Misurazione dell'induzione spontanea dei fagi nei batteri lisogeni nel tempo

Prelevare una coltura notturna di un batterio lisogeno, in cui la maggior parte delle cellule ospita DNA fagico dormiente integrato nel loro genoma.

Inocularlo in un mezzo fresco e incubare.

Alcuni batteri subiscono un'induzione spontanea, entrando nel ciclo litico, in cui il DNA del fago viene escisso, replicato e vengono prodotte le proteine virali.

I nuovi fagi infettivi assemblati vengono rilasciati attraverso la lisi cellulare.

Prelevare campioni di coltura a intervalli definiti.

Per contare i lisogeni non indotti vitali, depositare diluizioni seriali di ogni campione su una piastra di agar e incubare.

Conta le colonie per calcolare le unità formanti colonie (UFC).

Per contare i fagi infettivi, depositare le stesse diluizioni su una piastra di agar con antibiotico precedentemente seminata con cellule ospiti indicatori resistenti all'antibiotico. Poiché i lisogeni sono sensibili all'antibiotico, solo gli ospiti resistenti possono crescere.

I fagi infettano e lisano le cellule, formando placche trasparenti.

Conta le placche per calcolare le unità formanti placca (PFU). Un numero inferiore di PFU indica meno eventi di induzione spontanea.

Tracciare le UFC e le PFU nel tempo. Durante la fase esponenziale iniziale della crescita batterica, le PFU sono minime rispetto alle UFC, indicando una induzione fagica spontanea minima.

Per iniziare, preparare colture fresche di lisogeno e di ceppo indicatore inoculando le colture ottenute in notte in 100 millilitri di LB in rapporto di uno a 100. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 giri al minuto.

Per monitorare la crescita del lisogeno, prelevare un campione di un millilitro ogni ora a partire dal momento dell'inoculo per otto ore. Diluire in serie la coltura aggiungendo 100 microlitri in 900 microlitri di mezzo LB. Eseguire vortex alla velocità massima e continuare la serie di diluizioni da 10 alla meno uno a 10 alla meno nove.

Deporre 10 µL della diluizione richiesta su una piastra in agar LB. Lasciare asciugare e incubare a 30 °C per 18-24 ore. Dopo l'incubazione, contare il numero di colonie e calcolare il numero di cellule batteriche vitali utilizzando la formula indicata.

Successivamente, per enumerare le particelle fagiche infettive nel campione temporale, aggiungere 100 microlitri di cellule dell'ospite indicatore in fase logaritmica resistenti alla rifampicina all'agar molle, insieme alla rifampicina. Depositare 10 microlitri di coltura del lisogeno diluita in serie sullo strato di agar inoculato. Lasciare asciugare e incubare a 37 gradi Celsius per 18-24 ore.

Dopo l'incubazione, contare il numero di placche e calcolare le particelle fagiche infettive utilizzando la formula fornita.