Name: Rilevazione di attività NEU1 sialidasi nella regolamentazione Toll-like lattivazione del recettore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri come rilevare l'attività sialidasica NEU1 nei macrofagi vivi per studiare l'attivazione dei recettori Toll-like. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale delle risposte cellulari nelle malattie infiammatorie.

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Supporto parziale da sovvenzioni a MRS è di scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC), l&#39;Harry Botterell Foundation for Neuroscience Research, ARC, e la ricerca Garfield Kelly cardiovascolari e Fondo di sviluppo. SRA è un destinatario del Premio Regina di ricerca dell&#39;Università e del Robert J. Wilson Fellowship. PJ è un destinatario del premio di Laurea della Regina e il Robert J. Wilson Fellowship. AG e SA sono i destinatari del premio di Laurea della Regina. SF è stato il destinatario della Borsa di Studio Ontario Laurea in Scienza e Tecnologia (OGSST). AG è il destinatario della Borsa di studio della Regina Franklin Bracken Graduate. SA è il destinatario della Borsa di studio della Regina RS McLaughlin Graduate.

1. Resuscitare i macrofagi congelati <ol><li> Prima di risorgere cellule congelate dal freezer -80 ° C, si ha la necessità di preparare un terreno di coltura sterile filtrata utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 5 mg / mL di plasmocin. Plasmocin è una soluzione di antibiotico utilizzato nella nostra ricerca per eliminare e prevenire la contaminazione da micoplasma di colture cellulari. </li><li> Per un flaconcino di cellule congelate, si aggiunge 4 mL, 1 mL del mezzo di coltura per un CM 25 2 pallone di coltura cellulare in una cappa sterile contenimento rischio biologico. </li><li> Quando la fiala di cellule congelate sono prese dal congelatore ° -80 C, vengono scongelati rapidamente dal riscaldamento mano nella cappa sterile, che dura circa 2-3 minuti. </li><li> Non appena le cellule vengono scongelati, vengono rapidamente trasferiti nel pallone contenente il mezzo condizionato usando una pipetta sterile 1 ml. </li><li> Il pallone contenente le cellule si trovano in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Le cellule controllato per la crescita e l&#39;adesione su base giornaliera fino a diventare il 75% al ​​90% confluenti utilizzando un microscopio invertito. </li><li> Durante l&#39;incubazione di colture cellulari, 12 vetrini millimetri circolare vengono sterilizzati con copertura in etanolo al 70% in un grande piatto di vetro petri per 1 ora nel quadro di contenimento rischio biologico, l&#39;alcol è poi rimosso e conservato per reusage, e le pareti di vetro bagnato sono lasciati esposti alla sterile filtrata flusso d&#39;aria nel mobile sotto un UV per 24 ore o fino a quando sono asciutti. </li></ol> 2. Le cellule placcatura per il saggio sialidasi <ol><li> Prima di placcatura le cellule, una singola scivolo sterile di vetro circolare viene accuratamente posizionato in un pozzetto di un Falcon 24-BD bene a fondo piatto con coperchio tessuto-cultura lastra di polistirene trattate utilizzando un sterilizzati curva fiammeggiante pieno, 4 &quot;, seghettata, pinza in acciaio inox . Per un pallone di cellule al 75% confluenza, di solito utilizzare 12 pozzetti della piastra di coltura. </li><li> Per le cellule macrofagi aderenti, il medium DMEM condizionato viene rimosso dal pallone con una pipetta da 5 ml sterile nel quadro di contenimento sterile. Lavare le cellule aderenti, una volta con 1x sterile salina Tris tamponata pH 7,4 a rimuovere qualsiasi supporto contenente siero, e aggiungere 1 ml di calcio-media liberi (CMF) tampone fosfato a pH 7.4 sufficiente a coprire le cellule. Le cellule si trovano nel 37 ° C incubatore per circa 10 minuti o fino a quando le cellule iniziano a sollevare nel pallone. Il pallone può essere cullati o agitato al fine di allentare le rimanenti cellule aderenti. </li><li> Per il 1 ml di cellule sospese nel pallone, aggiungere 3 ml di medium DMEM condizionata. Prendere 0,5 mL di cellule sospese