Name: Produzione di estratto di Chick dellembrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Impara a preparare l'estratto di embrione di pollo da embrioni di 11 giorni per coltivare cellule staminali della cresta neurale murine. Questo protocollo standardizzato garantisce replicabilità e qualità per studi di biologia dello sviluppo.

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Il supporto e la consulenza di Markus Pajtler e Robert Bohrer sono stati preziosi per la visualizzazione di questo protocollo.

Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l&#39;uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l&#39;Università di Duisburg-Essen (Germania). Parte 1: Impostazione (non mostrato in video) PREPARAZIONE MATERIALI E SOLUZIONI (prima di prendere le uova fuori dell&#39;incubatore) <ul><li> Le uova devono essere incubate in un incubatore umidificato per 11 giorni a 37 ° C (100 ° F). </li><li> Etanolo Spray 70%, piastre pulite, precise pinze pulite, 4 ° C (40 ° F) freddo sterile DMEM su ghiaccio e 60 ml siringhe sterili </li><li> 50 mL Provette sterili Corning devono essere riempito a metà con 4 ° C a freddo DMEM per miscelare gli embrioni macerare con un rapporto di 1:1 (massa macerata: DMEM). Non appena le uova vengono portati fuori dal dissezione incubatore di embrioni di pollo deve essere avviato. </li><li> Sterilizzare gli strumenti dissezione in autoclave o il giorno della dissezione, immergere gli strumenti in etanolo al 70% per 20 minuti. </li></ul> Parte 2: Preparazione del embrioni di pollo (dimostrata su Video) <ol><li> Bagnare le uova incubate con uno spray etanolo al 70% per almeno 30 secondi e asciugare accuratamente con asciugamani puliti carta morbida, mentre non scuotere troppo le uova. Nota: Si consiglia di non sezionare più di 60 embrioni di pollo contemporaneamente. </li><li> Aprire le uova con attenzione da lanciasse contro un bordo tagliente ed estrarre l&#39;embrione con cautela, non distruggendo il sacco vitellino e l&#39;embrione stesso pulcino. </li><li> Ricerca per l&#39;inizio del cordone ombelicale in modo rapido ed aprire la confezione trasparente, senza distruggere il sacco vitellino o le navi poco. Poi sezionare il cordone ombelicale con precise pinze pulite. </li><li> Prendete l&#39;embrione fuori dal sacco vitellino. Nota: Gli embrioni devono essere decapitato in fretta (non mostrato nel video). </li><li> Raccogliere gli embrioni in minima quantità di terreno necessario a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: Macerazione delle embrioni di pollo <ol><li> Prendete lo stantuffo di una siringa da 60 ml sterile. </li><li> Trasferimento di circa 10 embrioni in una siringa da 60 ml. </li><li> Mettere lo stantuffo con attenzione nella siringa per non rischiare di perdere materiale macerato. </li><li> Macerare premendo lo stantuffo. </li><li> Raccogliere la massa macerare nel provette preparate corning mezza piena di DMEM ad un rapporto di 1:1 (massa macerata: DMEM). Utilizzando 10 embrioni un volume di circa 25 ml viene prodotto. </li><li> Mettere il composto in uno shaker per 45 minuti a 4 ° C. </li></ol> Parte 4: centrifugazione del embrione di pollo - Sospensione DMEM <ol><li> Trasferire la embrione di pollo - sospensione DMEM nei tubi centrifugazione. </li><li> Aggiungi ialuronidasi sterile ad una concentrazione di 1 mg per 25 mg di embrione. </li><li> Tara i tubi centrifugazione con estrema precisione. Nota: Questa operazione deve essere effettuata con cautela, poiché centrifugazione viene eseguita molto alto G-Force e di danni materiali o centrifuga potrebbe verificarsi se si utilizza tubi squilibrato. Con una elevata precisione di pesatura secondo macchina per quanto riguarda le tre posizioni dopo il punto decimale per tutti i tubi dovrebbero essere ricevuti regolando la quantità mancante con DMEM. </li><li> Ridurre la temperatura della centrifuga a 4 ° C. Nota: Anche il rotore centrifugazione devono essere conservati in una camera di raffreddamento o frigorifero per una notte. </li><li> Centrifugare 6 ore a meno di 180,000 xgx h. Nota: per risultati superiori per quanto riguarda la separazione delle singole fasi uso 266,000 xgx h. Se possibile, utilizzare la regolazione del vuoto. </li></ol> Parte 5: Filtrazione dell&#39;estratto embrione di pollo Dopo la centrifugazione, tre fasi si possono notare: La tomaia fase squallido liquida con frammenti di grasso, la fase liquido limpido in mezzo e il pellet alla base del tubo di centrifugazione. Nota: Shaking o in movimento vivace della miscela deve essere centrifugata assolutamente evitata, in quanto ciò avrebbe distrutto il risultato della fase di centrifugazione, perdendo la fase liquido limpido centrale. Nota: Tutti i passaggi che seguono devono essere eseguite in condizioni sterili con un banco d&#39;aria a flusso laminare: <ol><li> Pipettare la fase chiara liquido in un sistema di filtri con pori di 0,45 micron. Poi accendere la pompa del vuoto collegata. Nota: non toccare il pellet in basso. Ciò porterebbe a una contaminazione di estratto e un blocco del sistema di filtraggio. </li><li> Trasferire la pre-estratto in un sistema di filtri con pori di 0,22 micron e accendere la pompa del vuoto collegata di nuovo. </li><li> L&#39;aliquota raggiunta estrarre embrione di polloin sterili da 15 ml tubi Corning. </li><li> Memorizzare rapidamente le aliquote a -80 ° C (-62 ° F). Nota: L&#39;durare fino a due anni CEE se conservati a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Rao, M. S., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+controlled+in+vitro+differentiation+of+murine+multipotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells.</a> J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).</li>
<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
<li>Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+and+cell+fate+specification+in+premigratory+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Bioessays%22%5BJournal%5D)">Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest.</a> Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).</li>
<li>Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+lineage+specification+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Factors controlling lineage specification in the neural crest.</a> Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).</li>
<li>Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+stem+cells%3A+control+of+neural+crest+cell+fate+and+plasticity+by+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3.</a> Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).</li>
<li>Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+controlled+differentiation+of+neural+crest+stem+cell+lines+using+conditional+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis.</a> Differentiation. 75, 890-891 (2007).</li>
<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 10,11. Oltre alle pubblicazioni precedenti abbiamo qui mostrare le singole fasi diverse del processo più esteso. Questo sostiene lo sperimentatore con dettagli importanti garantendo procedimenti corretti e risultati affidabili. Inoltre, come il processo di dissezione è una parte essenziale di estrazione CEE descriviamo la procedura di presa degli embrioni fuori dal sacco vitellino in ogni dettaglio. Ci sono diversi ...

