Name: Near Infrared Tomografia ottica di proiezione per la valutazione delle β-cellule Grande Distribuzione in Diabetes Research (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 18 s
Description: Scopri la tomografia ottica di proiezione nel vicino infrarosso per valutare la massa delle β-cellule pancreatiche. Questo metodo computazionale consente l'imaging di campioni più grandi e migliora l'analisi multicanale per la ricerca sul diabete.

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Dr. P. Lindström è riconosciuto per la fornitura di topi ob / ob. J. Lehtonen è riconosciuto per l&#39;assistenza con la produzione video e J. Gilbert aiuto con l&#39;editing. Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti del Diabetes Research Institute Foundation (AP), la Juvenile Diabetes Research Foundation (AP e UA), la Commissione europea (FP-7, convenzione di sovvenzione n.: CP-IP 228933-2) (JS e UA), le Fondazioni Kempe, Università di Umea e il Consiglio svedese della ricerca a UA

1. Preparazione del campione e Scansione 1,1 Preparazione del campione La seguente procedura viene eseguita essenzialmente come descritto in precedenza 7. <ol><li> Raccolto il pancreas. Utilizzare ghiacciata PBS al fine di evitare la degradazione proteolitica. </li><li> Fissare il tessuto nel 4% PFA in PBS in ghiaccio per 2-3 ore. Accertarsi che i lobi sono &quot;sparsi&quot; durante la fissazione. Questo facilita l&#39;identificazione dei punti di riferimento anatomici dopo la ricostruzione. </li><li> Lavare in eccesso di PBS per 30 min. </li><li> Disidratare il pancreas stepwise in metanolo (33, 66%, 100%), 15 min / step. Ciò riduce al minimo la formazione di bolle durante la sbianca (vedere fase 5) e previene la distruzione cellulare durante congelamento-scongelamento (vedere fase 7). </li><li> Incubare il tessuto appena preparato in MeOH: H 2 O 2: DMSO sbianca buffer in un rapporto 02:01:03 a RT per 24 ore per estinguere la fluorescenza tissutale endogena. Per i più grandi campioni, lo scambio di nuove bleachitampone ng e incubare per un altro 24 h. </li><li> Lavare in MeOH eccesso, ON. </li><li> Congelamento-scongelamento per almeno 5 cicli di -80 ° C - RT per facilitare la penetrazione anticorpo. </li><li> Reidratare graduale torna TBST (33, 66%, 100%), 15 min / step. </li><li> Blocco in TBST con 10% di siero (preferibilmente dalla stessa specie in cui si genera l&#39;anticorpo secondario), 5% DMSO e 0,01% Naaz per 12-24 ore a RT </li><li> Incubare con anticorpi primari in tampone bloccante per 48 ore, a temperatura ambiente, si estendono a 72 ore per grandi campioni (anticorpi usati qui sono elencati nella tabella dei reagenti). </li><li> Lavare in TBST eccesso, ON. </li><li> Incubare con anticorpi secondari coniugati fluorescenti per 48 ore, a temperatura ambiente, estendere a 72 ore per i più grandi campioni. </li><li> Lavare in TBST eccesso, ON. </li></ol> 1,2 La procedura seguente descrive come montare il campione in agarosio e allegarlo al supporto personalizzata di esempio fatto (vedi Figura 7) Prima OPT scansione. <ol><li> Separare i lobi splenica, duodenale e gastrica secondo la figura 3A in Hörnblad et al 3. La relazione tra i lobi è ulteriormente chiarita in Hörnblad et al 11. </li><li> Preparare 1,5% (w / v) di agarosio a bassa temperatura di fusione in dH 2 O, filtro, lasciare raffreddare a 37 ° C e lavare il tessuto in dH 2 O per lavare via il detergente e rimuovere bolle prima agarosio-embedding su ghiaccio. </li><li> Tagliare un blocco di agarosio racchiude il campione e lasciato uno spacer cm ~ tra il campione e la base di agarosio. Ritagliare bordi taglienti (≤ 90 °) del blocco agarosio per ridurre dispersione della luce. </li><li> Disidratare il campione stepwise in MeOH (33, 66%, 