Name: Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Impara l'iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti utilizzando anestesia con acqua fredda e microsiringa NanoFil. Questo metodo consente di studiare l'omeostasi della glicemia in Danio rerio con precisione.

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Questo studio è stato supportato da Juvenile Diabetes Research Foundation concedere 5-2007-97 (a PEV), dall&#39;Istituto Nazionale del Diabete e digestive e Malattie Renali concede R01DK064973 (a PEV), R01DK48494 (a LHP), T32DK07074 (supporto SCE), K01DK083552 (a MDK), e da P60DK20595 per L&#39;Università di Chicago Ricerca Diabete e Training Center. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIDDK o il NIH.

1. Preparativi pre-iniezione <ol><li> Veloce il pesce per almeno 24 ore prima dell'iniezione. Questo svuotare il bulbo intestinale (stomaco) contenuti. Il protocollo digiuno di base è quello di trasferire il pesce, a loro densità normale, ad un serbatoio pulito, poi trattenere il cibo. Per lungo periodo di digiuno che richiede condizioni più rigorose (ad esempio, per gli studi di glucosio nel sangue), vedi considerazioni aggiuntive alla discussione. </li><li> Preparare la soluzione salina Cortland (Perry et al., 1984). Per un volume di 100 mL, sciogliere le seguenti in acqua distillata: 725 mg NaCl (124,1 mM) KCl 38 mg (5,1 mm) 41 mg di Na 2 HPO 4 (2,9 mm) 24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 mM) 16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mm) 100 mg di NaHCO 3 (11,9 mm) 4 g Polivinilpirrolidone (PVP) (4%) 1.000 unità di eparina USP Filtro, sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare il microscopio. <ul><li> Coprire la base del microscopio con pellicola trasparente per la protezione in caso di fuoriuscita. </li><li> Mettete un tovagliolo di carta sulla parte superiore della pellicola trasparente. Il tavolo operatorio siederà sulla parte superiore del tovagliolo di carta. </li><li> Pre-la messa a fuoco visualizzando il tavolo operatorio e concentrandosi sulla spugna. </li></ul> Suggerimento: Metti il ​​tuo dito sopra la spugna e concentrarsi su quello. In questo modo eliminare o ridurre ulteriormente la regolazione focale una volta che il pesce è sul tavolo operatorio. </li><li> Pesare il pesce. <ul><li> Riempire un bicchiere da 500 ml circa 1 / pieno con pesci d'acqua impianto di 3. </li><li> Tarare la bilancia. </li><li> Raccogliere il pesce con una rete. Wick l'acqua in eccesso lontano dalla rete e il pesce con una breve tamponando la rete su carta assorbente. Trasferire il pesce nel becher. </li><li> Pesare il pesce. </li><li> Trasferire il pesce in una vasca pulita. </li><li> Trasferimento ogni pesce pesato proprio serbatoio etichettati. </li><li> Calcolare il volume di iniezione per ogni pesce in base al peso del pesce. </li></ul></li><li> Preparare la siringa d'iniezione e delle attrezzature connesse. Per l'iniezione, si consiglia una 35G ago smussato in acciaio e una microsiringa da 10 microlitri NanoFil. Preparare la siringa e il tubo NanoFil silflex seguendo le istruzioni del produttore. E 'importante rimuovere eventuali bolle dalla siringa e tubo. Dopo aver riempito la siringa e il tubo, montare la siringa sulla pompa, e programmare il volume di iniezione per il primo pesce. </li><li> Preparare il tavolo operatorio. <ul><li> Tagliare una spugna morbida (ad esempio # L800-D, Jaece Industrie) in modo che sia di circa 20 mm di altezza. Sulla superficie piatta, fare un taglio che è di 10-15 mm di profondità. Questo taglio è il tramite che conterrà il pesce per l'iniezione. </li><li> Impostare la spugna in un piatto 60 millimetri Petri. </li><li> Impostare la piastra Petri con spugna in una di dimensioni adeguate e coperchio della scatola punta della pipetta. Il coperchio deve essere abbastanza grande da contenere acqua per aiutare