Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti
30 agosto 2010
Dimostriamo iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti. Usiamo una microsiringa da 10 microlitri NanoFil controllato da un controller Micro4 e UltraMicroPump III. Questa dimostrazione include l'uso di acqua fredda come anestetico.
L'obiettivo generale di questa procedura è iniettare una soluzione nella cavità peritoneale del pesce zebra adulto. In questo esempio, inietteremo glucosio nel nostro laboratorio. Utilizziamo questa procedura per studiare la stasi del glucosio nel sangue.
Questo viene effettuato pesando innanzitutto il pesce per determinare la quantità di soluzione da iniettare per grammo di peso corporeo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'anestetizzare il pesce con acqua fredda. Il terzo passaggio prevede il trasferimento del pesce sul palchetto del microscopio e l'esecuzione dell'iniezione.
L'ultimo passaggio della procedura consiste nel restituire il pesce al suo contenitore per il recupero. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano modifiche nell'omeostasi del glucosio attraverso la misurazione dei livelli ematici di glucosio. Ciao, sono Mary Kinkle del laboratorio di Victoria Prince del Dipartimento di Biologia e Anatomia degli Organismi presso l'Università di Chicago.
Sono Stephanie Ames, anch'io del laboratorio di Prince. Oggi vi mostreremo un procedimento per iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la regolazione dell'omeostasi del glucosio ematico.
Iniziamo. Per preparare i pesci per l'iniezione, trasferire innanzitutto i pesci in un acquario pulito e sospendere l'alimentazione. Privare i pesci del cibo per 24 ore per svuotare il contenuto della vescica intestinale e per 72 ore per ridurre il glucosio ematico ai livelli di base.
La densità utilizzata in questo protocollo è di 10-12 pesci di sesso misto per serbatoio da nove litri con tre strati di biglie; le biglie intrappolano le uova impedendo che vengano mangiate. Rimuovere giornalmente le uova e i rifiuti sifonando il serbatoio.
Successivamente, preparare la soluzione salina di Cortland utilizzando cloruro di sodio 124,1 millimolare, cloruro di potassio 5,1 millimolare, pirofosfato di sodio 2,9 millimolare, solfato di magnesio eptaidrato 1,9 millimolare, cloruro di calcio diidrato 1,4 millimolare, bicarbonato di sodio 11,9 millimolare, quattro grammi di polivinilpirrolidone e 1000 unità USP di eparina, portando a un volume finale di 100 millilitri con acqua deionizzata; filtrare, sterilizzare e conservare a quattro gradi Celsius. Successivamente, sciogliere cinque grammi di glucosio in 10 millilitri di soluzione salina di Cortland. Per ottenere una soluzione di glucosio 0,5 milligrammi per microlitro, filtrare, sterilizzare e conservare a quattro gradi Celsius.
Quindi preparare il tavolo operatorio tagliando una spugna morbida a un'altezza di circa 20 millimetri sulla faccia piana. Praticare un taglio profondo da 10 a 15 millimetri per fissare il pesce durante l'iniezione. Posizionare la spugna in una piastra di Petri da 60 millimetri e collocare la piastra con la spugna nel coperchio di un contenitore per puntali di pipetta P 200.
Successivamente, preparare il microscopio coprendo la base con pellicola trasparente e tovaglioli di carta per proteggerla. In caso di versamenti, posizionare il tavolo operatorio sopra i tovaglioli di carta. Regolare preventivamente il fuoco osservando il tavolo operatorio e mettendo a fuoco la spugna.
Metti il dito sopra la spugna e concentrati su di essa per ridurre al minimo ulteriori aggiustamenti del fuoco quando il pesce si trova sul tavolo operatorio. Pesa il pesce riempiendo un becher da 500 millilitri per circa un terzo con acqua proveniente dall'allevamento dei pesci e lacrima. Su una bilancia, trasferisci delicatamente il pesce con il minor quantitativo possibile di acqua in eccesso nel becher, registra il peso e trasferisci ogni pesce pesato in un contenitore trasparente etichettato.
Calcolare il volume da iniettare in base al peso. In questo esempio, verrà iniettata una soluzione di 0,5 milligrammi per grammo di peso corporeo di glucosio disciolto in soluzione salina Cortland. Poiché la nostra soluzione ha una concentrazione di 0,5 milligrammi per microlitro, il calcolo è: un multiplo del peso del pesce espresso in grammi corrisponde al volume da iniettare in microlitri. Preparare quindi la siringa e le attrezzature necessarie per l'iniezione.
Questo protocollo utilizza un ago in acciaio bevel 30G, una pompa ultra micro e un microprocessore a quattro canali e una siringa micro nano fill da 10 microlitri per l'iniezione di glucosio; riempire la siringa con glucosio a 0,5 milligrammi per microlitro disciolto in soluzione salina Cortland. È importante rimuovere tutte le bolle d'aria dalla siringa, montare la siringa sulla pompa ultra micro e programmare il volume di iniezione per il primo pesce inserendo il volume in nanolitri, utilizzando il tastierino numerico sul microprocessore a quattro canali. Infine, preparare l'anestetico a base di ghiaccio frantumando cubetti di ghiaccio sufficienti ottenuti con acqua del sistema acquario.
