Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

L'obiettivo generale di questa procedura è creare matrici compliant per modulare e quantificare la contrazione cellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto attivando un cover slip per consentire l'ancoraggio della matrice. Il secondo passaggio della procedura consiste nella polimerizzazione di un gel di poliacrilamide sul cover slip attivato.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'allestire le cellule sul gel e permettere loro di aderire. L'ultimo passaggio della procedura è l'acquisizione di immagini del gel per generare dati da analizzare mediante protocolli di microscopia della forza di trazione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano le cellule mentre applicano forze di trazione alla loro matrice attraverso la microscopia della forza di trazione.

Ciao, sono Yvonne Eons del laboratorio di Margaret ELL del Dipartimento di Fisica e dell'Istituto per la Dinamica Biofisica dell'Università di Chicago. Sono Steven Winter, anch'io del laboratorio Guard. Oggi vorremmo mostrarvi un procedimento per la preparazione di matrici deformabili per la misurazione della contrazione cellulare.

Utilizziamo questi procedimenti nel nostro laboratorio per studiare le reti contrattili di actina e miosina. Cominciamo dunque. Prima dell'attivazione del coverslip, posizionare diversi coverslip di dimensioni 22 per 40 millimetri, tipo 1.5, precedentemente.

Risciacquare con etanolo al 70% in una griglia in acciaio inossidabile in modo che le lamelle siano distanziate e non si tocchino. Lavorando in una cappa chimica, preparare una soluzione di trimetil sililazione al 2% in isopropanolo all'interno di una bacinella di vetro quadrata. Utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere il trimetil sililazione.

Trimeth ossi a causa della reattività con la plastica, immergere completamente i coprioggetti in questa soluzione e incubare per 10 minuti sotto agitazione magnetica nella cappa aspirante. Dopo l'ammollo, lavare i coprioggetti immergendoli in acqua doppio distillata. Cambiare l'acqua quattro volte, dopo l'ultimo cambio.

Consentire 10 minuti di tempo di ammollo con agitazione. Quindi asciugare le lamelle in un incubatore a circa 37 gradi Celsius per 10 minuti. Una volta asciutte, lasciarle raffreddare a temperatura ambiente.

Immergere i coprioggetti in una soluzione di glutaraldeide al 1% in acqua doppio distillata. In una capsula di vetro su un agitatore magnetico per 30 minuti. Assicurarsi di utilizzare una capsula pulita.

In caso contrario, la soluzione potrebbe apparire torbida successivamente. Lavare i coprioggetti con tre cambi di acqua doppio distillata, per 10 minuti ciascuno, sotto agitazione. Successivamente, coprire i coprioggetti con carta d'alluminio per evitare la polvere e farli asciugare a temperatura ambiente.

Una volta asciutti, conservare i coprioggetti in un luogo asciutto e al riparo dalla polvere per un massimo di due mesi. Per preparare il gel di poliacrilamide o PAA, preparare innanzitutto le soluzioni stock di acrilamide bis. Acrilamide Mix partendo da acrilamide al 40% e bis-acrilamide al 2%, come descritto nel protocollo RI.

Depurare la soluzione di acrilamide in una camera a vuoto per 20 minuti. Questo riduce l'ossigeno all'interno del gel, prevenendo la polimerizzazione. Nel frattempo, preparare una soluzione di perossidisolfato di ammonio al 10% o una soluzione PS.

Quindi pulire vetrini microscopici da uno per tre pollici con salviette Rain X per rendere la superficie del vetrino idrofoba. Rimuovere qualsiasi polvere con una salvietta Kim per garantire una superficie del gel liscia. Coprire il vetrino con carta d'alluminio e metterlo da parte.

Quindi rimuovere la soluzione di acrilammide dalla camera a vuoto e aggiungere le perle fluorescenti. Per avviare la polimerizzazione del gel, aggiungere 0,75 microlitri di TM E e 2,5 microlitri di PS al 10%. Mescolare brevemente la soluzione aspirando e dispensando con una pipetta. Successivamente, applicare da 10 a 12 microlitri della soluzione di acrilammide sul vetrino microscopico idrofobico precedentemente preparato.

Posizionare un'ampolla attivata di 22 per 40 millimetri sopra la goccia. La soluzione del gel dovrebbe ricoprire l'intera ampolla. Rimuovere eventuali bolle d'aria che potrebbero formarsi all'interno della soluzione.

Lasciare polimerizzare la soluzione del gel a temperatura ambiente per circa 10 minuti. Una volta polimerizzato, il gel si staccherà dal bordo del vetrino coprioggetto. Utilizzando la punta fine di una pinzetta, rimuovere con attenzione il vetrino coprioggetto dalla superficie del vetrino portaoggetto, mantenendo attaccato il gel.

Immergere il gel in una piastra di Petri contenente acqua bidistillata per mantenere una superficie idratata del gel al fine di cross-linkare la matrice extracellulare o proteina ECM al gel. In primo luogo, preparare aliquote di lavoro da 40 microlitri di sulfur san par sciogliendo la polvere di SULF san par in dimetilsolfossido anidro o DMSO. Successivamente, rimuovere l'acqua bidistillata dalla superficie del gel utilizzando brevemente il nostro spinner per coprioggetti.

