Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere dati rappresentativi imparziali all'interno di un campione limitato e di analizzare con precisione la complessa struttura tridimensionale del tessuto. Ciò si ottiene catturando prima fette virtuali di sezioni pancreatiche immunoistocitali, colorate chimicamente. Quindi le fette virtuali vengono quantificate con la macro di fette virtuali IHC nel software di immagine J e i dati vengono analizzati con script scritti per Mathematica.

Successivamente, viene eseguita una ricostruzione 3D delle fette virtuali utilizzando l'immagine J. Il passaggio finale della procedura consiste nell'acquisire una pila di immagini di singole isole utilizzando il software del libro di diapositive e mappare manualmente le pile di immagini in tre dimensioni utilizzando l'investigatore stereo. In definitiva, è possibile ottenere un'architettura precisa degli occhielli con coordinate 3D per ogni cellula dell'occhiello attraverso un metodo combinato di imaging 3D e mappatura manuale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo degli studi sull'obesità e sul diabete, come ad esempio il modo in cui la fisiologia e il percorso delle condizioni fisiologiche influenzano il pancreas, la massa delle cellule beta, la distribuzione degli occhielli e l'architettura.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi o alla terapia dell'obesità e del diabete melite perché una migliore comprensione dei cambiamenti nella massa delle cellule beta faciliterà lo sviluppo e la valutazione degli interventi terapeutici. Sebbene i metodi descritti nel presente studio forniscano specificamente informazioni sull'analisi immunoistochimica dinamica del pancreas, possono essere applicate anche a una serie di altri organismi e tessuti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi dell'analisi assistita dal computer sono difficili da imparare.

A causa della complessità dell'analisi di set di dati così grandi in due e tre dimensioni. Iniziare questa procedura posizionando un vetrino pulito che contiene un'intera sezione di un pancreas immunoistografico colorato chimicamente nel supporto di un microscopio a fluorescenza. Aprire il software di ricerca stereo e visualizzare il campione facendo clic su acquisizione.

E poi l'immagine dal vivo. Determina i livelli di esposizione per ciascun canale utilizzando la finestra dell'istogramma video, che mostra l'intensità della fluorescenza. Nell'esempio, il canale due viene utilizzato per il canale DAP P tre per il canale quattro GFP per RFP, il canale cinque per sci cinque e il canale sei per SCI sette.

Utilizzando la finestra delle impostazioni della fotocamera, regolare il livello di esposizione in modo che l'intensità della fluorescenza diminuisca. All'estremità destra dell'istogramma video, l'immagine può essere messa a fuoco con la rotella di messa a fuoco del microscopio. Prima di creare una fetta virtuale, modellare il contorno del campione facendo clic sullo schermo in un punto lontano dal campione, che segnerà un punto di riferimento.

Quindi fare clic intorno al contorno del campione quando il contorno è completo. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Chiudi contorno per collegare i punti iniziale e finale una volta chiuso il contorno, acquisire una fetta virtuale per il campione selezionando l'acquisizione, quindi acquisire la fetta virtuale. Quando si aprono le opzioni della finestra della sezione virtuale, selezionare l'acquisizione ad alta velocità e disabilitare il manuale.

Messa a fuoco deselezionando la casella accanto a manuale. Salva il file. Calibrare il prefo facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando aggiungi all'elenco dei siti di interesse.

Mettere a fuoco manualmente diverse sezioni casuali nell'anteprima della sezione virtuale Quando sono stati attivati più siti, avviare la sezione virtuale facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionandola. Avviare la fetta virtuale con prefo dopo che la fetta virtuale è stata completata per il primo campione, passare al canale successivo e regolare l'esposizione di conseguenza. Questa procedura viene ripetuta per ciascun canale per eseguire la quantificazione degli occhielli, elaborare le immagini utilizzando una macro J dell'immagine denominata I-H-C-V-S, che prima prepara le immagini caricate per l'analisi e quindi quantifica le caratteristiche degli occhielli come la composizione cellulare.

Le macro I-H-C-V-S suddividono lo stack nei rispettivi canali di colore. Nell'immagine J converte ogni immagine in una maschera in bianco e nero a otto bit. Dopo l'intensità automatica, la soglia e l'aggiunta aritmetica delle immagini dei canali separati in una maschera composita.

L'analisi delle particelle integrata nell'immagine composita identificherà quindi le regioni di interesse o il ROI, escludendo le particelle più piccole di una cella beta. La quantificazione dei ROI. L'uso dell'immagine J produce un foglio di calcolo dei parametri delle celle.

Salva i risultati aggregati in un foglio di calcolo Excel. Memorizzazione di dati quali la circolarità perimetrale dell'area, il diametro del connettore e il centro dell'occhiello per ciascun occhiello, insieme ai numeri corrispondenti etichettati nell'immagine. L'analisi computazionale di questi parametri può essere eseguita come descritto nel protocollo scritto Per rivelare informazioni tra cui la distribuzione degli occhielli e l'analisi della frequenza, eseguire la ricostruzione 3D di fette virtuali eseguendo uno script che converte tutte le due immagini JP nella directory in file TIF, che è il formato utilizzato nella costruzione e quantificazione di stack tridimensionali dalle fette virtuali.