<table><tbody><tr><td>Uova di pollo incubate per 11 giorni</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disinfettante alcolico in spray</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile (60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi sterili (50; 15 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta sterili</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi tipo IV-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Milipore sterili (0.45; 0.22 &amp;mu;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette sterili (25; 10; 5 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga L5-50</td><td>Rotor tipo Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di estratto di chick dell&#39;embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale murine staminali

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

La cresta neurale nasce dalla neuro-ectoderma durante l&#39;embriogenesi e persiste solo temporaneamente. Primi esperimenti già prova di cellule progenitrici pluripotenti di essere parte integrante della cresta neurale 1. Fenotipicamente, le cellule staminali neurali cresta (NCSC) sono definite dal simultaneamente esprimendo p75 (affine a basso fattore di crescita dei recettori nervosi, LNGFR) e SOX10 durante la loro migrazione dalla cresta neurale 2,3,4,5. Queste cellule staminali possono differenziarsi in cellule muscolari lisce, cellule cromaffini, neuroni e cellule gliali, così come melanociti, cartilagine e osso 6,7,8,9. Per coltivare NCSC in vitro, uno speciale medium cresta neurale delle cellule staminali (NCSCM) è richiesto 10. La parte più complessa del NCSCM è la preparazione di estratto pulcino dell&#39;embrione (CEE) che rappresenta una fonte essenziale di fattori di crescita per il NCSC così come per altri tipi di espianti neurale. Altri ingredienti NCSCM accanto CEE sono disponibili in commercio. Produrre CCE uso di apparecchiature di laboratorio standard è di grande importanza per conoscere i dettagli impegnativo come l&#39;isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi. In questo protocollo si descrivono le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta.

Per coltivare le cellule staminali neurali cresta (NCSC) in vitro, un mezzo speciale (NCSCM) è obbligatorio. Parte essenziale della NCSCM è embrione estratto di pulcino (CEE). Noi qui descrivere le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta, compresi i dettagli come l&#39;isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi.

Produzione di estratto di Chick dell&#39;embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali

La cresta neurale ha origine dal neuroectoderma durante l'embriogenesi e persiste solo temporaneamente. Primi esperimenti hanno già dimostrato la pluripotenza...