e sterilmente loro trasferite alla piastra di coltura di tessuto contenente le 12 lastre di vetro circolare mm. Circa, 0,5 x 10 6 cellule vengono trasferite alle diapositive di vetro circolare. </li><li> La piastra di coltura delle cellule dei tessuti contenenti vengono incubate a 37 ° C in 5% di CO 2 per 24 ore al fine di consentire alle cellule di aderire alle diapositive di vetro circolare. </li></ol> 3. Sialidasi Assay 1. Rendere il controllo <ol><li> Posizionare un vetrino da microscopio (smerigliato: 1 fine, 1slide, 25 x 75 x 1 mm) nel quadro di contenimento o banco di laboratorio ed aggiungere mescolando in ordine sequenziale i seguenti composti: 1 ml DAKO + 1 ml di 4-MUNANA e infine + 3 ml di soluzione salina Tris tamponata pH 7.4 (TBS). </li><li> Dopo aver rimosso i mezzi di comunicazione da un pozzetto contenente le cellule, sollevare delicatamente il vetrino circolare di vetro con il &quot;4 pinza verso l&#39;angolo del pozzo. Rimuovere con cura il vetrino con la pinza e inserire il vetrino con le cellule si affaccia sulla soluzione miscela di il vetrino da microscopio. </li><li> Immediatamente, prendere lo scorrimento microcope ad un epi-microscopia a fluorescenza che è stato impostato per il filtro UV e ha una fotocamera digitale per catturare le immagini fluorescenti. </li><li> Messa a fuoco il microscopio in contrasto di fase fino a vedere le cellule e quindi passare alla modalità fluorescente. Scatta foto delle cellule sotto fluorescenti a 1 min, 2 min e 3 min. Prendete una singola immagine delle cellule in contrasto di fase. </li></ol> 2. Rendere il test positivo <ol><li> Spot i seguenti composti in ordine sequenziale su un altro vetrino da microscopio: 1 ml DAKO + 1 ml di 4-MUNANA + 2 ml di LPS + 1 ml di TBS. </li><li> Ripetere i passi da 3.1.2 a 3.1.4 di cui sopra. </li></ol> 3. Rendere il test positivo con Tamiflu inibitore della neuraminidasi <ol><li> Spot i seguenti composti nel seguente ordine sequenziale su un altro vetrino da microscopio: 1ml DAKO + 1ml di 4-MUNANA + 2 ml di LPS + 1 ml di Tamiflu. </li><li> Concentrazioni di Tamiflu sono pre-preparati in 1x salina Tris tamponata pH 7.4; la concentrazione finale dei composti in contatto con le cellule in diretta su vetrino circolare avrà un fattore di diluizione su 5. </li><li> Ripetere i passi da 3.1.2 a 3.1.4 di cui sopra. </li></ol> 4. Determinazione della concentrazione di inibitore necessaria per inibire il 50% delle attività sialidasi (IC 50) <ol><li> Per quantificare il fluorescenti che circonda le cellule, le immagini vengono analizzati utilizzando ImageJ 1.38x con l&#39;analizzare i plugin per la misurazione RBG. Prendere 50 letture casuali della fluorescenza che circonda le cellule e calcolare la media della fluorescenza totale. </li><li> L&#39;IC 50 è generato da un complotto della concentrazione di inibitore convertito in unità log (ad esempio, log ng / mL) su l&#39;asse x contro la fluorescenza media sul l&#39;asse y utilizzando la regressione lineare. </li></ol> 5. I segreti del successo <ol><li> Assicurarsi che le cellule in cultura sono esenti da contaminazione da micoplasma. Noi abitualmente uso Plasmocin in un terreno di coltura per il controllo per questo. </li><li> Il substrato artificiale neuraminidasi, 4-MUNANA, devono essere utilizzati preparati al momento. Il substrato preparato può essere utilizzato entro una settimana per il test sialidasi. </li><li> Se la linea cellulare ha una bassa espressione dei recettori sulla superficie cellulare, si può usare una dose più alta del ligando per la stimolazione. </li><li> Abbiamo anche sperimentato che le cellule diversi passaggi per più di 6 volte potrebbero perdere il loro fenotipo recettore. Fresco, le cellule devono essere coltivate risorto. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Vedi protocollo d&#39;animazione del saggio sialidasi con risultati rappresentante nel allegato <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">file di Powerpoint</a> .

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

SRA e PJ contribuito in maniera uguale come primi autori.