100%), lasciando il tempo per equilibrare tra ogni passo. Quando il campione affonda è considerato essere equilibrati. </li><li> Cancellare il campione in una soluzione 1:02 di alcol benzilico: Benzyl Benzoate (BABB) fino a che non diventa trasparente. Scambio BABB soluzione e incubare per ulteriori 12 ore. </li><li> Posizionare il campione eliminato nel supporto del campione e fissarlo inserendo due aghi attraverso il distanziatore agarosio attraverso i fori nelle flange del titolare. </li><li> Collocare il campione nello scanner e immergerlo in una vaschetta piena di soluzione BABB compensazione. Quando si confrontano una serie di pancreas stesso ingrandimento dovrebbe essere utilizzato per tutte le scansioni. L&#39;ingrandimento dovrebbe essere ottimizzato per il più grande campione nella serie. </li></ol> 1.3 Posizionamento del campione in AR Il protocollo che segue descrive la procedura per posizionare con precisione un campione utilizzando la COM-AR algoritmo. Questa procedura è applicabile solo quando il ROI include l&#39;intero campione. Per una descrizione dettagliata degli algoritmi, vedere Cheddad et al 2. <ol><li> Acquisire le immagini del campione in due posizioni per il both l&#39;anatomia e canali di segnale. Posizione 1 a 0 ° (associato con l&#39;asse X), mostrano la più grande area di proiezione, e la posizione 2 a 90 ° (associato con l&#39;asse Z). Stiamo utilizzando il canale GFP per visualizzare l&#39;anatomia. </li><li> Applicare l&#39;aspettativa-massimizzazione (EM) algoritmo sulle immagini di anatomia alla soglia del ROI. </li><li> Calcolare i punti COM (ascisse) delle immagini binarie ottenute nella fase 2 sia di 0 ° e 90 ° proiezioni. </li><li> Sovrapporre una linea verticale passante per il punto COM identificato calcolato nella fase 3 a 0 ° e 90 ° immagini del canale di segnale. </li><li> Utilizzare le immagini acquisite nel passaggio 4 come riferimenti per spostare il campione in modo che la linea centrale del campo visivo passa attraverso i punti COM trovati del campione. </li></ol> 1.4 Scansione <ol><li> Regolare il tempo di esposizione per ottenere il massimo rapporto segnale-rumore possibile senza saturazioneTING tutte le aree di proiezione delle immagini. Ripetere l&#39;operazione per tutti i canali da sottoporre a scansione. </li><li> Selezionare il set di filtri per il primo canale di fluorescenza da analizzare. Emissioni da fluorofori λ più brevi possono eccitare fluorofori con più λ e quindi causare foto sbiancamento. Per ridurre al minimo questa possibilità, eseguire la scansione del fluoroforo con λ più lunga eccitazione prima. </li><li> Aprire l&#39;otturatore per illuminare il campione e raccogliere il segnale di fluorescenza su 360 °, ruotando il campione lungo l&#39;asse verticale per ciascun canale. L&#39;angolo di fase utilizzato per il NIR-OPT di installazione è di 0,9 ° e per lo scanner 3001 Bioptonics 0,45 °. </li><li> Selezionare il filtro appropriato per il canale successivo e procedere come sopra. </li></ol> 2. Elaborazione computazionale e la ricostruzione 2,1 post-acquisizione di rilevamento e correzione errori di allineamento (A-valore di accordatura) In tomografia a proiezione, è in generale necessarioassegnare un valore post-allineamento alle sporgenze per mettere a punto la posizione immagini lungo l&#39;asse di rotazione prima ricostruzione. Tuttavia, una aberrazione piccolo angolo della telecamera verso l&#39;asse ottico può causare non uniformi valori A lungo la lunghezza del campione e quindi indurre distorsioni geometriche. Per evitare tali distorsioni, un metodo di calcolo per trovare l&#39;esatta e unificato post-allineamento valore (valore A) durante l&#39;intero campione può essere applicato 2. <ol><li> Utilizzare una