Avendo cura di non far seccare il gel immediatamente prima dell'uso. Diluire le aliquote di DMSO di zolfo in acqua doppio-distillata e ricoprire il centro della superficie del gel con circa 200 microlitri. Successivamente esporre la superficie del gel alla luce UV in un forno incrociatore UV.

Dopo l'esposizione ai raggi UV, immergere i coprioggetti in un becher contenente acqua distillata doppia fresca. Rimuovere qualsiasi soluzione dalla superficie del gel utilizzando uno spinner per coprioggetti. Quindi posizionare il param in una capsula di Petri aggiungendo 50 microlitri di fibronectina fredda sul param.

Rovesciare il coprivetrino e posizionare il lato del gel sopra la fibronectina. Lasciare reagire i coprivetrini a temperatura ambiente per uno o due ore oppure a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione in un capo a flusso laminare sterile per colture cellulari.

Posizionare i coprioggetti in piastre per colture cellulari da sei centimetri contenenti PBS per ricoprire i coprioggetti. Lavare accuratamente i coprioggetti con diverse sostituzioni di PBS in condizioni sterili dopo il lavaggio. Sterilizzare i coprioggetti mediante trattamento UV per 30 minuti.

In seguito, incubare le lamelle in un mezzo cellulare per 30-45 minuti prima di seminare le cellule. Successivamente, posizionare una lamella da 22 × 30 millimetri sul supporto superiore per lamelle di una camera per imaging confocale Warner Instruments, utilizzando grasso da vuoto per fissare la lamella in posizione. Posizionare una guarnizione di gomma per la formazione della camera sopra la lamella, consentendo l'accesso ai tubicini in polietilene di ingresso e di uscita.

Questo permetterà una distanza compresa tra 150 e 1000 micron tra il coperchio superiore e il vetrino da 22 per 40 millimetri rivestito di gel, a seconda delle dimensioni della guarnizione utilizzata. Successivamente, caricare le siringhe contenenti il mezzo cellulare caldo sui tubi di ingresso tramite il kit di connessione e verificare che il mezzo fluisca attraverso i tubi e raggiunga il vetrino superiore. Applicare grasso da vuoto sulla base della camera e posizionare un vetrino da 22 per 40 millimetri rivestito di gel con il lato cellulare rivolto verso l'alto.

Applicare il mezzo caldo alle cellule. Posizionare il supporto superiore per coprioggetti sulla base della camera, con le guarnizioni della camera che la separano dal coprioggetti rivestito di gel. Assicurarsi che i perni di posizionamento presenti nella base della camera siano inseriti nei fori di posizionamento del supporto superiore per coprioggetti.

Applicare la piastra di pressione alla base della camera e utilizzare la chiave per la piastra di pressione per avvitare e fissare saldamente la piastra. Controllare il flusso del mezzo attraverso il tubo e la camera per monitorare eventuali perdite all'interno della camera e per eliminare eventuali zone prive di mezzo sulla superficie cellulare.

Applicare la camera per imaging confocale all'adattatore dello stadio situato all'interno del supporto del microscopio per eseguire l'immagine, mediante un microscopio confocale a fluorescenza, della proteina marcata fluorescentemente e delle microsfere fluorescenti incorporate nel substrato gelatinoso, al fine di ottenere un'immagine della posizione delle microsfere non sollecitate all'interno del gel perfuso. Staccare le adesioni cellulari dal gel ed acquisire un'immagine delle microsfere fluorescenti nello stesso campo di imaging in cui le cellule sono state rimosse. Se il protocollo viene seguito correttamente, la superficie del gel risulterà relativamente piatta e liscia, con microsfere fluorescenti distribuite uniformemente in tutto il gel.

La matrice extracellulare può essere visualizzata anche mediante immunofluorescenza per la fibronectina. Se si misura il restringimento del gel nella sede delle adesioni focali, l'acquisizione di immagini del gel e delle cellule deve essere effettuata nel piano ottico confocale delle adesioni focali. Qui, le adesioni focali sono visualizzate nell'esperimento di forza di attrazione in una cellula di osteosarcoma umano o in una cellula U2 OS marcata con GFP pxi.

La contrazione di un gel può essere visualizzata mediante lo spostamento di microsfere fluorescenti incorporate nelle adesioni focali sottostanti. Il confronto tra le posizioni delle microsfere sollecitate in verde e quelle non sollecitate in rosso consente la quantificazione dello spostamento del substrato gelatinoso durante la contrazione. Di seguito è riportato un risultato rappresentativo di una cellula espansa che si stacca dalla superficie del gel a causa della tripsina. Ecco un risultato rappresentativo del confronto tra le posizioni delle microsfere sollecitate e non sollecitate.

L'uso di algoritmi computazionali sofisticati può produrre gli sforzi di trazione associati allo spostamento delle microsfere e al modulo elastico dei gel. Questi sforzi sono visualizzati qui mediante una mappa colorimetrica e vettori, in cui i colori più caldi sulla mappa termica e le frecce più grandi indicano forze maggiori. Vi abbiamo appena mostrato come preparare matrici cedevoli per misurare la contrazione cellulare durante l'esecuzione di questa procedura.

È importante pianificare in anticipo in modo che i passaggi critici nel tempo possano essere eseguiti rapidamente. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.