Name: Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Impara a preparare matrici di poliacrilammide per quantificare la contrazione cellulare mediante microscopia delle forze di trazione. Questo metodo consente di studiare gli effetti della rigidità della matrice extracellulare sul comportamento cellulare.

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Ringraziamo il laboratorio di Ulrich Schwarz per il software di monitoraggio di calcolo utilizzati nella quantificazione delle forze di trazione cellulare (Sabass et al., 2008). Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di carriera Burroughs Wellcome e Pioneer Award NIH direttore (DP10D00354) per ML Gardel e Medical Scientist Premio Nazionale delle Ricerche Servizio (5 T32 GM07281) a SP Winter.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La procedura descritta qui per la configurazione di un microscopio a forza di trazione (TFM) sperimentare, insieme con l&#39;implementazione delle routine di tracciamento computazionale (Sabass et al., 2008), consente per la quantificazione delle forze cellulare con micron scala risoluzione spaziale. Per ottimizzare il protocollo sperimentale, è fondamentale per formare un substrato di gel puro ed uniforme con rivestimento uniforme di legante ECM. Discutiamo potenziali insidie ​​di seguito: <p class="jove_s...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropiltrimetossilano</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide al 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide al 2%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti da 40 nm</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Camera per imaging confocale (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga per coprioggetti</td><td>Fatta in casa</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lampada a ultravioletti CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>Porta campioni in acciaio inossidabile</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)esanoico)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>Idracina idrata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>Periodato di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Collagene</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti (#1.5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di matrici di reclamo per quantificare contrazione cellular

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

Il regolamento di adesione cellulare alla matrice extracellulare (ECM) è essenziale per la migrazione cellulare e rimodellamento ECM. Adesioni focali sono le assemblee macromolecolari che la coppia di F-contrattili actina del citoscheletro per l&#39;ECM. Questo collegamento consente la trasmissione delle forze meccaniche intracellulare attraverso la membrana cellulare al supporto sottostante. Studi recenti hanno dimostrato le proprietà meccaniche della ECM regolare adesione focale e F-actina morfologia oltre a numerosi processi fisiologici, quali la differenziazione cellulare, la divisione, la proliferazione e la migrazione. Pertanto, l&#39;uso di substrati di coltura cellulare è diventato un metodo sempre più diffuso per controllare con precisione e modulare le proprietà meccaniche ECM. Per quantificare le forze di trazione in adesioni focali in una cella aderente, supporti compatibili sono utilizzati in combinazione con imaging ad alta risoluzione e tecniche computazionali in un microscopio chiamato metodo della forza di trazione (TFM). Questa tecnica si basa sulla misurazione della magnitudo locale e la direzione del substrato deformazioni indotte dalla contrazione cellulare. In combinazione con alta risoluzione microscopia a fluorescenza di proteine ​​fluorescenti tag, è possibile correlare l&#39;organizzazione del citoscheletro e rimodellamento con le forze di trazione. Qui vi presentiamo un piano sperimentale dettagliato per la preparazione di due dimensioni, matrici compatibili al fine di creare un substrato di coltura cellulare con un ben caratterizzato, sintonizzabile rigidità meccanica, che è adatto per misurare la contrazione cellulare. Questi protocolli includono la realizzazione di idrogel di poliacrilamide, rivestimento di proteine ​​ECM su gel di tali cellule placcatura in gel, e ad alta risoluzione, microscopia confocale utilizzando una camera di perfusione. Inoltre, mettiamo a disposizione un campione rappresentativo di dati che dimostrino posizione e la grandezza delle forze cellulare utilizzando protocolli citato TFM.

In questo video, dimostriamo le tecniche sperimentali utilizzate per fabbricare compatibile, della matrice extracellulare (ECM) substrati rivestiti adatto per colture cellulari e che sono suscettibili di microscopia a forza di trazione e di osservare gli effetti di rigidità ECM sul comportamento delle cellule.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

La regolazione dell'adesione cellulare alla matrice extracellulare (ECM) è essenziale per la migrazione cellulare e il rimodellamento della ECM. Le adesioni focali sono...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare matrici compliant per modulare e quantificare la contrazione cellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto attivando un cover slip per consentire l'ancoraggio della matrice. Il secondo passaggio della procedura consiste nel polimerizzare un gel di poliacrilamide sul cover slip attivato.Il terzo passaggio della procedura consiste nel seminare le cellule sul gel e permettere loro di aderire. L'ultimo passaggio della procedura è l'acquisizione di immagini del gel per generare dati da analizzare mediante protocolli di microscopia della forza di trazione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come le cellule applichino forze di trazione alla loro matrice attraverso la microscopia della forza di trazione.Ciao, sono Yvonne Eons del laboratorio di Margaret ELL del Dipartimento di Fisica e dell'Istituto per la Dinamica Biofisica dell'Università di Chicago. Sono Steven Winter, anch'io del laboratorio Guard. Oggi vorremmo mostrarvi un procedimento per la preparazione di matrici deformabili per la misurazione della contrazione cellulare.Utilizziamo questi procedimenti nel nostro laboratorio per studiare le reti contrattili