Per riempire un secchio del ghiaccio, posizionare il tavolo chirurgico all'interno di un contenitore più grande, ad esempio un contenitore per alimenti in gomma da 2,4 litri. Versare dell'acqua calda dell'impianto nel contenitore esterno e sul tavolo chirurgico. Tenere a portata di mano un serbatoio di riserva con acqua calda dell'impianto.
Collegare un termometro al contenitore esterno. Posizionare il contenitore esterno dell'anestetico insieme al tavolo operatorio vicino al microscopio. Tenere vicino un secchio pieno di ghiaccio tritato.
Iniziare ad aggiungere cubetti di ghiaccio fino a quando la temperatura dell'acqua raggiunge 17 gradi Celsius. Non scendere al di sotto di 17 gradi Celsius in questo passaggio. Utilizzare una rete per trasferire il pesce nel contenitore esterno.
A 17 gradi o leggermente inferiori, il pesce di solito spiegherà le pinne pettorali in orizzontale, avrà affanno e movimenti auricolari rapidi. Aggiungere lentamente cubetti di ghiaccio al contenitore per abbassare la temperatura fino a 12 gradi Celsius nell'arco di diversi minuti. Con la diminuzione della temperatura, il pesce nuoterà sempre più lentamente e alla fine smetterà di nuotare.
Alla fine l'agitazione cesserà e i movimenti auricolari rallenteranno. Il pesce è pronto per l'iniezione quando non reagisce al contatto. Quando si raggiunge la temperatura richiesta, premere sulla spugna per saturarla.
Mantenga le dita nell'acqua fredda abbastanza a lungo da non riscaldare il pesce e farlo uscire dall'anestesia. Durante la manipolazione con dita fredde, trasferisca delicatamente il pesce nella scanalatura della spugna. Posizioni il pesce con l'addome verso l'alto e le branchie nella scanalatura.
Trasferire rapidamente il tavolo chirurgico sulla piastra del microscopio. Lavorando rapidamente, posizionare con attenzione l'ago in modo che la punta sia orientata in direzione craniale ed sia più vicina alla cintura pelvica che all'ano. Inserire l'ago lungo la linea mediana tra le pinne pelviche.
Dovresti essere in grado di percepire quando l'ago si trova al di sotto della parete corporea. Inserendo l'ago, puoi sentire la cessione della parete corporea. Quando l'ago entra nella cavità addominale, inietta il volume appropriato utilizzando il micro per processore.
Utilizzare il pedale per iniettare un microlitro per grammo di peso corporeo del pesce; dopo l'iniezione, rimuovere l'ago e trasferire immediatamente il pesce nel suo serbatoio di acqua calda per il recupero. Rilasciando il pesce dalla spugna sopra l'acqua del serbatoio, controllare l'ago al microscopio. Di tanto in tanto, una squama potrebbe rimanere attaccata e dovrebbe essere rimossa prima della successiva iniezione.
Dopo un periodo di tempo adeguato, procedere con il saggio successivo. Abbiamo riscontrato che è necessario un digiuno di 72 ore per ridurre il glucosio ematico a un livello di base prima dell'iniezione. In questo grafico, i dati del controllo non iniettato, mostrati in verde, mostrano valori di glucosio ematico non significativamente diversi dai controlli iniettati con il veicolo, mostrati qui in rosso.
Tuttavia, la linea blu mostra i valori di glucosio ematico nei pesci a cui è stato iniettato glucosio, evidenziando l'aumento e la diminuzione del glucosio circolante. Nel tempo, sia gli animali a cui è stato iniettato glucosio sia quelli a cui è stato iniettato il veicolo erano sotto anestesia chirurgica durante la procedura di iniezione, mentre i controlli non iniettati non erano sotto anestesia chirurgica. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un'iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti.
Nel nostro laboratorio, studiamo le variazioni della concentrazione di glucosio nel sangue in diversi punti temporali successivi all'iniezione IP di una soluzione di glucosio. Tuttavia, questa tecnica che vi abbiamo appena mostrato può essere utilizzata per iniettare la soluzione di vostro interesse. Quando eseguite questa procedura, ricordate di anestetizzare lentamente il pesce e di manipolarlo con delicatezza.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
In questo articolo viene illustrata la procedura per iniezioni intraperitoneali in zebrafish adulti, utilizzando una microssiringa NanoFil e anestesia con acqua fredda. Il metodo è finalizzato allo studio dell'omeostasi del glucosio ematico mediante iniezioni precise.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Fisiologia
Sfondo
- Le iniezioni intraperitoneali sono essenziali per somministrare sostanze direttamente nella cavità peritoneale.