Qui, viene utilizzato uno script chiamato I MJ two two tiff. Copiare lo script nella directory che contiene le due immagini JP. Esegui lo script con la shell Linux digitando dot slash I am JP two two TIFF nella console e quindi premendo invio.

Quando tutte le immagini acquisite sono state convertite da JP due a file TIFF, sono pronte per essere utilizzate per l'analisi nell'immagine J. Utilizzando l'immagine J, aprire tutte le immagini per il primo campione, che in questo caso provengono da un pancreas fetale umano e unirle in una sola selezionando immagine, colore, e quindi unisci i canali. Ripetere questa procedura per ciascuno dei campioni quando tutti i campioni sono stati combinati come immagini singole. Pulisci le immagini selezionando le regioni indesiderate con lo strumento di selezione dei poligoni.

Compilali selezionando modifica, quindi compila. Converti ogni immagine in un'immagine a colori RGB. Infine, crea uno stack di immagini dopo di che possono essere ulteriormente allineate con il plug-in stack reg.

In definitiva, l'unione dei canali e la combinazione delle immagini creano un montaggio 3D di tutti gli occhielli dell'intero pancreas. Per raccogliere le pile di immagini, posizionare l'intero occhiello pancreatico della montatura sotto il microscopio. Applicare acqua se si utilizza una lente dell'obiettivo a immersione in acqua.

Aprire il software dell'album, accedere al controllo di acquisizione e messa a fuoco premendo Ctrl più Maiusc più E nella finestra di controllo della messa a fuoco. Impostare l'obiettivo su 20 volte o 40 volte a seconda delle dimensioni dell'occhiello. Per utilizzare l'oculare del microscopio per individuare gli occhielli, impostare il contenitore su due volte e impostare il set di filtri su uno dell'utente.

Nella finestra di controllo della messa a fuoco, la selezione dell'emissione deve essere impostata su 100%Gli occhi in densità neutra devono essere impostati su un clic GFP ey, quindi aprire il pavimento per visualizzare il campione nel libro delle diapositive, tornare alla finestra di controllo della messa a fuoco e impostare il filtro per fissare. Quindi fare clic su G-F-P-D-S. Utilizzare il joystick per centrare il più possibile l'occhiello nella finestra della fotocamera.

Metti a fuoco a una profondità da qualche parte vicino al centro dell'occhiello dove le cellule possono essere distinte facilmente. Nella finestra di controllo della messa a fuoco, selezionare lo zab. Utilizzare il controllo oscilloscopio per scorrere fino alla profondità superiore dell'occhiello, in cui le caratteristiche possono essere distinte chiaramente, quindi fare clic su Imposta in alto.

Scorrere fino alla parte inferiore dell'occhiello e fare clic su Imposta. In basso fare clic su Vai. Per tornare al punto di riferimento nella finestra di acquisizione, fare clic su Avanzate, quindi su Alterna alla modalità canale.

Impostare il fattore di svuotamento su due volte e il tipo di acquisizione su 3D sul lato destro della finestra, fare clic su Usa posizioni superiore e inferiore e tornare al volume centrale dopo l'acquisizione. Imposta la dimensione del passo su tre. Impostare il set di filtri in modo che risieda sotto la casella del set di filtri.

Selezionare DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-u e SCI five DSU. Per ciascuno di essi, fai clic su Trova migliore in Regola esposizione. Quindi fare clic su test per assicurarsi che l'esposizione selezionata sia adatta.

Fare clic su Avvia per avviare l'acquisizione. Al termine dell'acquisizione, regolare i livelli in base alle esigenze e modificare il colore visualizzato per RFP in bianco. Salva la diapositiva e vai a visualizzare l'esportazione della serie TIFF.

Digita il nome della diapositiva con un trattino alla fine e salvala. Vengono create dozzine di singoli file TIF, quindi può essere utile conservare ogni pila di immagini di occhielli in una cartella separata. Per mappare le pile di immagini, aprire il software dell'investigatore stereo.

Visualizza l'immagine aprendo le pile di immagini nel menu di ridimensionamento dell'immagine. Imposta la distanza tra le immagini a tre micron per correggere la piegatura due volte. Nella diapositiva selezionare l'override del ridimensionamento X e Y e utilizzare un valore specificato per l'origine del ridimensionamento x e Y.

Immettere 0,65 sia per il centro X che per il centro Y e ingrandire l'immagine facendo clic sul pulsante di zoom, quindi al centro dell'ilis di interesse nel mercato della finestra macro almeno una cella. Utilizzando l'apposito marcatore, le cellule beta appariranno verdi. Le celle alfa appariranno rosse e le celle delta appariranno bianche.