Utilizzando il test di nuova concezione per rilevare l&#39;attività sialidasi in cellule vive macrofagi 2, abbiamo utilizzato questa tecnologia per rilevare l&#39;attività sialidasi in ligando indotta attività sialidasi in live BMC-2 cellule macrofagi in modo dose-dipendente e in live-2.4 DC cellule dendritiche , HEK-TLR4/MD2, HEK293, le cellule di adenocarcinoma mammario SP1, WT umana e 1140F01 e WG0544 tipo I fibroblasti sialidosi. Gli inibitori della neuraminidasi come il Tamiflu (oseltamivir fosfato) ha i...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation, Mezzo di montaggio fluorescente</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Tamiflu (fosfato di oseltamivir)</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione di attività neu1 sialidasi nella regolamentazione toll-like l&#39;attivazione del recettore

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammiferi recettori Toll-like (TLR) sono una famiglia di recettori che riconoscono pattern molecolari patogeni associati. Non solo i sensori di TLR cruciale microbica (ad esempio, virus, batteri e parassiti) infezioni, hanno anche un ruolo importante nella fisiopatologia delle malattie infettive, malattie infiammatorie, e forse anche nelle malattie autoimmuni. Così, l&#39;intensità e la durata delle risposte TLR contro le malattie infettive devono essere strettamente controllati. Ne consegue che la comprensione l&#39;integrità strutturale dei recettori del sensore, le loro interazioni ligando e componenti segnalazione è essenziale per la successiva protezione immunologica. Sarebbe inoltre fornire importanti opportunità per la modifica delle malattie attraverso la manipolazione del sensore. Anche se le vie di segnalazione di sensori TLR sono ben caratterizzati, i parametri che controllano le interazioni tra i sensori e loro ligandi sono ancora poco definiti. Abbiamo recentemente identificato un nuovo meccanismo di attivazione TLR dal suo ligando naturale, che non è stato precedentemente osservato 1,2. Suggerisce che ligando indotta attivazione TLR è strettamente controllato dalla NEU1 attivazione sialidasi. Abbiamo anche riferito che NEU1 regola strettamente recettori neurotrofina come TrkA e TrkB 3, che coinvolgono NEU1 e la matrice metalloproteinasi-9 (MMP-9) cross-talk in complesso con i recettori 4. Il dosaggio sialidasi è stato inizialmente utilizzato per trovare un romanzo ligando, Timochinone, l&#39;attivazione di Neu4 sialidasi sulla superficie cellulare di macrofagi, cellule dendritiche e le cellule di fibroblasti via GPCR proteine ​​Gαi e MMP-9 5. Per i recettori TLR, i nostri dati indicano che NEU1 sialidasi è già in complessi con i recettori TLR-2, -3 e -4, ed è indotta su di legame a uno dei recettori. Attivato NEU1 idrolizza sialidasi sialyl α-2 ,3-legati residui distante da ligando β-galattosiltransferasi vincolante per rimuovere impedimento sterico di TLR-4 dimerizzazione, MyD88/TLR4 reclutamento complesso, l&#39;attivazione NFkB e pro-infiammatorie risposte delle cellule. In un rapporto collaborativo, sialidasi NEU1 è stato dimostrato che regolano la fagocitosi in macrofagi 6. Nel loro insieme, il saggio sialidasi ci ha fornito spunti potente per i meccanismi molecolari del ligando indotta da attivazione del recettore. Sebbene l&#39;esatta relazione tra NEU1 sialidasi e l&#39;attivazione di TLR, recettori Trk deve ancora essere completamente chiarito, che rappresenterebbe un nuovo approccio pionieristico o per percorsi di regolazione cellulare.

Il test sialidasi è un approccio semplice tecnica che chiarire romanzo meccanismo molecolare (s) di sensori TLR di infezioni microbiche e di coinvolgimento nelle malattie infiammatorie a livello dei recettori sulla superficie cellulare di macrofagi dal vivo.

