Name: Produzione di estratto di Chick dellembrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Impara a preparare l'estratto di embrione di pollo da embrioni di 11 giorni per coltivare cellule staminali della cresta neurale murine. Questo protocollo standardizzato garantisce replicabilità e qualità per studi di biologia dello sviluppo.

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Il supporto e la consulenza di Markus Pajtler e Robert Bohrer sono stati preziosi per la visualizzazione di questo protocollo.

Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l&#39;uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l&#39;Università di Duisburg-Essen (Germania). Parte 1: Impostazione (non mostrato in video) PREPARAZIONE MATERIALI E SOLUZIONI (prima di prendere le uova fuori dell&#39;incubatore) <ul><li> Le uova devono essere incubate in un incubatore umidificato per 11 giorni a 37 ° C (100 ° F). </li><li> Etanolo Spray 70%, piastre pulite, precise pinze pulite, 4 ° C (40 ° F) freddo sterile DMEM su ghiaccio e 60 ml siringhe sterili </li><li> 50 mL Provette sterili Corning devono essere riempito a metà con 4 ° C a freddo DMEM per miscelare gli embrioni macerare con un rapporto di 1:1 (massa macerata: DMEM). Non appena le uova vengono portati fuori dal dissezione incubatore di embrioni di pollo deve essere avviato. </li><li> Sterilizzare gli strumenti dissezione in autoclave o il giorno della dissezione, immergere gli strumenti in etanolo al 70% per 20 minuti. </li></ul> Parte 2: Preparazione del embrioni di pollo (dimostrata su Video) <ol><li> Bagnare le uova incubate con uno spray etanolo al 70% per almeno 30 secondi e asciugare accuratamente con asciugamani puliti carta morbida, mentre non scuotere troppo le uova. Nota: Si consiglia di non sezionare più di 60 embrioni di pollo contemporaneamente. </li><li> Aprire le uova con attenzione da lanciasse contro un bordo tagliente ed estrarre l&#39;embrione con cautela, non distruggendo il sacco vitellino e l&#39;embrione stesso pulcino. </li><li> Ricerca per l&#39;inizio del cordone ombelicale in modo rapido ed aprire la confezione trasparente, senza distruggere il sacco vitellino o le navi poco. Poi sezionare il cordone ombelicale con precise pinze pulite. </li><li> Prendete l&#39;embrione fuori dal sacco vitellino. Nota: Gli embrioni devono essere decapitato in fretta (non mostrato nel video). </li><li> Raccogliere gli embrioni in minima quantità di terreno necessario a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: Macerazione delle embrioni di pollo <ol><li> Prendete lo stantuffo di una siringa da 60 ml sterile. </li><li> Trasferimento di circa 10 embrioni in una siringa da 60 ml. </li><li> Mettere lo stantuffo con attenzione nella siringa per non rischiare di perdere materiale macerato. </li><li> Macerare premendo lo stantuffo. </li><li> Raccogliere la massa macerare nel provette preparate corning mezza piena di DMEM ad un rapporto di 1:1 (massa macerata: DMEM). Utilizzando 10 embrioni un volume di circa 25 ml viene prodotto. </li><li> Mettere il composto in uno shaker per 45 minuti a 4 ° C. </li></ol> Parte 4: centrifugazione del embrione di pollo - Sospensione DMEM <ol><li> Trasferire la embrione di pollo - sospensione DMEM nei tubi centrifugazione. </li><li> Aggiungi ialuronidasi sterile ad una concentrazione di 1 mg per 25 mg di embrione. </li><li> Tara i tubi centrifugazione con estrema precisione. Nota: Questa operazione deve essere effettuata con cautela, poiché centrifugazione viene eseguita molto alto G-Force e di danni materiali o centrifuga potrebbe verificarsi se si utilizza tubi squilibrato. Con una elevata precisione di pesatura secondo macchina per quanto riguarda le tre posizioni dopo il punto decimale per tutti i tubi dovrebbero essere ricevuti regolando la quantità mancante con DMEM. </li><li> Ridurre la temperatura della centrifuga a 4 ° C. Nota: Anche il rotore centrifugazione devono essere conservati in una camera di raffreddamento o frigorifero per una notte. </li><li> Centrifugare 6 ore a meno di 180,000 xgx h. Nota: per risultati superiori per quanto riguarda la separazione delle singole fasi uso 266,000 xgx h. Se possibile, utilizzare la regolazione del vuoto. </li></ol> Parte 5: Filtrazione dell&#39;estratto embrione di pollo Dopo la centrifugazione, tre fasi si possono notare: La tomaia fase squallido liquida con frammenti di grasso, la fase liquido limpido in mezzo e il pellet alla base del tubo di centrifugazione. Nota: Shaking o in movimento vivace della miscela deve essere centrifugata assolutamente evitata, in quanto ciò avrebbe distrutto il risultato della fase di centrifugazione, perdendo la fase liquido limpido centrale. Nota: Tutti i passaggi che seguono devono essere eseguite in condizioni sterili con un banco d&#39;aria a flusso laminare: <ol><li> Pipettare la fase chiara liquido in un sistema di filtri con pori di 0,45 micron. Poi accendere la pompa del vuoto collegata. Nota: non toccare il pellet in basso. Ciò porterebbe a una contaminazione di estratto e un blocco del sistema di filtraggio. </li><li> Trasferire la pre-estratto in un sistema di filtri con pori di 0,22 micron e accendere la pompa del vuoto collegata di nuovo. </li><li> L&#39;aliquota raggiunta estrarre embrione di polloin sterili da 15 ml tubi Corning. </li><li> Memorizzare rapidamente le aliquote a -80 ° C (-62 ° F). Nota: L&#39;durare fino a due anni CEE se conservati a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Rao, M. S., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+controlled+in+vitro+differentiation+of+murine+multipotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells.</a> J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).</li>
<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
<li>Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+and+cell+fate+specification+in+premigratory+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Bioessays%22%5BJournal%5D)">Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest.</a> Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).</li>
<li>Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+lineage+specification+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Factors controlling lineage specification in the neural crest.</a> Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).</li>
<li>Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+stem+cells%3A+control+of+neural+crest+cell+fate+and+plasticity+by+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3.</a> Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).</li>
<li>Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+controlled+differentiation+of+neural+crest+stem+cell+lines+using+conditional+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis.</a> Differentiation. 75, 890-891 (2007).</li>
<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 10,11. Oltre alle pubblicazioni precedenti abbiamo qui mostrare le singole fasi diverse del processo più esteso. Questo sostiene lo sperimentatore con dettagli importanti garantendo procedimenti corretti e risultati affidabili. Inoltre, come il processo di dissezione è una parte essenziale di estrazione CEE descriviamo la procedura di presa degli embrioni fuori dal sacco vitellino in ogni dettaglio. Ci sono diversi ...

