Valutazione della permeabilità intestinale in C. elegans dopo l'esposizione batterica

Prendere C. vermi elegans coltivati su piastre agar ricche di nutrienti contenenti E. coli per la condizione di controllo e Pseudomonas aeruginosa per la condizione patogena.

Durante l'incubazione, i vermi si nutrono di batteri che colonizzano il lume intestinale.

Nel controllo, l'epitelio intestinale rimane intatto, mentre le tossine rilasciate dal patogeno causano danni epiteliali.

Lavare i vermi con un tampone e trasferirli su piastre integrate con traccianti fluorescenti e batteri inattivati dal calore come fonte di cibo.

Nel controllo, i traccanti fluorescenti ingeriti rimangono nell'intestino, mentre nei vermi infetti dal patogeno attraversano l'epitelio danneggiato ed entrano nella cavità corporea.

Lava di nuovo i vermi e mettili su piatti freschi. Poi trasferirle su una piastra multipozzetto contenente un fissativo per preservare la struttura cellulare.

Rimuovi il fissativo. Poi aggiungi un supporto per l'imaging.

Osserva usando un sistema di imaging a fluorescenza.

Aumento della fluorescenza nella cavità corporea di P. Vermi esposti a Aeruginosa indicano permeabilità intestinale indotta dal patogeno.

Lavare le larve L4 sincronizzate con l'età con il tampone S e trasferire circa 500 vermi sulle piastre NGM contenenti batteri e sostanze chimiche diverse. Poi, incubare le placche a 20 gradi Celsius per 48 ore.

Preparare le piastre integrate con FITC-dextran mescolando 2 millilitri di E inattivato dal calore. colina con quattro milligrammi di FITC-dextran. Aggiungi 100 microlitri della miscela a ciascuna delle 20 piastre di agar NGM fresche e lascia asciugare le piastre per 1 ora su un banco di laboratorio pulito. Dopo 48 ore di trattamento, lavare i vermi con S-buffer, trasferirli su piastre integrate con FITC-dextran e su piastre NGM senza FITC-dextran, e incubare le placche durante la notte.

Il giorno dopo, lava i vermi con il tampone S e lasciali infilare nella piastra di agar NGM fresca per 1 ora. Aggiungi 50 microlitri di formaldeide al 4% in ciascun pozzo di una piastra nera a 96 pozzi con fondo piatto e trasferisci circa 50 vermi in ciascun pozzo. Dopo 1-2 minuti, rimuovere tutta la formaldeide e aggiungere 100 microlitri di mezzo di montaggio in ogni pozzo.