Ciao, mi chiamo Annaa del laboratorio della Professoressa Ika Egar del Dipartimento di Oncologia Pediatrica dell'Ospedale Pediatrico Universitario di Esen, Germania. Oggi vi mostreremo un procedimento per la preparazione di estratti di pulcini embrionali prenatali di 11 giorni. Mettere il DMEM sul ghiaccio per raffreddarlo ad almeno quattro gradi Celsius.Utilizziamo DMEM glutammato di GIB co preparato in provette sterili riempiendole a metà. Con il MEM, lavare le uova con etanolo al 70% E utilizzando X che sono state incubate per 11 giorni a 100 gradi Fahrenheit in un incubatore umidificato. Assicurarsi che l'etanolo venga assorbito per almeno 30 secondi.Dopo averlo applicato con cura, asciugare le uova con tovaglioli di carta morbidi. Pulire una piastra di plastica o vetro con etanolo. Aprire le uova.Posizionare con attenzione l'embrione nella piastra. Non danneggiare l'EC o i piccoli vasi. Utilizzare set di aghi da dissezione precisi, puliti e affilati per dissezionare gli embrioni.Prima di tutto, cercare nuovamente il cordone ombelicale. Non danneggiare il yac né alcun piccolo vaso durante la ricerca del cordone ombelicale. Una volta individuato il cordone ombelicale, seguirlo fino alla sua origine e dissezionarlo.Dopo aver aperto l'involucro trasparente sopra l'embrione, estrarre con attenzione l'embrione dal CE senza danneggiarlo. Posizionare gli embrioni in un mezzo essenziale minimo sterile su ghiaccio. Utilizziamo DMEM glutammato della gyp Co. Rimuovere lo stantuffo da una siringa sterile da 60 millilitri.Posizionare circa 10 embrioni alla volta nel siringa. Inserire lo stantuffo nella siringa. Maturare gli embrioni spingendo verso il basso lo stantuffo.Attenzione a non usare troppa pressione, altrimenti si perderà il materiale maturato. Raccogliere gli embrioni maturati nei tubi preparati in rapporto di uno a uno tra embrioni e MEM 10 embrioni. Il volume risultante dovrebbe essere di circa 25 millilitri.Agitare la miscela in rapporto uno a uno di embrioni e MEM per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con attenzione la miscela nei tubi da centrifuga. Aggiungere i giorni di igaluronidasi rile.Utilizziamo i giorni R Hay da testicolo di montone di Sigma. Strappare le provette della centrifuga con una bilancia analitica speciale ad alta precisione. È molto importante prestare attenzione alle tre cifre dopo il punto decimale.Devono essere uguali. In caso contrario, si rischia di avere problemi con la centrifuga a causa dell'alta velocità necessaria per centrifugare la miscela. Se necessario, correggere le differenze aggiungendo con la pipetta la quantità mancante di MEM. Il rotore avrebbe dovuto essere conservato tutta la notte all'interno di un frigorifero o di una camera di raffreddamento per portarlo a quattro gradi Celsius.Le provette per centrifuga devono essere chiuse molto bene. In caso contrario, si rischia di avere problemi a estrarle dal rotore. Dopo la centrifugazione, riempire il rotore con le provette e chiuderlo molto bene in anticipo.Raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius. Utilizzare il vuoto in ogni caso. Attendere finché il rotore non ha raggiunto la velocità finale.Se accade qualcosa di strano, arrestare immediatamente la centrifuga. Premere il pulsante del freno per interrompere la centrifugazione. Questo avviene dopo che un rotore TI I 45 ha funzionato per sei ore a una velocità di 45.000 giri al minuto.Estrarre con attenzione i tubi. Non agitarli assolutamente, poiché ciò potrebbe causare un aumento dello strato liquido superiore torbido all'interno dei tubi. Osservare le tre fasi.In alto si trova il liquido della barchetta con pezzi grassi. Al centro, c'è un liquido limpido e in fondo è possibile vedere il pellet. Prestare molta attenzione nel prelevare la fase chiara dalla parte centrale del tubo.Non toccare assolutamente il pellet, poiché ciò causerebbe contaminazione dell'estratto e ostruzione del sistema di filtrazione. In primo luogo, utilizzare un filtro da 0,45 micrometri collegato a una pompa a vuoto. Nel secondo passaggio, filtrare il liquido ottenuto attraverso un filtro da zero virgola 22 micrometri, anch'esso collegato alla pompa a vuoto. Quindi trasferire l'estratto in provette.Infine, conservare le provette a meno 80 gradi Celsius.

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