a mantenere la temperatura di spugna, ma dovrebbe essere sufficiente per ottenere superficiale non nel modo. Noi usiamo un coperchio di una scatola P200 punta che è di 11,4 cm L x 7,7 cm L x 1,5 cm D. </li></ul> Questi tre elementi assemblati (spugna in Petri a coperchio della scatola) costituiscono il tavolo operatorio. </li><li> Preparare l'anestetico. <ul><li> Fai utilizzando cubetti di ghiaccio tritato a base di pesci d'acqua impianto. </li></ul> Suggerimento: l'utilizzo dei cassetti tipico cubetto di ghiaccio, ci vorranno 3 vassoi per anestetizzare 10-12 pesci. <ul><li> Riempire un secchio pulito ghiaccio con il ghiaccio tritato. </li><li> Mettere il tavolo operatorio in un contenitore più grande, come un contenitore di 2,4 litro di stoccaggio degli alimenti Rubbermaid. </li><li> Versare un pò d'acqua impianto (calda) nel contenitore esterno e il tavolo operatorio. Mantenere una riserva di acqua calda impianto nelle vicinanze. </li><li> Metti un termometro nel contenitore esterno. </li></ul></li></ol> 2. Anestesia, iniezione e di recupero <ol><li> Posizionare il contenitore esterno e anestetico tavolo operatorio adiacente al microscopio. Hanno il secchio di cubetti di ghiaccio vicine. </li><li> Portare la temperatura dell'acqua fino a 17 ° C con l'aggiunta di pezzetti di ghiaccio. Importante: non scendere sotto i 17 ° C per questo passo. </li><li> Utilizzare una rete per trasferire il pesce al contenitore esterno. </li><li> Lentamente aggiungere cubetti di ghiaccio al contenitore per portare la temperatura fino a 12 ° C, nel corso di diversi minuti. </li><li> Monitorare il comportamento dei pesci: A 17 ° C o leggermente inferiore, il pesce tipicamente diffonderà i suoi pettorali in orizzontale, senza fiato, e hanno movimenti rapidi opercolo. Quando la temperatura scende, i pesci nuotano più lentamente e finalmente smettere di nuotare. Mentre l'aereo chirurgico di anestesia si avvicina, ansimante si ferma e rallenta i movimenti opercolo. Il pesce è pronto per l'iniezione quando non reagisce a essere maneggiati. Per la maggior parte dei pesci, 12 ° C è sufficiente. I pesci più grandi può richiedere più fredde water. </li><li> Come la temperatura desiderata viene raggiunta (~ 12 ° C o inferiore), premere sulla spugna per saturare esso. </li><li> Tenete le dita in acqua fredda a sufficienza in modo che non si riscalda il pesce e portarlo fuori di anestesia durante la manipolazione. </li><li> Con le dita fredde, delicatamente trasferire il pesce al trogolo della spugna. Posizionare il pesce con l'addome e le branchie nel trogolo. </li><li> Trasferire rapidamente il tavolo operatorio alla fase microscopio. </li><li> Lavorare con rapidità, accuratezza inserire l'ago nella linea mediana tra le pinne pelviche. L'ago deve puntare cranialmente ed essere inseriti più vicino al cingolo pelvico che per l'ano. Dovreste essere in grado di sentire quando l'ago è profondo alla parete del corpo. Iniettare il volume appropriato e ritirare l'ago. </li><li> Dopo l'iniezione, trasferire immediatamente il pesce alla sua acqua calda (~ 28,5 ° C) Serbatoio per il recupero rilasciando il pesce dalla spugna sopra l'acqua del serbatoio. Suggerimento: se il pesce non inizia immediatamente nuoto, aiutarla a recuperare rimestando delicatamente acqua verso le branchie. </li><li> Controllare l'ago. Occasionalmente una scala può essere fissata e deve essere rimosso prima della successiva iniezione. </li><li> Per le successive iniezioni, usare acqua tiepida struttura per portare la temperatura della camera anestetico acqua torna fino a 17 ° C prima di introdurre il pesce successiva. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rappresentante risultati dopo l'iniezione intraperitoneale di 0,5 mg / g di glucosio o di un veicolo. Pesci sono stati a digiuno per 72 ore prima dell'iniezione. L'asse x mostra il tempo, dopo l'iniezione. Media ± SEM.

