JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 4:19 min • February 2nd, 2026
Prendi una piastra di coltura con larve di Caenorhabditis che ospitano i batteri di interesse che colonizzano il loro lumen intestinale.
Il piatto contiene un ceppo batterico noto come cibo. Affamare i vermi così che consumino tutti i batteri e entrino in una fase dormiente.
Aggiungi un substrato e trasferisci i vermi in un tubo.
Centrifuga e scartate il soprantantante.
Aggiungi una soluzione detergente, agita per rimuovere i batteri attaccati alla superficie, centrifuga di nuovo e scarta il surnadante.
Ripeti il lavaggio, poi trasferisci i vermi su una piastra di coltura fresca.
Lascia che il crawling rimuova i batteri alimentari debolmente legati dalla superficie e dal lumen intestinale, mantenendo però i batteri di interesse che colonizzano stabilmente l'intestino.
Ripeti la fase di trasferimento e strisciamento per assicurare la completa rimozione dei batteri alimentari.
Aggiungi il substrato, trasferisci i vermi in un vetro da orologio e seziona per esporre i loro intestini.
Dissezionare gli intestini contenenti i batteri di interesse, raccoglierli in tubi pieni d'acqua e congelarli per un uso futuro.
Per affamare i vermi e ridurre il numero di batteri OP50-1, incubare i nematodi a 20 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Aggiungi 5 millilitri del mezzo M9 alla piastra di vermi recentemente affamati, poi trasferisci il mezzo e i vermi M9 in un tubo centrifuga sterile da 15 millimetri per farli girare a 1.000 volte g per 30 secondi a temperatura ambiente.
Rimuovere il sovrantantante prima di lavare i vermi cinque volte con 10 millilitri di M9 contenente 0,05% di Triton X-100 su un Nutator per 20 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet in 100 microlitri di soluzione e trasferire l'M9 e i vermi su una piastra NGM da 6 centimetri non seminata. Lascia asciugare il piatto mentre i vermi si muovono per 20 minuti per aiutare a rimuovere OP50-1 dalla cuticola e dall'intestino.
Quando la piastra è asciutta, ripeti la procedura aggiungendo 250 microlitri di M9 e trasferendo i vermi su una nuova piastra NGM da 6 centimetri non seminata, per permettere ai vermi di strisciare mentre la piastra si asciuga.
Dopo 20 minuti, aggiungi 250 microlitri dell'M9 alla piastra e trasferisci 100 microlitri dell'M9 insieme ai vermi su un vetro da orizzonte pulito.
Poi decapita i nematodi usando un ago di siringa calibro 26 mentre tieni fermo il verme con un altro ago per siringa calibro 26.
Una volta decapitato, l'intestino, una massa granulare e la gonade trasparente si allontanano naturalmente dal corpo del nematode, quindi si taglia un pezzo dell'intestino esposto e si trasferisce un singolo intestino dissezionato in un tubo PCR da 0,5 millilitri contenente 10 microlitri di acqua sterile. Ripeti la procedura per prelevare intestini di almeno cinque animali diversi tramite tubi PCR.
Congelare i tubi PCR a meno 80 gradi Celsius per almeno 5 minuti. Scongelare i campioni dell'intestino prima di procedere con PCR e sequenziamento per l'identificazione.