<table><tbody><tr><td>Uova di pollo incubate per 11 giorni</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disinfettante alcolico in spray</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile (60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi sterili (50; 15 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta sterili</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi tipo IV-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Milipore sterili (0.45; 0.22 &amp;mu;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette sterili (25; 10; 5 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga L5-50</td><td>Rotor tipo Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di estratto di chick dell&#39;embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale murine staminali

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

La cresta neurale nasce dalla neuro-ectoderma durante l&#39;embriogenesi e persiste solo temporaneamente. Primi esperimenti già prova di cellule progenitrici pluripotenti di essere parte integrante della cresta neurale 1. Fenotipicamente, le cellule staminali neurali cresta (NCSC) sono definite dal simultaneamente esprimendo p75 (affine a basso fattore di crescita dei recettori nervosi, LNGFR) e SOX10 durante la loro migrazione dalla cresta neurale 2,3,4,5. Queste cellule staminali possono differenziarsi in cellule muscolari lisce, cellule cromaffini, neuroni e cellule gliali, così come melanociti, cartilagine e osso 6,7,8,9. Per coltivare NCSC in vitro, uno speciale medium cresta neurale delle cellule staminali (NCSCM) è richiesto 10. La parte più complessa del NCSCM è la preparazione di estratto pulcino dell&#39;embrione (CEE) che rappresenta una fonte essenziale di fattori di crescita per il NCSC così come per altri tipi di espianti neurale. Altri ingredienti NCSCM accanto CEE sono disponibili in commercio. Produrre CCE uso di apparecchiature di laboratorio standard è di grande importanza per conoscere i dettagli impegnativo come l&#39;isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi. In questo protocollo si descrivono le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta.

Per coltivare le cellule staminali neurali cresta (NCSC) in vitro, un mezzo speciale (NCSCM) è obbligatorio. Parte essenziale della NCSCM è embrione estratto di pulcino (CEE). Noi qui descrivere le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta, compresi i dettagli come l&#39;isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi.

Produzione di estratto di Chick dell&#39;embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali

La cresta neurale ha origine dal neuroectoderma durante l'embriogenesi e persiste solo temporaneamente. Primi esperimenti hanno già dimostrato la pluripotenza...

