Rilevazione di attività NEU1 sialidasi nella regolamentazione Toll-like l'attivazione del recettore

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'induzione dell'attività cellulare della nuova sase in risposta al legame del ligando con il suo recettore specifico. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando le cellule su vetrini circolari da 12 millimetri in una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti per 24 ore. Come secondo passaggio, le cellule vive aderenti al vetrino vengono poste direttamente a contatto con una miscela precedentemente preparata di substrato per la sase e ligando del recettore, con o senza inibitori specifici, su un vetrino per microscopio immediatamente successivo.

Il vetrino del microscopio viene immediatamente posizionato sotto un microscopio a fluorescenza per visualizzare e acquisire digitalmente le immagini fluorescenti. Nel tempo si ottengono risultati che mostrano variazioni nell'attività della nuova sase sulla superficie cellulare associata a cellule vive trattate con ligando, in base all'intensità della fluorescenza blu attorno alle cellule osservata mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi spettrofotometrica, è che si utilizzano meno reagenti. È inoltre possibile osservare e acquisire immagini dell'attività sase in cellule vive. Questo metodo può essere impiegato per rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, ad esempio per studiare potenziali nuove interazioni ligando-recettore e per analizzare gli effetti di inibitori specifici di enzimi o proteine sull'attivazione dei recettori.

Il dottor Ray Amit e il dottor PT Gath, ex studenti di dottorato del mio laboratorio che utilizzano questo saggio nei loro studi di ricerca, dimostreranno la procedura. Prima di risvegliare le cellule di macrofagi congelate, preparare il mezzo di coltura utilizzando il mezzo di Eagle modificato, sterilizzato per filtrazione e integrato con il 10% di siero fetale bovino e cinque microgrammi per millilitro dell'antibiotico plasmide. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo di coltura in un'ampolla da coltura cellulare da 25 centimetri quadrati per ogni provetta di cellule congelate, rimuovere la provetta di cellule congelate dal congelatore a meno 80 gradi Celsius ed effettuare rapidamente lo scongelamento riscaldando a mano all'interno della cappa sterile a contenimento di rischio biologico.

Questo richiederà circa due o tre minuti. Non appena le cellule sono scongelate, utilizzare una pipetta sterile da un millilitro per trasferirle rapidamente nel flacone da coltura cellulare contenente il mezzo condizionato. Posizionare il flacone contenente le cellule in un incubatore per colture tessutali a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica utilizzando un microscopio invertito.

Controllare le cellule ogni giorno per verificarne la crescita e l'adesione fino a quando non raggiungono una confluenza del 75% al 90%, alcuni giorni prima della semina delle cellule per il saggio SASE. Preparare i vetrini circolari da 12 millimetri su cui verranno seminate le cellule. All'interno dell'armadio a sicurezza biologica.

Posizionare i vetrini in una grande capsula di Petri di vetro e sterilizzarli immergendoli in etanolo al 100% per un'ora. Rimuovere l'alcol e lasciare i vetrini bagnati esposti al flusso d'aria sterile filtrata all'interno del cabinet sotto luce UV per 24 ore o fino a quando non saranno completamente asciutti, pronti per la semina cellulare. Per prima cosa, sterilizzare completamente una pinzetta curva in acciaio inossidabile a quattro pollici con bordo seghettato mediante fiamma.

Quindi utilizzare la pinzetta per posizionare con attenzione un singolo vetrino circolare sterile in ogni pozzetto di una piastra in polistirene trattata per colture cellulari a fondo piatto da 24 pozzetti. Utilizzando una pipetta sterile da cinque millilitri, rimuovere il mezzo condizionato DMEM dal flacone contenente le cellule di macrofagi aderenti. Lavare le cellule una volta con tris tampone salino sterile 1x a pH 7,4 per rimuovere qualsiasi mezzo contenente siero.

Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione salina tampone priva di fosfati e contenente calcio a pH 7,4. Collocare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per circa 10 minuti o fino a quando le cellule iniziano a staccarsi dal fondo della provetta. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere tre millilitri di mezzo condizionato DMEM alle cellule in sospensione.