<ol><li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+SF+%22Fish+Physiology+Volume+X%3A+Gills%2C+Part+B%3A+Ion+and+Water%22">Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water</a>. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).</li>
<li>Brown, L. A. Anesthesia and restraint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+LA+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).</li>
<li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li>
<li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li>
<li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).</li>
<li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwama%2C+GK+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Fishes%2C+Volume+3%3A+Analytical+Techniques%22">Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques</a>. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).</li>
<li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li>
<li>Stoskopf, M. K. Surgery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoskopf%2C+MK+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Iniezione intraperitoneale prevede cinque fasi: il digiuno, pesatura, anestetizzante, iniezione, e il recupero. Per ogni tappa ci sono buone pratiche che possono assicurare il successo. Successo include un paziente sano pesce, nonché un buon risultato sperimentale. Il digiuno: A 24 ore di digiuno dovrebbe svuotare il bulbo intestinale. Questa pratica è tratto dalla letteratura veterinaria pesce (per esempio, Brown, 1993). Ulteriori considerazioni digiuno sono discussi di seguito. A lungo termine il digiuno: Abbiamo scoperto che una di 72 ore di digiuno è richiesto di ridurre il glucosio nel sangue a un livello base prima dell&#39;iniezione (Eames et al, 2010).. Abbiamo anche scoperto che per gli studi di glucosio ci sono diverse procedure che sono necessarie per garantire che i pesci sono a digiuno in modo corretto. Inizia con un serbatoio pulito (senza residui sul fondo). Cisterne devono essere in linea, chiaramente etichettati come &#39;digiuno&#39;, e in una posizione dove entusiasta personale di assistenza di pesce non li alimentano. Valutare l&#39;ambiente esterno della cisterna e di prendere misure per evitare che il pesce venga sottolineato da disturbi, come lo stress è noto per aumentare la glicemia (Chavin e Young, 1970;. Groff et al, 1999). Per esempio, abbiamo avuto un esperimento digiuno in cui è stato operato una radio ogni giorno sulla panchina che aveva in mano le vasche dei pesci. Abbiamo scoperto che il glucosio nel sangue era insolitamente alto e ha concluso che i pesci erano sottolineato dalle vibrazioni. Un altro fattore di stress è il sovraffollamento. I pesci devono essere mantenuti a una densità che è conforme con le buone pratiche di allevamento dei pesci. Per i consigli, vedere Marca et al. (2002) e Westerfield (1995). Abbiamo avuto buoni risultati digiuno nostri pesci con una densità di 10-12 pesci in un acquario 9 litro (con 3 strati di marmi occupare parte di questo volume). La separazione dei sessi può causare stress, quindi si consiglia di mantenere un misto di sesso popolazione durante il digiuno. Ciò significa che le uova possono essere deposte, e le uova devono essere sequestrato in modo che non sarà mangiato. Un modo semplice per sequestrare le uova è di coprire il fondo della vasca con 2-3 strati di marmi. La qualità dell&#39;acqua deve essere mantenuto, eliminando uova e rifiuti e sostituendo circa il 10-15% dell&#39;acqua della vasca, tutti i giorni. Per la rimozione di uova e rifiuti, sifone funziona bene. Peso: quando pesare i pesci che non sono anestetizzate, si dovrebbe aver cura di ridurre al minimo il trasferimento di acqua dalla rete nel becher, per garantire la precisione di pesatura. Se la rete (con pesce) è cancellata su carta assorbente, la maggior parte l&#39;acqua in eccesso può essere rimosso, e il peso può essere misurata con precisione. Può essere più facile