Rilevazione di attività NEU1 sialidasi nella regolamentazione Toll-like l&#39;attivazione del recettore

I recettori Toll-like (TLR) dei mammiferi sono una famiglia di recettori che riconoscono i pattern molecolari associati ai patogeni. I TLR non sono solo sensori cruciali di...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'induzione dell'attività cellulare della nuova sase in risposta al legame del ligando con il suo recettore specifico. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando le cellule su vetrini circolari da 12 millimetri in una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti per 24 ore. Come secondo passaggio, le cellule vive aderenti al vetrino vengono poste direttamente a contatto con una miscela precedentemente preparata di substrato per la sase e ligando del recettore, con o senza inibitori specifici, su un vetrino per microscopio immediatamente successivo.Il vetrino del microscopio viene immediatamente posizionato sotto un microscopio a fluorescenza per visualizzare e acquisire digitalmente le immagini fluorescenti. Nel tempo si ottengono risultati che mostrano variazioni nell'attività della nuova sase sulla superficie cellulare associata a cellule vive trattate con ligando, in base all'intensità della fluorescenza blu attorno alle cellule osservata mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza.Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi spettrofotometrica, è che si

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Immunologia e Infezioni

Questo video mostra un test per esaminare l'attività dipendente dal recettore toll-like (TLR) dei fattori di trascrizione fattore nucleare-kappa-B (NF-κB) e proteina attivatrice-1 (AP-1) nei macrofagi. I TLR innescano una cascata di segnalazione pro-infiammatoria dopo aver riconosciuto i pattern molecolari associati al danno (DAMP), attivando NF-κB e AP-1. I macrofagi reporter ingegnerizzati producono l'enzima fosfatasi alcalina embrionale (SEAP) secreto dopo l'attivazione di NF-κB e AP-1, che...

Un saggio per la segnalazione del fattore di trascrizione NF-&kcy;B/AP-1 TLR-dipendente nei macrofagi

Questo video mostra un test basato su cellule reporter per lo screening di potenziali nanoparticelle bioattive che inibiscono la segnalazione del recettore Toll-like (TLR). Il test prevede l'introduzione di lipopolisaccaridi (LPS) mescolati con ibridi di nanoparticelle peptidico-oro ai macrofagi reporter che esprimono le proteine reporter: fosfatasi alcalina embrionale secreta (SEAP) e luciferasi. La riduzione del segnale TLR indotto da LPS mediata dagli ibridi è determinata misurando i segnali...

Un test per lo screening di nanoparticelle bioattive per l'inibizione della segnalazione del recettore toll-like

Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall'attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l'attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l'attivazione tramite l'espressione di IL-1β.

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Descriviamo un metodo basato su HPLC per la determinazione dell'acido N-acetilneuraminico e dell'acido N-glicolilenraminico nel fegato e nel latte del topo.

Determinazione degli acidi sialici nei campioni di fegato e latte di tipo selvatico e<em&gt; CMAH</em&gt; Mouse Knock-out.

La segnalazione di TLR (Toll-like receptor) ha un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie infiammatorie umane e la regolazione delle risposte TLR mediante nanoparticelle bioattive è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie. Le cellule reporter THP-1 forniscono una piattaforma di screening versatile e robusta per identificare nuovi inibitori della segnalazione TLR.

Screening delle nanoparticelle bioattive in cellule immunitarie fagocitiche per gli inibitori della segnalazione di ricetrasmettitori simili

MALT1 regola dell'immunità innata, ma come in questo caso rimane mal definita. Abbiamo usato l'inibitore selettivo della paracaspase MALT1 MLT-827 per svelare il contributo di MALT1 alla innata di segnalazione a valle dei Toll-like o C-tipo il lectin-like receptors, dimostrando che MALT1 regola la produzione di citochine mieloide e a valle dei recettori di tipo C il lectin-like, in modo selettivo.

Mieloide innata Signaling Pathway regolamento da MALT1 Paracaspase attività

Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l'attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

Viene presentato un protocollo unico e completo per generare cellule dendritiche (mo-DC) derivate da monociti umani desialilati da cellule mononucleate isolate del sangue periferico (PBMC) utilizzando un trattamento con sialidasi. Inoltre, vengono descritti metodi per valutare la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle mo-DC e valutare come il trattamento con sialidasi migliora il livello di maturazione delle mo-DC.

Generazione di cellule dendritiche derivate da monociti con diversi fenotipi sialilati

Qui, proponiamo un semplice protocollo che combina l'ingegneria degli oligosaccaridi metabolici, la chimica dei clic e la microscopia ad espansione che consente il bioimaging di N-glicoproteine sialilate intracellulari con una migliore risoluzione utilizzando apparecchiature di microscopia di routine.

Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

Scopri come rilevare l'attività sialidasica NEU1 nei macrofagi vivi per studiare l'attivazione dei recettori Toll-like. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale delle risposte cellulari nelle malattie infiammatorie.

Rilevazione di attività NEU1 sialidasi nella regolamentazione Toll-like l'attivazione del recettore

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