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Descriviamo il metodo di prototipo per la produzione di vetrini al microscopio a fluorescenza rivestite con gelatina per la visualizzazione invadopodia-mediata degradazione della matrice. Tecniche di calcolo utilizzando il software disponibile sono presentati per quantificare i livelli risultanti di proteolisi matrice di singole cellule all'interno di una popolazione mista e per gruppi multicellulari che comprende interi campi microscopici.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Questo video descrive la misurazione della contrazione delle cellule muscolari lisce aortiche (SMC) utilizzando il rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cellula, o ECIS. L'ECIS misura la locomozione delle cellule ed è un metodo affidabile per misurare le contrazioni.

Misurazione della contrazione di SMC in vitro: un metodo non invasivo per valutare la contrazione delle cellule muscolari lisce utilizzando il rilevamento dell'impedenza elettrica cellula-substrato

Questo protocollo descrive l'uso di cantilever silicio microscala come superfici di coltura flessibili per misurare la contrattilità delle cellule muscolari in vitro. Contrazione cellulare provoca cantilever flessione, che può essere misurata, registrata e convertita in letture di forza, fornendo un sistema non invasivo e scalabile per misurare funzione contrattile in vitro.

L'utilizzo di microscala Silicon cantilever per valutare Cellular contrattile Funzione In Vitro

Qui, descriviamo lo sviluppo e l'applicazione di un test di contrazione del gel per valutare la funzione contrattile nelle cellule mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

differenziazione delle cellule è regolata da una serie di fattori microambientali, tra cui entrambe le proprietà composizione della matrice e materiale del substrato. Descriviamo qui una tecnica che utilizza microarrays di cellule in combinazione con una forza di trazione microscopio per valutare sia la differenziazione cellulare e biomeccaniche interazioni cellula-substrato in funzione del contesto microambientali.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Presentiamo un protocollo per valutare gli effetti elettromeccanici dell'attivazione di GtACR1 nei cardiomiociti del coniglio. Forniamo informazioni dettagliate sull'isolamento cellulare, la coltura e la trasduzione adenovirale, e sugli esperimenti funzionali con le tecniche patch-clamp e fibra di carbonio.

Valutazione elettromeccanica dell'attività cardiomiocite ottogeneticamente modulata

Questo documento descrive un metodo basato su colture di espianto per l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche umane primarie e specifiche per il paziente e fibroblasti dermici. Inoltre, viene presentato un nuovo metodo per misurare la contrazione cellulare e la successiva analisi, che può essere utilizzato per studiare le differenze specifiche del paziente in queste cellule.

Isolamento delle cellule muscolari lisce aortiche primarie specifiche del paziente e misurazioni semiquantitative di contrazione in tempo reale in vitro

Questo lavoro presenta un protocollo flessibile per l'utilizzo della tecnologia FLECS (fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces) in formato microwell per una quantificazione semplificata e hands-off delle forze contrattili a singola cellula basata sugli spostamenti visualizzati di micropattern proteici fluorescenti.

Analisi semplificata e ad alta produttività della contrattilità a cella singola utilizzando elastomeri micropatterati

L'analisi dei cambiamenti nella funzione contrattile e nell'integrità cellulare dei cardiomiociti umani derivati da iPSC è di immensa importanza per lo sviluppo di farmaci non clinici. Un sistema ibrido di analisi cellulare a 96 pozzetti affronta entrambi i parametri in tempo reale e in modo fisiologico per risultati affidabili e rilevanti per l'uomo, necessari per una transizione sicura nelle fasi cliniche.

Sistema di analisi delle cellule ibride per valutare i cambiamenti strutturali e contrattili dei cardiomiociti umani derivati da iPSC per la valutazione preclinica del rischio cardiaco

Questo protocollo descrive come misurare la contrattilità nei cardiomiociti primari umani adulti provenienti da cuori di donatori con il sistema MyoBLAZER, una piattaforma affidabile per valutare i cambiamenti della contrattilità indotti da farmaci durante lo sviluppo preclinico.

Misurazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti primari umani adulti isolati

Impara a preparare matrici di poliacrilammide per quantificare la contrazione cellulare mediante microscopia delle forze di trazione. Questo metodo consente di studiare gli effetti della rigidità della matrice extracellulare sul comportamento cellulare.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

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