per anestetizzare il pesce prima della pesata, ma non abbiamo testato gli effetti possibili di anestetizzare un pesce due volte in un giorno. Abbiamo testato la nostra tecnica pesando il primo pesce con la rete / assorbente metodo e poi pesando il pesce dopo che è stato anestetizzato, e delicatamente asciugate. Abbiamo trovato alcuna differenza significativa nel peso tra i metodi (P = 0,7927, t-test). Inoltre, abbiamo testato se questa rete / assorbente di glucosio nel sangue colpite metodo, rispetto al semplice trasferimento del pesce al bicchiere non appena si compensano (senza assorbente). Abbiamo trovato alcuna differenza significativa nel livello di glucosio nel sangue tra i due metodi di trasferimento (p = 0,2241, t-test). L&#39;anestesia: l&#39;anestesia chimica può essere adatto a molti studi. Qui abbiamo dimostrato l&#39;anestesia acqua fredda, in alternativa, in quanto gli anestetici molti (tra cui tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), aumentare il glucosio nel sangue. In studi precedenti, abbiamo stabilito che l&#39;acqua fredda non solleva glicemia nel pesce zebra (Eames et al., 2010). Per l&#39;anestesia acqua fredda, la temperatura deve essere ridotta lentamente. Il tasso di riduzione sembra dipendere dalle dimensioni del pesce, con pesci più piccoli di andare sotto più veloce di pesci più grandi. Dopo l&#39;iniezione, si può osservare che il pesce si sta riprendendo da troppo lentamente l&#39;anestetico (vedi sotto). Ciò può portare, quando sia la temperatura iniziale è troppo bassa, o quando la temperatura diminuisce troppo rapidamente. La temperatura di partenza è troppo bassa se il pesce si piega lateralmente entrando l&#39;acqua. Se la temperatura di partenza è corretto, il pesce mantiene il suo equilibrio inizialmente. Ruoterà sue pinne pettorali in posizione orizzontale, senza fiato, e hanno movimenti rapidi opercolo. Tipicamente, si nuotare. Al diminuire della temperatura, i movimenti si riduce e il pesce perde l&#39;equilibrio. Un aereo chirurgico di anestesia viene raggiunta quando il pesce può essere gestita senza reagire. Per mantenere il pesce in anestesia chirurgica, le dita devono essere fredde, in modo da tenerli in acqua prima del trattamento del pesce. La spugna deve essere mantenuto freddo alla stessa temperatura come l&#39;acqua utilizzata per anestetizzare i pesci. E &#39;importante saturare la spugna con l&#39;acqua che è sufficiently freddo per mantenere l&#39;anestesia una volta che il pesce viene posto su di esso. Iniezione: Prima di iniezioni di impresa, si consiglia di analizzare almeno un pesce per avere un&#39;idea dello spessore della parete del corpo. Questo può aiutare a valutare in quale misura l&#39;ago deve inserire per accedere alla cavità addominale. Inoltre, come si inserisce l&#39;ago, si può sentire la parete del corpo &quot;dare&quot; quando l&#39;ago entra nella cavità addominale. Durante l&#39;iniezione, prendere misure per mantenere il paziente felice. Assicurarsi che la spugna è saturata con l&#39;acqua fredda della temperatura corretta per evitare che il pesce da far rivivere durante l&#39;iniezione. Una spugna ben saturi e morbida è importante per minimizzare i danni alle scale e muco la copertura della cute. A ben saturi spugna è importante anche per mantenere le branchie aerato. Consigliamo vivamente la spugna in schiuma di seguito elencati sotto Materiali. Infine, una volta che il pesce è anestetizzato, lavorare velocemente per minimizzare il tempo che il pesce è sotto. Recupero: Il pesce deve riprendersi dalla anestesia praticamente entrando l&#39;acqua calda del serbatoio. Se il pesce non inizia immediatamente nuoto, capovolgere delicatamente l&#39;acqua verso le branchie per accelerare il recupero. Se il recupero è lento, poi il pesce è andato sotto troppo in fretta e si dovrebbe regolare la procedura di anestesia in modo appropriato. Le possibili cause della lenta ripresa sono discussi in Anestesia.

