Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Merhaba, ben Universal of Rochester'daki AL yardım laboratuvarında JA doktora sonrası araştırma görevlisiyim. Tek hücre çözünürlüğünde aynı anda iki MRN transkriptini tespit etmek için size taze donmuş beyin bölümlerinde Process Institute hibrit sindirimini göstereceğiz. Bu yöntem, bir tablet beyin devresinin anatomik, işlevsel, moleküler ve nörokimyasal organizasyonu ile ilgili uygulamalar gibi sinirbilim alanında sorular sormanıza yardımcı olabilir.

Bu yöntem, AV beyninin nöronlarındaki gen pıhtılaşması hakkında bilgi sağlayabilir. Kemirgenler gibi diğer sistemlere ve çeşitli nöral dokulara da uygulanabilir. Bu işleme başlamak için, yeterli miktarda SDX G 50 tozunu RNA'larla su ile nemlendirin.

Çözeltiyi kısa bir süre karıştırın ve oda sıcaklığını iki ila beş dakika saklayın. Bu adım, SDX boncuklarını, Sedex G 50 çökelmesini takiben ticari sedex tozunda bulunan dekstrozdan ayırır. Senneti çıkarın ve işlemi üç ila beş kez tekrarlayın, son yıkamadan sonra SX G 50 çözeltisini TE tamponunda bire bir tampon / boncuk hacmi oranında askıya alın ve kullanıma kadar dört santigrat derecede saklayın.

Ardından, sütunları hazırlayın. Otoklav cam yününü steril bir mililitrelik şırıngaya yerleştirin ve altta kompakt bir tabaka oluşturmak için pistonla sıkıştırın. Ardından şırıngayı 15 mililitrelik bir şahin tüpüne yerleştirin.

C 0 6 5 0 sabit açılı rotor ile donatılmış bir Beckman santrifüjü kullanarak 30 saniye boyunca dakikada 1000 devirde santrifüjleme ile kolonları Sedex G 50 çözeltisi ile doldurun. Santrifüjlemeden sonra. Her bir sütunu 200 mikrolitre sütun yıkama tamponu uygulayarak ve dakikada 1000 devirde iki dakika santrifüjleyerek yıkayın.

Daha önce olduğu gibi. Son olarak, her sütuna 200 mikrolitre sütun engelleme tamponu uygulayın ve dakikada 1000 dönüşte iki dakika döndürün. Sütunu dengelemek için bu adımı dört ila beş kez yineleyin.

Hazırlanan kolonları, RIBA probu etiketlenene ve C'de çift floresan için saflaştırmaya hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın burada gösterilen iki hibridizasyon veya D FISH prosedürü, biri doksijen girişi veya DIG sigortalı ve diğeri biyotin ile etiketlenmiş iki RNA probu hazırlanır. Ribo prob etiketleme çözeltilerini hazırlayarak ve etiketleme reaksiyonlarını iki saat boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe ederek probları etiketlemeye başlayın. İki saatlik inkübasyonun sonunda, her etiketleme reaksiyonuna mikrolitre TRNA başına bir mikrolitre 20 mikrogram ve 39 mikrolitre kolon bloke edici tampon ekleyin.

Ardından, her bir kolona 50 mikrolitre blokaj tamponu ekleyerek ve dakikada 2000 dönüşte üç dakika döndürerek EDEX G 50 kolonlarını prob saflaştırması için hazırlayın. Sütunları dengelemek için bu adımı iki ila üç kez yineleyin. Sütunlar hazır olduğunda, sütunun altına yeni bir EEND orph tüpü yerleştirin.

Prob çözeltisini Sedex G 50 kolonuna uygulayın ve dakikada 2000 dönüşte üç dakika döndürün. Saflaştırılmış 50 mikrolitre Ribo prob solüsyonunu elde etmek için, etiketlenmiş ve saflaştırılmış ribo probunun kalitesini ve verimini değerlendirin. Bir kriyostat kullanarak hibridizasyona geçmeden önce, iki veya üç beyin bölümünü charge super frost plus slaytları üzerine toplayın.

Bölümün kalınlığı 10 ila 12 mikron olmalıdır. Slaytlar kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Bölümleri soğuk, taze yapılmış% 3 para formaldehit çözeltisinde beş dakika inkübe edin.

Ardından bölümleri PBS'de iki kez kısaca durulayın. Daha sonra, bölümleri her bir çözeltide iki dakika boyunca 70, 95 ve% 100 etanol çözeltilerinden oluşan standart bir alkol serisinden kurutun. Bölümleri kuruttuktan sonra, taze hazırlanmış asetilasyon çözeltisinde 10 dakika inkübe edin.

Ardından, asetilasyonu takiben bölümleri iki kez üç kez durulayın, SSPE dehidrat bölümleri, az önce gösterildiği gibi standart alkol serisinden bir kez daha geçirin. Şimdi ribo probu ile hibridizasyona başlayın. Dokuya yeterli miktarda hibridizasyon solüsyonu uygulayın, slaytları kapak fişleri ile örtün ve slaytları metal bir slayt tutucuya yerleştirin.

Tutucuyu gece boyunca 65 santigrat dereceye ayarlanmış bir mineral yağ banyosuna daldırın. Ertesi gün. Sürgü tutucuyu mineral yağ banyosundan dikkatlice çıkarın ve slaytlardaki fazla yağı çıkarmak için kloroformda kısa bir süre durulayın.