Quindi trasferire 0,5 millilitri della sospensione con circa 0,5 milioni di cellule su ciascun vetrino circolare da 12 millimetri nella piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra per colture cellulari contenente le cellule macrofagiche a 37 gradi Celsius in un’atmosfera al 5% di anidride carbonica per 24 ore, in modo da permettere alle cellule di aderire ai vetrini circolari. Il saggio per l'attività di sase verrà eseguito in tre condizioni diverse su tre diversi vetrini microscopici. Sul primo vetrino, che funge da controllo negativo.

Le cellule di controllo sono esposte a un mezzo di montaggio. Il substrato della neuraminidasi per ANA e il tampone salino al tris, ma non il ligando del recettore di tipo toll LPS. Sul secondo vetrino, le cellule sono esposte al mezzo di montaggio, al ligando del recettore di tipo toll LPS e al tampone salino al tris.

Sul terzo vetrino, le cellule sono esposte al mezzo di montaggio contenente ANA, LPS Tris, soluzione salina tamponata e l'inibitore della neuraminidasi Tamiflu. Illustreremo la procedura solo per il secondo saggio, poiché i tre saggi differiscono soltanto per la miscela di composti presente sul vetrino del microscopio. Posizionare il vetrino sul banco del laboratorio e aggiungere i seguenti composti in ordine sequenziale.

Un microlitro di mezzo di montaggio seguito da un microlitro di forma due microlitri di LPS e infine, tre microlitri di soluzione salina tamponata al tris, pH 7,4. Successivamente, rimuovere il mezzo da un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente le cellule. Il passaggio successivo rappresenta l'aspetto più difficile di questa procedura, poiché è necessario rimuovere il coprivetro circolare dal pozzetto della piastra per colture cellulari utilizzando pinzette senza romperlo, con pinzette da quattro pollici.

Sollevare delicatamente la lamella circolare in vetro verso l'angolo della pozzetta, quindi rimuoverla con attenzione e posizionarla con le cellule rivolte verso il basso nella miscela di soluzione. Prendere immediatamente la lamella da microscopio e portarla a un microscopio epifluorescente impostato per il filtro UV e dotato di una fotocamera digitale per acquisire immagini fluorescenti. Mettere a fuoco il microscopio in contrasto di fase finché non si vedono le cellule, quindi passare alla modalità fluorescenza.

Acquisire immagini delle cellule in modalità fluorescente a un minuto, due minuti e tre minuti. Inoltre, acquisire una singola immagine delle cellule in rappresentazione a contrasto di fase. Di seguito sono mostrati i risultati di un esperimento di saggio sase.

Prima di tutto, come controllo negativo, cellule vive aderenti a un vetrino sono state messe a diretto contatto con una goccia contenente un mix di mezzo di montaggio e substrato. In presenza di attività della fosfatasi acida, il substrato verrebbe idrolizzato per produrre etil lumibione libero, che presenta un'emissione fluorescente a 450 nanometri dopo eccitazione a 365 nanometri, rilevata due minuti dopo l'aggiunta del substrato.

Questa immagine fluorescente mostra l'assenza di attività sase attorno alle cellule. Questa immagine successiva mostra i risultati di un saggio SASE positivo in cui cellule vive aderenti a un vetrino sono state messe a diretto contatto con una miscela contenente un mezzo di montaggio, un substrato quattro e un ligando LPS per TLR quattro. Il substrato è stato idrolizzato dall'enzima sase per produrre etil lum beone libero, e l'immagine fluorescente acquisita due minuti dopo l'aggiunta del substrato e del LPS indica livelli elevati di attività sase attorno alle cellule.

Tuttavia, quando cellule vive sono state poste a diretto contatto con una miscela spot di mezzi di montaggio contenenti il ligando TLR4 del nano substrato LPS, nonché l'inibitore della neuraminidasi Tamiflu, l'attività sase è risultata notevolmente ridotta o addirittura non più rilevabile, a seconda della concentrazione dell'inibitore. Infine, questo grafico mostra la concentrazione inibitoria al 50% di Tamiflu e del carbossilato di Oseltamivir, determinata tracciando la riduzione dell'attività sase in funzione del logaritmo della concentrazione del composto; l'intensità media della fluorescenza attorno alle cellule per ogni gruppo è stata misurata. Utilizzando il software ImageJ, nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di coltivare le cellule su coprioggetti circolari in vetro, posizionati in piastre per colture cellulari a 24 pozzetti, 24 ore prima di iniziare il saggio Sade.

Inoltre, tutti i reagenti utilizzati in questo saggio devono essere preparati prima di iniziare il saggio.