<table><tbody><tr><td>Spugna schiuma</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coperchio della scatola per punte di pipetta</td><td></td><td></td><td>non troppo profondo, ad esempio 1,5 cm</td></tr><tr><td>Contenitore di plastica per conservazione</td><td></td><td></td><td>profondo, ad esempio 7 cm</td></tr><tr><td>Termometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio tritato</td><td></td><td></td><td>prodotto con acqua dell'impianto</td></tr><tr><td>Acqua calda dell'impianto</td><td></td><td></td><td>1 litro o più</td></tr><tr><td>Beccher da 500 ml</td><td></td><td></td><td>per la pesatura</td></tr><tr><td>Siringa NanoFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>o siringa Hamilton</td></tr><tr><td>Ago da 35 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF35BV-2</td><td>con smusso</td></tr><tr><td>Tubetto Silflex</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SILFLEX-2</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III e controller Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMPS-1</td><td></td></tr><tr><td>Pedaliera</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15867</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellicola di plastica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta assorbente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina Cortland</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Un metodo conveniente per trattare chimicamente zebrafish è quello di introdurre il reattivo in acqua serbatoio, dove verrà ripreso dai pesci. Tuttavia, questo metodo rende difficile sapere quanto reagente viene assorbita o ripreso per i pesci. Alcune domande sperimentali, in particolare quelli relativi a studi metabolici, può essere meglio affrontata fornendo una quantità definita per ogni pesce, in base al peso. Qui vi presentiamo un metodo per intraperitoneale (IP) iniezione in zebrafish adulti. L&#39;iniezione è nella cavità addominale, posteriore al cingolo pelvico. Questa procedura è adattato da metodi veterinari utilizzati per pesci più grandi. E &#39;sicuro, come abbiamo osservato mortalità pari a zero. Inoltre, abbiamo visto sanguinamento nel sito di iniezione in solo 5 su 127 iniezioni, e in ciascuno di questi casi l&#39;emorragia è stata breve, della durata di alcuni secondi, e la quantità di sangue perso era piccola. Successo con questa procedura richiede una gestione delicata del pesce attraverso diversi passaggi tra cui il digiuno, pesatura, anestetizzante, iniezione, e il recupero. Precauzioni necessarie per minimizzare lo stress durante l&#39;intera procedura. Le nostre precauzioni includono l&#39;utilizzo di un piccolo volume di iniezione e un ago 35G. Noi usiamo soluzione salina Cortland come il veicolo, che è osmoticamente bilanciato per pesci d&#39;acqua dolce. L&#39;aerazione delle branchie è mantenuta durante la procedura di iniezione per prima cosa portare il pesce in un piano chirurgico di anestesia, che permette movimenti opercolo lenti, e la seconda, tenendo il pesce in una vasca all&#39;interno di un saturo d&#39;acqua spugna durante la stessa iniezione. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità di iniezione IP, iniettando glucosio e il monitoraggio del livello del glucosio nel sangue e il suo successivo ritorno alla normalità. Lo stress è noto per aumentare il glucosio nel sangue nei pesci teleostei, mettiamo a confronto i livelli di glucosio nel sangue in adulti veicolo a iniezione e non per iniezione e dimostrare che la procedura non causa un significativo aumento del glucosio nel sangue.

Dimostriamo iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti. Usiamo una microsiringa da 10 microlitri NanoFil controllato da un controller Micro4 e UltraMicroPump III. Questa dimostrazione include l&#39;uso di acqua fredda come anestetico.