trasformata discreta di Fourier per dividere una proiezione del segnale specifico a 0 ° e 180 ° in 8 blocchi altezza pixel e calcolare lo spostamento lungo l&#39;asse x (valore A) tra ogni blocco. </li><li> Applicare una regressione lineare almeno per calcolare l&#39;angolo θ &#39;, che descrive la pendenza dell&#39;asse x-spostamento lungo la lunghezza del campione, e di trovare un punto di rotazione centrale. </li><li> Correggere per disallineamenti durante la scansione ruotando tutti progeZIONI θ &#39;/ 2 in giro per il centro di rotazione. </li></ol> 2,2 equalizzazione Contrasto limitato istogramma adattativo (CLAHE) Per facilitare l&#39;individuazione e la segmentazione di oggetti (isolotti) mostrano segnali molto deboli, che sono a rischio di essere &quot;thresholded fuori&quot; durante la ricostruzione e / o la segmentazione per le valutazioni quantitative, un algoritmo CLAHE può essere applicato alle immagini di proiezione. L&#39;operazione viene eseguita con CLAHE due trasformazioni intensità principali: <ol><li> Il contrasto locale è stimato e allineate ai non sovrapposte blocchi l&#39;immagine proiettata. </li><li> Le intensità sono poi normalizzati in corrispondenza delle zone di confine tra i blocchi tramite interpolazione bilineare. </li></ol> Il nome contrasto limitata riferisce al limite clip, che è impostato per evitare di saturare pixel nell&#39;immagine. In questo protocollo, il MATLAB built-in funzione &quot;adapthisteq&quot; è stato utilizzato e applicato con la c di default<html> labbro limite di 0,01 e una dimensione di porzione di 256. Nota, la dimensione ottimale piastrella deve essere testato empiricamente e possono variare a seconda del campione analizzato. Maggiori dettagli su l&#39;algoritmo e gli esempi si possono trovare in Hörnblad et al 3. Nota: I passaggi sopra elencati di elaborazione di calcolo (tra cui COM-AR, messa a punto A-Valore e CLAHE, vedere 1,3-2,2) si basano su algoritmi standard e vengono eseguiti in MATLAB (Mathworks). 2,3 ricostruzione tomografica e iso-superficie di rendering <ol><li> Utilizzando un filtro retroproiezione algoritmo, le immagini corrette e normalizzato possono ora essere ricostruita con compensazione disallineamenti unificata e requisito minimo per l&#39;ottimizzazione della gamma dinamica. In questo protocollo, tutte le ricostruzioni sono effettuate con il metodo di proiezione filtrata torna disponibile nel software NRecon (Skyscan), versione 1.6.8 (= &quot;_blank&quot;&gt; Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Nota, l&#39;ingrandimento di un oggetto con immagini dipende dalla sua distanza dal punto focale della lente a meno geometria della trave parallela è implementata nella configurazione di imaging. Pertanto, quando l&#39;importazione di un set di dati di proiezione al software NRecon è importante includere l&#39;oggetto corretta distanza di sorgente (mm) e la direzione di rotazione dello scanner (per antioraria ingresso &quot;cc&quot; e per l&#39;ingresso in senso orario &quot;cw&quot;) in accompagnamento file di log, per evitare artefatti fascio a cono indotte durante la ricostruzione. </li><li> Per visualizzare e quantificare la pila di sezioni virtuali ottenuti, generare 3D iso-superfici utilizzando un software di elaborazione delle immagini, come Imaris o Volocity. </li></ol> Isolamento delle isole murine e procedure di trapianto sono stati eseguiti a Cella Dati preclinici di elaborazione del Diabetes Research Institute e Core modello traslazionale secondo protocolli esaminati e approvati dall&#39;Università di Miami cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso. Il comitato etico per la ricerca sugli animali, nel nord della Svezia, ha approvato tutti gli altri esperimenti che coinvolgono animali.