Kapak kızağını çıkarmak için slaytları beş ila 10 dakika boyunca iki kez SSPE solüsyonuna yerleştirin. Kapak fişini çıkardıktan sonra, slaytları iki kez yeni SSPE çözeltisine aktarın ve bu inkübasyon adımının başında oda sıcaklığında bir saat bekletin, iki kez SSPE artı %50 form yardımcısı, hibridizasyonda olduğu gibi aynı sıcaklığa yardımcı olur. Bir saatlik inkübasyonun sonunda adım atın.

Slaytları maide çözeltisi için iki kez SSPE'ye savaş öncesi aktarın ve 1,5 saat inkübe edin. Bu inkübasyon adımının başlangıcında, 0.1 kat SSPE'lik bir çözeltiyi, hibridizasyon adımındaki ile aynı sıcaklığa önceden ısıtın. Slaytları PREWARM 0.1 kez SSPE çözeltisine aktararak hibridizasyon sonrası yıkamaları bitirin ve 30 dakika inkübe edin.

Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın. Beyin bölümleri artık TNT tamponuna% 0.3 hidrojen peroksit içeren hibritleştirilmiş ribo problarının tespiti ve görselleştirilmesi için hazırdır ve slaytları bu çözelti içinde 10 dakika inkübe eder. Ardından, slaytları bir dekor kalemi kullanarak her seferinde 10 dakika boyunca TNT tamponunda üç kez yıkayın.

Beyin bölümlerini içeren alanın etrafına bir kuyu çizin. Her slayta 150 mikrolitre TNB tamponu uygulayın ve bu çözeltideki bölümleri 30 dakika inkübe edin. Bu adım sırasında bölümlerin kurumadığından emin olun.

Daha sonra, peroksidaz konjuge anti DIG antikoru içeren 150 mikrolitre TT NB çözeltisi uygulayın ve slaytları iki saat boyunca nemli bir odada saklayın. İki saatlik inkübasyonun sonunda, bölümleri TNT tamponunda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Her slayta her seferinde 150 mikrolitre Alexa 5 9 4 konjuge T IDE çalışma solüsyonu uygulayın ve slaytları nemli bir odada bir saat saklayın.

Bir saatin sonunda, bölümleri TNT tamponunda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Her seferinde bölümleri TNT tampon çözeltisinde% 0.3 hidrojen peroksit içinde 10 ila 30 dakika inkübe edin. Hidrojen peroksit çözeltisindeki kuluçka süresi, mRNA bolluğuna bağlıdır ve D balığından önce test edilmelidir.

Ardından, TNT tamponundaki bölümlerin her seferinde 10 dakika boyunca üç kez olmasını isteyin. Slayt başına 150 mikrolitre TMB tamponu uygulayın ve slaytları 30 dakika nemli bir odada tutun. Slaytları eğerek fazla TMB solüsyonunu çıkarın.

Peroksidaz konjuge anin antikoru içeren 150 mikrolitre TMB çözeltisi ekleyin ve slaytları iki saat nemli bir odada saklayın. Daha sonra bölümleri TNT tamponunda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Her seferinde slaytlara bir Alexa 4 88 konjuge akar çalışma solüsyonunun 150 mikrofon sürümünü uygulayın ve bölümleri bir saat boyunca inkübe edin.

Daha sonra bölümleri TNT tamponunda her seferinde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Artık her iki ribo probu da antikorlarla etiketlendiğine göre, bölümleri 150 mikrolitre konak çözeltisinde iki dakika inkübe edin. Daha sonra bölümleri TNT tamponunda her seferinde beş dakika boyunca üç kez yıkayın, bölümlere vektör kalkanı veya uzun süreli antifa gibi floresan uyumlu bir montaj ortamı ekleyin, bir kapak kayması ile kapatın ve floresan mikroskop altında gözlemleyin.

Bu temsili fotoğraf mikrografları, zebra ispinozu beyin bölümleriyle, özellikle de memeli işitsel korteksinin ötücü kuş analogu olan NCM bölgesinden bir D balık deneyinden alınmıştır. Beyin bölümleri, par albümine karşı yönlendirilmiş bir biyotinile ribo probu, inhibitör nöronların bir alt popülasyonu için bir belirteç ve aktiviteye bağlı gen çinkoya karşı yönlendirilmiş DIG etiketli bir ribo probu olan iki prob ile hibritlendi. İki görüntünün üst üste binmesi, işitsel deneyimle aktive edilen inhibitör nöronların bir hücre popülasyonunu gösterir.

Ok ucu, yalnızca par için ribo probu ile etiketlenmiş hücreleri gösterir. Albümin okları, çinko temsilcisi nöronlar için yalnızca RIBA probu ile etiketlenmiş hücreleri gösterir Coex, her iki ilgi transkriptini de ifade eder, yıldız işareti ile işaretlenir. Bu prosedürü denerken, tezgahınızı temiz tutmayı ve kanıtsız solüsyonlar, plastikler ve cam eşyalar kullanmayı unutmamanız önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, beyindeki gen ko-regülasyonunu incelemek için taze donmuş beyin bölümlerinde tek bir hücre çözünürlüğü olan iki MA türünü aynı anda nasıl tespit edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz. Deneylerinizde iyi şanslar.