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

Un metodo pratico per il trattamento chimico dello zebrafish consiste nell'introdurre il reagente nell'acqua della vasca, da dove verrà assorbito dai pesci. Tuttavia, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è iniettare una soluzione nella cavità peritoneale del pesce zebra adulto. In questo esempio, inietteremo glucosio nel nostro laboratorio. Utilizziamo questa procedura per studiare la stasi del glucosio nel sangue.Questo viene effettuato pesando innanzitutto il pesce per determinare la quantità di soluzione da iniettare per grammo di peso corporeo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'anestetizzare il pesce con acqua fredda. Il terzo passaggio prevede il trasferimento del pesce sul palchetto del microscopio e l'esecuzione dell'iniezione.L'ultimo passaggio della procedura consiste nel restituire il pesce al suo contenitore per il recupero. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano modifiche nell'omeostasi del glucosio attraverso la misurazione dei livelli ematici di glucosio. Ciao, sono Mary Kinkle del laboratorio di Victoria Prince del Dipartimento di Biologia e Anatomia degli Organismi presso l'Università di Chicago.Sono Stephanie Ames, anch'io del laboratorio di Prince. Oggi vi mostreremo un procedimento per iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la regolazione dell'omeostasi del glucosio ematico.Iniziamo. Per preparare i pesci per l'iniezione, trasferire innanzitutto i pesci in un acquario pulito e sospendere l'alimentazione. Privare i pesci del cibo per 24 ore per svuotare il contenuto della vescica intestinale e per 72 ore per ridurre il glucosio ematico ai livelli di base.La densità utilizzata in questo protocollo è di 10-12 pesci di sesso misto per serbatoio da nove litri con tre strati di biglie; le biglie intrappolano le uova impedendo che vengano mangiate. Rimuovere giornalmente le uova e i rifiuti sifonando il serbatoio.Successivamente, preparare la soluzione salina di Cortland utilizzando cloruro di sodio 124,1 millimolare, cloruro di potassio 5,1 millimolare, pirofosfato di sodio 2,9 millimolare, solfato di magnesio eptaidrato 1,9 millimolare, cloruro di calcio diidrato 1,4 millimolare, bicarbonato di sodio 11,9 millimolare, quattro grammi di polivinilpirrolidone e 1000 unità USP di eparina, portando a un volume finale di 100 millilitri con acqua deionizzata; filtrare, sterilizzare e conservare a quattro gradi Celsius. Successivamente, sciogliere cinque grammi di glucosio in 10 millilitri di soluzione salina di Cortland. Per ottenere una soluzione di glucosio 0,5 milligrammi per microlitro, filtrare, sterilizzare e conservare a quattro gradi Celsius.Quindi preparare il tavolo operatorio tagliando una spugna morbida a un'altezza di circa 20 millimetri sulla faccia piana. Praticare un taglio profondo da 10 a 15 millimetri per fissare il pesce durante l'iniezione. Posizionare la spugna in una piastra di Petri da 60 millimetri e collocare la piastra con la spugna nel coperchio di un contenitore per puntali di pipetta P 200.Successivamente, preparare il microscopio coprendo la base con pellicola trasparente e tovaglioli di carta per proteggerla. In caso di versamenti, posizionare il tavolo operatorio sopra i tovaglioli di carta. Regolare preventivamente il fuoco osservando il tavolo operatorio e mettendo a fuoco la spugna.Metti il dito sopra la spugna e concentrati su di essa per ridurre al minimo ulteriori aggiustamenti del fuoco quando il pesce si trova sul tavolo operatorio. Pesa il pesce riempiendo un becher da 500 millilitri per circa un terzo con acqua proveniente dall'allevamento dei pesci e lacrima. Su una bilancia, trasferisci delicatamente il pesce con il minor quantitativo possibile di acqua in eccesso nel becher, registra il peso e trasferisci ogni pesce pesato in un contenitore trasparente etichettato.Calcolare il volume da iniettare in base al peso. In questo esempio, verrà iniettata una soluzione di 0,5 milligrammi per grammo di peso corporeo di glucosio disciolto in soluzione salina Cortland. Poiché la nostra soluzione ha una concentrazione di 0,5 milligrammi per microlitro, il calcolo è: un multiplo del peso del pesce espresso in grammi corrisponde al volume da iniettare in microlitri. Preparare quindi la siringa e le attrezzature necessarie per l'iniezione.Questo protocollo utilizza un ago in acciaio bevel 30G, una pompa ultra micro e un microprocessore a quattro canali e una siringa micro nano fill da 10 microlitri per l'iniezione di glucosio; riempire la siringa con glucosio a 0,5 milligrammi