Contrassegna le cellule al centro del loro nucleo, che apparirà blu se il campione è stato colorato con DPI usa il marker due per contrassegnare le cellule beta. Marcatore cinque per contrassegnare le cellule alfa e marcatore sei per contrassegnare le cellule delta. Una volta che almeno una cella è stata contrassegnata, visualizza la vista ortogonale utilizzando l'icona nel menu in alto, seleziona Filtro Z e simmetrico.

L'intervallo deve essere impostato su 15.00. A partire da 0.0 Z.Scorri gli occhielli usando la rotellina del mouse e segna ogni cella con l'apposito marcatore, segna ogni cella solo una volta al centro della sua profondità. Al termine della marcatura di ciascuno dei livelli Z, la casella di controllo Filtro Z può essere deselezionata.

Questo mostrerà tutti i marcatori di tutti i livelli Z. Quando tutte le celle sono state contrassegnate, salvare il file come file DAT. Quindi vai alla traccia dell'esportazione dei file.

Salvare la traccia come file TXT. Infine, fare clic su Nuovo file di dati per cancellare l'area di lavoro prima di tentare di mappare nuovi occhielli. La preparazione di fette virtuali da un campione di pancreas colorato immunoistochimicamente consente l'esame delle cellule endocrine alfa, beta e delta nell'intero pancreas insieme come le isole La colorazione immunoistochimica per l'insulina può essere vista in verde, il glucagone in rosso, la somatostatina in bianco e il dap in blu.

Le immagini sono state poi convertite nella maschera a otto bit dopo la soglia automatica. Qui è mostrata l'immagine composita di unione. Tuttavia, la distribuzione degli occhielli tramite slice virtuale consente anche l'analisi individuale in canali separati.

Qui, le viste di ciascun canale sono mostrate per rivelare le cellule delta, le cellule beta e le cellule alfa. Analisi delle particelle con maschera composita che mostra ogni struttura dell'occhiello numerata ed evidenziata in blu. L'analisi delle particelle delle maschere composite viene emessa come una tabella di dati contenente parametri quali l'area di Islas, la circolarità perimetrale e i vari diametri per ogni occhiello rilevato, che hanno ID che corrispondono ai tag numerati sulla maschera composita.

L'analisi su larga scala di queste immagini si traduce nella produzione di istogrammi del numero totale di occhielli e della distribuzione dimensionale, nonché di confronti dettagliati delle aree cellulari alfa, beta e delta. La mappatura degli occhielli e l'analisi matematica della composizione e dell'architettura cellulare possono rivelare un singolo piano focale da una pila di immagini ricostruite in 3D di un occhiello umano caricate in un investigatore stereo. Qui, le cellule beta sono in verde, le cellule alfa in rosso, le cellule delta in bianco e i nuclei in blu.

Dopo la cattura di occhielli distinti, le cellule alfa, beta e delta vengono marcate su vari piani marini, le immagini fluorescenti e i dati delle mappe corrispondenti vengono mostrati per tre diversi piani focali a un intervallo di 10 micron. Una volta che le cellule alfa, beta e delta sono state marcate su vari piani, l'occhiello può essere visualizzato in 3D. Qui è mostrata una ricostruzione 3D dell'occhiello tagliato in un quarto basata sulle coordinate ottenute dalla mappatura degli occhielli.

Inoltre, l'analisi matematica automatizzata degli occhielli mappati può visualizzare la composizione e l'architettura cellulare. Qui viene mostrata la frequenza relativa delle distanze delle cellule cellulari tra due cellule in una singola popolazione cellulare. Viene anche mostrata la frequenza relativa delle distanze delle cellule cellulari tra due diverse popolazioni cellulari.

Sono mostrate anche le probabilità cumulative delle distribuzioni della distanza da cellula a cellula per le celle alfa-alfa, da beta a beta e da delta a delta. Il test di cole OV smirnov o KS può essere eseguito su queste probabilità per ottenere le corrispondenti distanze KS. Una volta padroneggiati, l'imaging e l'analisi su larga scala di un'intera sezione di tessuto possono essere eseguiti in quattro ore.

La ricostruzione 3D di un blocco di tessuto può essere eseguita in 30 minuti. Infine, l'imaging 3D e la mappatura manuale possono essere completati in quattro ore se eseguiti correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante iniziare con una colorazione immunoistochimica di alta qualità delle sezioni.

L'accuratezza dell'analisi successiva dipenderà dai dati grezzi. Inoltre, assicurati che i tuoi computer dispongano di almeno otto gigabyte di RAM per elaborare analisi su larga scala dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori, non solo nel campo dell'obesità e del diabete, ma ampiamente in molti altri campi che utilizzano l'analisi patologica standard.

Può essere particolarmente utile quando la disponibilità di campioni è limitata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere dati rappresentativi imparziali all'interno di un campione di dimensioni limitate utilizzando tecniche standard. La selezione di una sola regione specifica potrebbe non essere rappresentativa dell'intero quadro, come abbiamo dimostrato utilizzando il nostro studio sulla distribuzione degli occhielli pancreatici.