono presentati cromosoma saggio. Occupances di geni Ensembl (versione 54; hg18) nei cromosomi (cromosoma 10 in questa foto) si presentano come bande nere (pannello superiore). Ogni regione RBP2 legame è rappresentato come una linea verticale, in cui il pannello centrale mostra tutte le isoforme RBP2 regioni vincolante sul cromosoma 10, e il pannello inferiore mostra RBP2 regioni isoforma grandi vincolanti. La parte centrale e dei pannelli in basso danno panoramica di sovrapposizione e di occupazione specifico di RBP2 isoforme sul cromosoma 10. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Figura 5b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5b"> Figura 5b. Analisi di arricchimento funzionale di RBP2 geni bersaglio. Heatmap mostrando FDR corretto in modo significativo (p-value ≤ 0,05) arricchito GO categorie Funzione molecolare tra i geni legati (più vicini i geni per la regione RBP2 vincolante) da RBP2 (isoforme tutti e grande). Colori verso il rosso indicano alto significato statistico, giallo indica scarsa importanza statistica, e grigio indica alcuna rilevanza statistica. Analisi di arricchimento mostra le funzioni specifiche sovrapposizioni e isoforma molecolare di RBP2 geni bersaglio.

<ol><li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li>
<li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li>
<li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li>
<li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Differenze funzionali tra isoforme RBP2 non sono stati determinati. Abbiamo usato un approccio globale per identificare regioni genomiche vincolato da RBP2 isoforme e definire le categorie funzionali che queste regioni rappresentano. Ciò è stato realizzato da Chip-Seq analisi seguita da analisi bioinformatica di sequenze ottenute legge. RBP2 modifica metilato residui di lisina in code degli istoni. Abbiamo scoperto che RBP2 isoforma grande contenente il modulo di riconoscimento per metilata dell&#39;istone isoforma lisina e RBP2 piccoli privi di questo modulo si legano alle diverse regioni nel genoma umano (Figura 5A). Importante, isoforma-specifici e regioni sovrapposte appartengono a geni con diverse funzioni molecolare (Figura 5B). Ad esempio, &quot;cromatina vincolante&quot; e &quot;fattore di trascrizione vincolante&quot; funzioni possono essere attribuite agli obiettivi gene di RBP2 isoforma piccola ma non di RBP2 isoforma di grandi dimensioni (Figura 5B). Confrontando gene attuale set generati per tutte le isoforme e RBP2 isoforma di grandi dimensioni (dati non riportati), si può anche definire se l&#39;isoforma di grandi dimensioni è specificamente reclutato alcuni geni.

Sequenze oligonucleotidiche 2006 Illumina, Inc. Tutti i diritti riservati. <ul><li> Sol_PCR_1 Sequenza 5&#39;-GAT AAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT CCT CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Sequenza 5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

genoma analisi mediante chip per identificare isoform obiettivi specifici per gene