per microlitro disciolto in soluzione salina Cortland. È importante rimuovere tutte le bolle d'aria dalla siringa, montare la siringa sulla pompa ultra micro e programmare il volume di iniezione per il primo pesce inserendo il volume in nanolitri, utilizzando il tastierino numerico sul microprocessore a quattro canali. Infine, preparare l'anestetico a base di ghiaccio frantumando cubetti di ghiaccio sufficienti ottenuti con acqua del sistema acquario.Per riempire un secchio del ghiaccio, posizionare il tavolo chirurgico all'interno di un contenitore più grande, ad esempio un contenitore per alimenti in gomma da 2,4 litri. Versare dell'acqua calda dell'impianto nel contenitore esterno e sul tavolo chirurgico. Tenere a portata di mano un serbatoio di riserva con acqua calda dell'impianto.Collegare un termometro al contenitore esterno. Posizionare il contenitore esterno dell'anestetico insieme al tavolo operatorio vicino al microscopio. Tenere vicino un secchio pieno di ghiaccio tritato.Iniziare ad aggiungere cubetti di ghiaccio fino a quando la temperatura dell'acqua raggiunge 17 gradi Celsius. Non scendere al di sotto di 17 gradi Celsius in questo passaggio. Utilizzare una rete per trasferire il pesce nel contenitore esterno.A 17 gradi o leggermente inferiori, il pesce di solito spiegherà le pinne pettorali in orizzontale, avrà affanno e movimenti auricolari rapidi. Aggiungere lentamente cubetti di ghiaccio al contenitore per abbassare la temperatura fino a 12 gradi Celsius nell'arco di diversi minuti. Con la diminuzione della temperatura, il pesce nuoterà sempre più lentamente e alla fine smetterà di nuotare.Alla fine l'agitazione cesserà e i movimenti auricolari rallenteranno. Il pesce è pronto per l'iniezione quando non reagisce al contatto. Quando si raggiunge la temperatura richiesta, premere sulla spugna per saturarla.Mantenga le dita nell'acqua fredda abbastanza a lungo da non riscaldare il pesce e farlo uscire dall'anestesia. Durante la manipolazione con dita fredde, trasferisca delicatamente il pesce nella scanalatura della spugna. Posizioni il pesce con l'addome verso l'alto e le branchie nella scanalatura.Trasferire rapidamente il tavolo chirurgico sulla piastra del microscopio. Lavorando rapidamente, posizionare con attenzione l'ago in modo che la punta sia orientata in direzione craniale ed sia più vicina alla cintura pelvica che all'ano. Inserire l'ago lungo la linea mediana tra le pinne pelviche.Dovresti essere in grado di percepire quando l'ago si trova al di sotto della parete corporea. Inserendo l'ago, puoi sentire la cessione della parete corporea. Quando l'ago entra nella cavità addominale, inietta il volume appropriato utilizzando il micro per processore.Utilizzare il pedale per iniettare un microlitro per grammo di peso corporeo del pesce; dopo l'iniezione, rimuovere l'ago e trasferire immediatamente il pesce nel suo serbatoio di acqua calda per il recupero. Rilasciando il pesce dalla spugna sopra l'acqua del serbatoio, controllare l'ago al microscopio. Di tanto in tanto, una squama potrebbe rimanere attaccata e dovrebbe essere rimossa prima della successiva iniezione.Dopo un periodo di tempo adeguato, procedere con il saggio successivo. Abbiamo riscontrato che è necessario un digiuno di 72 ore per ridurre il glucosio ematico a un livello di base prima dell'iniezione. In questo grafico, i dati del controllo non iniettato, mostrati in verde, mostrano valori di glucosio ematico non significativamente diversi dai controlli iniettati con il veicolo, mostrati qui in rosso.Tuttavia, la linea blu mostra i valori di glucosio ematico nei pesci a cui &egrave; stato iniettato glucosio, evidenziando l'aumento e la diminuzione del glucosio circolante. Nel tempo, sia gli animali a cui &egrave; stato iniettato glucosio sia quelli a cui &egrave; stato iniettato il veicolo erano sotto anestesia chirurgica durante la procedura di iniezione, mentre i controlli non iniettati non erano sotto anestesia chirurgica. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un'iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti.Nel nostro laboratorio, studiamo le variazioni della concentrazione di glucosio nel sangue in diversi punti temporali successivi all'iniezione IP di una soluzione di glucosio. Tuttavia, questa tecnica che vi abbiamo appena mostrato può essere utilizzata per iniettare la soluzione di vostro interesse. Quando eseguite questa procedura, ricordate di anestetizzare lentamente il pesce e di manipolarlo con delicatezza.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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