- Il pesce zebra è un organismo modello di grande valore per lo studio dei processi metabolici.
- Comprendere la regolazione del glucosio nel sangue è fondamentale per ottenere informazioni sui disturbi metabolici.
- L'uso dell'anestesia è necessario per ridurre al minimo lo stress durante la procedura.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per iniezioni intraperitoneali nel pesce zebra.
- Facilitare la ricerca sull'omeostasi del glucosio e sulla sua regolazione.
- Fornire un protocollo che possa essere replicato in altri laboratori.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dei pesci mediante digiuno e pesatura per determinare il volume di iniezione.
- Anestesia dei pesci mediante acqua fredda per garantire un movimento minimo durante l'iniezione.
- Iniezione di una soluzione di glucosio nella cavità peritoneale utilizzando una microssiringa precisa.
- Monitoraggio del recupero dei pesci dopo l'iniezione per valutare l'impatto della procedura.
Risultati principali
- La procedura consente con successo l'iniezione di sostanze in zebrafish adulti.
- I livelli di glucosio nel sangue possono essere misurati dopo l'iniezione per studiare i cambiamenti metabolici.
- I pesci si riprendono bene dopo la procedura, indicando l'efficacia dell'anestesia utilizzata.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione dell'omeostasi del glucosio nello zebrafish.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano i processi metabolici nel pesce zebra.
- L'iniezione intraperitoneale è una tecnica fattibile ed efficace per somministrare soluzioni.
- Studi futuri possono basarsi su questo protocollo per esplorare diverse condizioni metaboliche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La somministrazione precisa di composti nel pesce zebra consente una riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli metabolici stabilendo relazioni dose-risposta in un sistema vertebrale. Questo approccio supporta la validazione del bersaglio attraverso una perturbazione controllata dell'omeostasi del glucosio, riducendo l'ambiguità nell'analisi del percorso metabolico. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta fornendo letture fenotipiche quantitative e riproducibili rilevanti per la modellizzazione delle malattie metaboliche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche somministrando dosi definite per valutare l'interazione con i bersagli nelle vie di regolazione del glucosio.
- Valore operativo: Fornisce un'amministrazione riproducibile del composto per ridurre al minimo la variabilità nella valutazione del fenotipo metabolico.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la misurazione diretta delle variazioni della glicemia come lettura funzionale della modulazione del bersaglio metabolico.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (livelli di glucosio nel sangue) che consentono l'analisi dose-risposta per l'identificazione di composti promettenti.
- Valore operativo: Standardizza il volume di iniezione in base al peso del pesce, migliorando la riproducibilità del saggio tra diversi lotti sperimentali.
- Valore scientifico: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per flussi di lavoro di screening metabolico successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea ai sistemi rilevanti per le malattie modellando il disturbo dell'omeostasi del glucosio, pertinente alla fisiopatologia del diabete.
- Valore operativo: Garantisce coerenza procedurale attraverso protocolli standardizzati di digiuno, anestesia e iniezione, favorendo la riproducibilità tra diversi laboratori.
- Valore scientifico: Permette una valutazione meccanicistica del rischio riducendo al minimo le interferenze, isolando l'effetto dei composti iniettati dall'aumento di glucosio indotto dallo stress mediante controlli con veicolo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio fino all'ottimizzazione del composto leader, fornendo una via affidabile per la somministrazione di composti nei saggi metabolici su zebrafish.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi di regolazione del glucosio consentendo un rilascio preciso di composti a zebrafish adulti.
- Screening: Garantisce la prontezza per i saggi mediante volumi di iniezione standardizzati in base al peso, assicurando un'esposizione costante ai composti.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative della glicemia che permettono il confronto delle risposte metaboliche tra diversi gruppi di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'uso di un modello vertebrato con meccanismi conservati di omeostasi del glucosio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per lo screening del fenotipo metabolico su diverse serie di composti e classi di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'analisi dei percorsi metabolici.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione attraverso volumi di iniezione definiti e procedure anestesiologiche controllate.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati chiari sulla risposta dose-effetto nella modulazione dell'omeostasi del glucosio.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base agli effetti metabolici validati in un sistema a organismo intero, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione dei zebrafish, nell'anestesia e nelle tecniche di iniezione con microsiringa.
- Dipende dall'accesso a pompe ultra-micro, siringhe NanoFil e sistemi di anestesia con controllo della temperatura.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la durata del digiuno, la misurazione del peso e il calcolo del volume di iniezione.
- Comporta considerazioni relative all'adattamento in base alla solubilità dei diversi composti e ai volumi di iniezione nel veicolo a base di soluzione salina Cortland.
- È limitato dall'abilità tecnica richiesta per mantenere l'aerazione delle branchie ed evitare traumi nel sito di iniezione durante l'esecuzione della procedura.