Ciao, mi chiamo Annaa del laboratorio della Professoressa Ika Egar del Dipartimento di Oncologia Pediatrica dell'Ospedale Pediatrico Universitario di Esen, Germania. Oggi vi mostreremo un procedimento per la preparazione di estratti di pulcini embrionali prenatali di 11 giorni. Mettere il DMEM sul ghiaccio per raffreddarlo ad almeno quattro gradi Celsius.Utilizziamo DMEM glutammato di GIB co preparato in provette sterili riempiendole a metà. Con il MEM, lavare le uova con etanolo al 70% E utilizzando X che sono state incubate per 11 giorni a 100 gradi Fahrenheit in un incubatore umidificato. Assicurarsi che l'etanolo venga assorbito per almeno 30 secondi.Dopo averlo applicato con cura, asciugare le uova con tovaglioli di carta morbidi. Pulire una piastra di plastica o vetro con etanolo. Aprire le uova.Posizionare con attenzione l'embrione nella piastra. Non danneggiare l'EC o i piccoli vasi. Utilizzare set di aghi da dissezione precisi, puliti e affilati per dissezionare gli embrioni.Prima di tutto, cercare nuovamente il cordone ombelicale. Non danneggiare il yac né alcun piccolo vaso durante la ricerca del cordone ombelicale. Una volta individuato il cordone ombelicale, seguirlo f

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Questo video descrive il metodo utilizzato per l'isolamento di neuroprecursors dalla corteccia sviluppo embrionale dei topi. Il procedimento per eliminare gli embrioni dall'utero, sezionare il tessuto corticale, e digerire la corteccia cerebrale isolato viene mostrato.

Cultura di cellule precursori staminali neurali del mouse

Induzione neurale è il primo passo nella formazione del cervello. Si tratta di un meccanismo attraverso il quale nodo di Hensen (organizzatore), istruisce tessuti adiacenti ad adottare un destino neurale, cioè di dare origine al sistema nervoso. Questo video dimostra un test per l'induzione neurale in embrione di pollo.

Test di induzione neurale nell&#39;embrione Chick

Isolamento di embrionale cresta neurale dal tubo neurale facilita l'uso...

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

Questo video dimostra un metodo per la generazione in vitro di cellule progenitrici neurali (NPC) da cellule staminali embrionali di topo (mESC). Le mESC vengono coltivate in sospensione per formare corpi embrioidi (EB), che vengono poi guidati a differenziarsi in NPC tramite trattamento con acido retinoico in una coltura aderente.

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Questo video illustra una tecnica per isolare le pieghe neurali craniche dalla regione del mesencefalo degli embrioni di pollo. Presenta un dettagliato processo di dissezione delle pieghe neurali, il loro posizionamento e l'attaccamento su vetrini coprioggetti rivestiti di fibronectina, seguito dall'osservazione della migrazione delle cellule della cresta neurale dalle pieghe neurali.

Isolamento delle pieghe neurali craniche da un embrione di pollo per una coltura di cellule neurali in cresta

Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo per generare progenitori neurali da cellule staminali embrionali utilizzando un metodo monostrato privo di siero. Questi progenitori possono essere utilizzati per derivare tipi di cellule neurali mature o per studiare il processo di specificazione neurale e sono suscettibili di ridimensionamento in formato multipozzetto per lo screening dei composti.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

La transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT) consente ai tumori di diventare invasivi. Per studiare l'EMT, viene descritto un modello in vitro basato su cellule staminali neurali (NSC) privo di siero ed enzimi. Questo sistema standardizzato consente la valutazione quantitativa e qualitativa della migrazione cellulare, dell'espressione genica e proteica. Il modello è adatto per la scoperta di farmaci.

Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Questo protocollo descrive la dissezione e la coltura delle cellule creste neurali craniche dai modelli murini, principalmente per lo studio della migrazione cellulare. Descriviamo le tecniche di imaging dal vivo utilizzate e l'analisi dei cambiamenti di velocità e forma delle cellule.

Dissezione, cultura e analisi delle cellule staminali primarie dal mouse per lo studio della delaminazione e della migrazione delle cellule creste neurali

Questo protocollo versatile descrive l'isolamento delle cellule della cresta neurale premigratoria (NCC) attraverso l'escissione di pieghe neurali craniche da embrioni di pulcino. Dopo la placcatura e l'incubazione, gli NCC migratori emergono dagli espianti di piega neurale, consentendo la valutazione della morfologia cellulare e della migrazione in un ambiente 2D semplificato.

Preparazione e analisi morfologica di colture cellulari di cresta neurale cranica di pulcino

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