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Reclutamento di fattori trascrizionali ed epigenetici ai loro obiettivi è un passo fondamentale nella loro regolazione. Prominente nel reclutamento sono i domini di proteine ​​che si legano a specifiche modificazioni degli istoni. Un dominio tale è la omeodominio pianta (PHD), che si trova in diversi cromatina proteine ​​leganti. Il RBP2 fattore epigenetico è più domini PHD, tuttavia, essi hanno funzioni diverse (Figura 4). In particolare, il C-terminale del dominio PHD, che si trova in una fusione RBP2 oncogeno nella leucemia umana, si lega a trimetilato lisina 4 di H3 (H3K4me3) 1. La trascrizione corrispondente alla isoforma RBP2 contenente il C-terminale PHD accumula durante la differenziazione di promonocytic, linfoma di derivazione, U937 in monociti 2. Coerentemente con due serie di dati, genoma analisi ha mostrato che in cellule U937 differenziate, la proteina RBP2 viene localizzata alle regioni genomiche altamente arricchito per H3K4me3 3. Localizzazione di RBP2 ai suoi obiettivi è correlato con una diminuzione a causa di H3K4me3 RBP2 attività demetilasi istoniche e una diminuzione dell&#39;attività trascrizionale. Al contrario, gli altri due dottorati di RBP2 non sono in grado di legare H3K4me3. In particolare, il C-terminale del dominio PHD RBP2 è assente nel RBP2 piccoli isoforma 4. È ipotizzabile che l&#39;isoforma piccolo RBP2, a cui manca l&#39;interazione con H3K4me3, differisce dalla isoforma più grande in posizione genomica. La differenza di posizione genomica di RBP2 isoforme potrebbe spiegare le diversità osservate in RBP2 funzione. In particolare, RBP2 è un giocatore fondamentale nella differenziazione cellulare mediata dalla proteina retinoblastoma (pRB). Coerentemente con questi dati, precedenti analisi genome-wide, senza distinzione tra isoforme, identificati due gruppi distinti di RBP2 geni bersaglio: 1) i geni legati da RBP2 in un modo che è indipendente dalla differenziazione; 2) i geni legati da RBP2 in una differenziazione- modo dipendente. Per identificare le differenze nella localizzazione tra le isoforme abbiamo effettuato analisi genome-wide posizione di Chip-Seq. Utilizzando anticorpi che rilevano entrambe le isoforme RBP2 abbiamo localizzato tutti RBP2 obiettivi. Inoltre abbiamo gli anticorpi che si legano solo di grandi dimensioni, e non piccolo RBP2 isoforma (Figura 4). Dopo aver identificato gli obiettivi isoforma di grandi dimensioni, si può poi sottrarre da tutte le RBP2 obiettivi per rivelare gli obiettivi della isoforma di piccole dimensioni. Questi dati mostrano il contributo della cromatina interagenti dominio nel reclutamento di proteine ​​per la sua siti di legame nel genoma.

Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine ​​che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Il reclutamento di fattori trascrizionali ed epigenetici verso i propri target rappresenta un passaggio chiave della loro regolazione. Tra gli elementi che svolgono un ruolo prominente nel reclutamento figurano i...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le regioni genomiche bersaglio di KDM five a Jared one, una istone demetilasi RBB two. Questo viene ottenuto preparando cromatina cross-linkata che viene sonificata per produrre frammenti di DNA di dimensioni appropriate come secondo passaggio. I frammenti di DNA legati a RBB two vengono immunoprecipitati con anticorpi specifici per RBB two.Successivamente, il DNA genomico recuperato viene amplificato mediante PCR per il sequenziamento. Infine, le letture brevi ottenute con Illumina vengono allineate in modo univoco al genoma umano e i picchi significativi vengono identificati e annotati ai geni più vicini. Al fine di identificare rbbb due geni bersaglio, si ottengono risultati che mostrano funzioni molecolari associate ai geni bersaglio di Rrb B due, basati sull'identificazione su scala genomica delle regioni arricchite per Rbbb due.Ciao, sono Mike. Lei proviene dal laboratorio della dottoressa Elizabeth Bencia del Dipartimento di Biochimica e Genetica Molecolare dell'Università dell'Illinois a Chicago. E io sono ala dal laboratorio di Genomica Biomedica guidato dalla dottoressa NGA presso il Parco di Ricerca Biomedica BARCEL, Università PO P fea.E io sono Danielle Dal. E io sono William Richter. Entrambi facciamo anche parte del Benevolence Skill Lab.Oggi vi mostreremo un procedimento per l'immunoprecipitazione della cromatina e il sequenziamento. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il sito di legame del suo dermatologo. Quindi cominciamo.Per iniziare questa procedura, coltivare circa 10 alla ottava cellule. Per ogni immunoprecipitazione o ip. Qui, linfoma osteolitico diffuso.Si utilizzano cellule U 937 e si inducono alla differenziazione monocitica con TPA per 96 ore, successivamente alla crescita cellulare, aggiungendo direttamente alla media una soluzione di formaldeide fino a una concentrazione finale dell'1%. Quindi si agita brevemente il flacone e si lascia a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente si aspira la media e si risciacquano le cellule con 15 millilitri di PBS freddo sul ghiaccio. Ripetere questo lavaggio una volta.Successivamente, aggiungere sei millilitri di buffer di lisi uno a ciascun matraccio posto sul ghiaccio. Quindi agitare i matracci per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Infine, raccogliere le cellule utilizzando una spatola per cellule e trasferirle in provette coniche da 15 millilitri.A questo punto, le cellule possono essere conservate a meno 80 gradi Celsius. Se le cellule sono state congelate, scongelarle. Una volta scongelate, centrifugare le cellule e scartare il soprannatante.Quindi risospendere le cellule in sei millilitri di buffer di lisi due, agitare delicatamente i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti. Ripetere la centrifugazione e risospendere le cellule in 2,5 millilitri di buffer di lisi tre. Successivamente, preparare la sospensione per la sonificazione ponendola in un becher contenente acqua ghiacciata con la micropunta di un sonicator Branson 450 impostato tra il 50 e il 60% di ampiezza.Sonicare la soluzione per un'esplosione costante di 32 secondi e raffreddare in ghiaccio. Ripetere questi impulsi da 10 a 15 volte per un minuto, quindi aspirare e dispensare il contenuto del tubo su e giù e trasferirlo in un nuovo tubo. Continuare a inviare impulsi e raffreddare la soluzione.Un'ulteriore cinque volte dopo la sonificazione, aggiungere Triton X-100 al 10% a un decimo del volume della soluzione. Successivamente, trasferire i lisati in provette da centrifuga da 1,5 millilitro e rimuovere i detriti mediante centrifugazione in una microcentrifuga prima della cromatina, immunoprecipitazione o chip. Conservare 50 microlitri del lisato cellulare come campione di input.Quindi, combinare il lisato cellulare chiarificato con le perle Dyna legate all'anticorpo, preparate in precedenza come descritto nel protocollo scritto. Agitare la miscela insieme al campione di input di 50 microlitri a quattro gradi Celsius durante la notte. Lavare le perle con un millilitro di buffer di lavaggio.Quindi utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perle e rimuovere il soprannatante. Ripetere questo lavaggio da sei a otto volte. Eseguire un lavaggio finale con un millilitro di TE aggiunto di cloruro di sodio 50 millimolare.Centrifugare le perle in una microcentrifuga, quindi aspirare qualsiasi residuo di tampone TE. Aggiungere poi 100 microlitri di tampone di eluizione ai campioni. Immediatamente dopo.Incubare i campioni a 65 gradi Celsius per 10-15 minuti. Graffiare i tubi contro un supporto per tubi da 1,5 millilitri ogni due minuti per mantenere le perle in sospensione. Raccogliere le perle mediante centrifugazione e l'utilizzo del supporto magnetico e trasferire il SNAT in un tubo PCR.Quindi recuperare il campione iniziale precedentemente conservato e aggiungere tre volumi del buffer di eluizione. Infine, inserire i campioni di IP e del campione iniziale nel termociclatore per tutta la notte a 65 gradi Celsius. Per invertire i legami incrociati il giorno successivo, aggiungere un volume di buffer TE ai campioni.Quindi aggiungere l'RNA A a una concentrazione finale di 0,2 microgrammi per microlitro. Incubare i campioni nel termociclatore per uno o due ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere la proteinasi K a una concentrazione finale di 0,2 microgrammi per microlitro.Quindi incubare i campioni nel termociclatore a 55 gradi Celsius per due ore. Successivamente, estrarre i campioni una volta con un volume di fenolo. Estrarre i campioni una seconda volta con un volume di alcol fenil cloroformico isoamilico.Estrarre infine i campioni un'ultima volta con un volume di cloroformo alcol isoamilo. Aggiungere quindi 30 microgrammi di glicogeno a ciascun campione. Aggiungere inoltre cloruro di sodio fino a una concentrazione finale di 0,2 molare e due volumi di etanolo ai campioni.Incubare per 30 minuti a meno 80 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni e decantare il surnatante. Lavare i pellet con 500 microlitri di etanolo al 75%, quindi asciugare i pellet e risospendere in 40 microlitri di acqua.Per verificare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di SONICAZIONE, caricare cinque microgrammi del campione in ingresso purificato su un gel di agarosio all'1,8% ed eseguire l'elettroforesi. La procedura di sonicazione dovrebbe produrre frammenti compresi tra 150 e 350 paia di basi. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere ottimizzata variando il numero di impulsi e l'ampiezza prima dell'amplificazione del DNA genomico.Verificare le dimensioni, la concentrazione e l'arricchimento dei campioni come descritto nel protocollo scritto. Per iniziare l'amplificazione del DNA genomico, ottenere 34 microlitri del campione IP e 200 nanogrammi del campione di input. Eseguire e riparare l'aggiunta di una coda poli-A e la ligazione degli adattatori ai frammenti di DNA utilizzando un kit di preparazione del DNA genomico Illumina come descritto nel protocollo scritto.Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR mini colonna e quindi eluirlo nel buffer EB preriscaldato a 50 gradi Celsius. Utilizzare rispettivamente 23 microlitri e 46 microlitri per i campioni di DNA IP e di input. Preparare la reazione PCR utilizzando 23 microlitri di DNA con adattatori, 25 microlitri di fusione e la DNA polimerasi del kit.Un microlitro di PCR unico a 20 micromolare e un microlitro di PCR due a 20 micromolare. Eseguire la reazione di PCR come descritto nel protocollo scritto. Dopo l'amplificazione PCR, purificare il DNA con il kit di purificazione PCR Qiagen mini loop.Riscaldare in anticipo 15 microlitri di tampone EB a 50 gradi Celsius e diluire il DNA diluendo 0,5 microlitri del campione da uno a quattro ed effettuare una lettura con NanoDrop per purificare i prodotti amplificati. Preparare un gel all'1,8% di AGROS da 50 millilitri utilizzando acqua di grado HPLC, aggiungere TAE e bromuro dopo che l'AGROS si è fuso. Quindi versare il gel e caricare il gel.Dopo aver aggiunto quattro microlitri di buffer di caricamento ai campioni di input e IP, eseguire la corsa elettroforetica su gel a 120 volt per 45 minuti. Analizzare il gel al termine della corsa. I risultati dovrebbero mostrare che vengono prodotti frammenti con una dimensione compresa tra 150 e 350 paia di basi.Rappresentano frammenti di DNA genomico compresi tra 50 e 250 paia di basi in lunghezza. E con un bisturi asportare la regione del gel contenente il materiale nell'intervallo da 150 a 350 paia di basi. Prestare attenzione a evitare l'asportazione della banda dell'adattatore, che migra a circa 120 paia di basi.Recuperare il DNA utilizzando un kit di estrazione rapida da gel kayak seguendo le istruzioni del produttore. Essiccare il campione fino a un volume preciso di 11 microlitri in uno speed back senza riscaldamento. Prelevare un microlitro del campione e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.Infine, identificare i prodotti genici arricchiti utilizzando l'analizzatore genomica Illumina e analizzare i siti di legame e i geni bersaglio come descritto nel protocollo scritto. Le coordinate genomiche delle regioni di legame delle proteine leganti l'RNA, arricchite, identificate come RB binding protein two o RBP two, sono presentate in un formato suddiviso per cromosoma. Le occupazioni dei geni ensemble nei cromosomi possono essere visualizzate come VAR neri.Qui sono mostrate le occupazioni del cromosoma 10; due regioni di legame dell'RBP due sono indicate come linee verticali. Il pannello centrale mostra tutte le regioni di legame delle isoforme dell'RBP due sul cromosoma 10, mentre il pannello inferiore mostra le regioni di legame dell'isoforma grande dell'RBP due. Queste informazioni forniscono una panoramica delle occupazioni sovrapposte e specifiche delle isoforme dell'RBP due sul cromosoma 10.Qui è mostrata una mappa termica con le categorie di funzione molecolare dell'ontologia genica (GO) significativamente arricchite, corrette per il tasso di falsa scoperta (FDR), tra i geni legati da rbp. Due tonalità tendenti al rosso indicano un'elevata significatività statistica. Il giallo indica una bassa significatività statistica, mentre il grigio indica l'assenza di significatività statistica.L'analisi di arricchimento mostra le funzioni molecolari sovrapposte e specifiche delle isoforme dei geni bersaglio di R BP due. Abbiamo appena mostrato come identificare i siti di legame dei fattori di trascrizione durante questa procedura. È importante produrre frammenti di DNA nell'intervallo di dimensioni appropriato e con resa adeguata.Questo può essere ottenuto seguendo le nostre linee guida durante il passaggio di SONICAZIONE. Ecco fatto. Buona fortuna con i vostri esperimenti e grazie per averci seguito.

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A Novel bayesiano Cambia punto di Algoritmo per Genome-wide analisi di diversi tipi di dati ChIPseq

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