<ol><li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Med.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li>
<li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li>
<li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+pancreas%3A+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).</li>
<li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+imaging+islets%3A+recent+advances+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+islet-infiltrate+interactions+based+on+optical+projection+tomography+assessments+of+the+intact+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054070(2008).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+Three-Dimensional+Imaging+of+the+Insulitis-Induced+Destruction+of+beta-Cells+in+Murine+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+AMP-activated+protein+kinase+alpha1+and+alpha2+from+mouse+pancreatic+beta+cells+and+RIP2.Cre+neurons+suppresses+insulin+release+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo.</a> Diabetologia. 53, 924-936 (2010).</li>
<li>Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+spleen+formation+perturbs+morphogenesis+of+the+gastric+lobe+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas.</a> PLoS One. 6, e21753(2011).</li>
<li>Lindström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+the+Obese-Hyperglycemic+Mice+%28ob%2Fob+Mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+JOURNAL%22%5BJournal%5D)">The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice).</a> The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le tecniche descritte per l&#39;imaging OPT consente l&#39;estrazione di parametri spaziali e quantitativi in ​​tutto il volume del pancreas murino. A causa di limitazioni nella risoluzione ottenibile per questo tipo di immagini si mesoscopica va notato che, come per la maggior parte delle modalità di imaging, più grande è il campione inferiore della risoluzione (Anche se l&#39;uso di una risoluzione CCD superiore dovrebbe aumentare la risoluzione della scansione OPT) . Quindi, per la valutazione dei lobi intatti topo pancreatici, la tecnica al momento non fornisce sola risoluzione cella anche se vicino (circa 15-20 micron) 7. Ancora, per l&#39;estrazione di distribuzione BCM nel pancreas topo protocolli hanno fornito dati che più ben corrispondono a quelli ottenuti dal punto esempio contando morfometria 3,13 Si segnala che, sebbene implementazione del protocollo CLAHE permette di individuare isolotti significativamente più , queste isole sono generalmente più piccole e non contributite sostanzialmente ai complessivi β-cellule volumi. I protocolli immunoistochimici coinvolte sono relativamente lunghe (fino a due settimane), ma le mani reali in tempo per la preparazione dei campioni è breve e quindi la tecnica è adatto per lo studio di grandi coorti di animali 9. Se il potenziale di distribuzioni eterogenee è un punto di riferimento per l&#39;indagine, va sottolineato che occorre prestare attenzione nella procedura relativa fissaggio e montaggio per evitare che il tessuto pancreatico si fissa in senso sfavorevole e un piatto (&quot;stese&quot; ) supporto del tessuto deve essere cercato per agevolare tali valutazioni. Un importante problema quando si esegue OPT COM è che il campione è fissata in corrispondenza dell&#39;asse di rotazione e che non si muove, verticalmente o orizzontalmente, durante la procedura di scansione. Pertanto, è essenziale avere una configurazione meccanica stabile ed un sistema ben funzionante per attaching il campione. Abbiamo risolto il problema con la costruzione di un supporto nuovo (Figura 7). Geometria parallela non era vero per il nostro NIR-OPT o Bioptonics 3001 scanner, che è stato rilevato come spostamento verticale tra la schiena e posizioni anteriori di oggetti periferici nelle immagini registrate proiezione. Regolando l&#39;oggetto a distanza di sorgente nel file di log dello scanner corrispondente (vedi 2.3.1) si potrebbe migliorare sensibilmente la qualità dei nostri dati e correggere le distorsioni geometriche ai bordi più esterni delle immagini di proiezione, che è di particolare importanza quando valutazione più grandi campioni. Nel protocollo attuale, forniamo una proposta di set di filtri che permettono la visualizzazione di tre diversi canali specifici e un canale &quot;anatomia&quot; nelle valutazioni di preparazioni pancreatiche intatti. Ovviamente queste impostazioni può essere modulata per meglio adattarsi alle fluorocromi utilizzati per un determinato studio, anche se, come per tutte le forme di fluorescenzamicroscopia cento, il rischio potenziale del segnale sanguinare-through deve essere attentamente valutato. Lo studio di isolette insulina marcata con fluorocromi eccitati sopra 750 nm non è stato ancora possibile da noi utilizzando la lampada ad alogenuri metallici che il nostro set up utilizza. E &#39;possibile che una telecamera con ancora maggiore efficienza quantica nelle lunghezze d&#39;onda pertinenti in combinazione con fonti alternative di luce (ad esempio diodi laser) potrebbe aumentare il potenziale di NIR-OPT ulteriormente ea permettere l&#39;imaging a lunghezze d&#39;onda ancora più elevati. OPT immagini è una tecnica estremamente versatile per le valutazioni spaziali e quantitative di campione biomedici sul mm cm scala. Anche se i protocolli qui presentati sono stati sviluppati con lo scopo principale del pancreas / diabete di ricerca che dovrebbe essere possibile tradurre la ricerca su altre specie, tipi di campioni e marcatori. Con la possibilità di visualizzare diversi canali distinti in preparazioni pancreatiche intatti, NIR-OPT immagini fLTERIORI ha il potenziale come strumento per valutare la specificità assorbimento di agenti di contrasto destinati non invasivi valutazioni da altre modalità di imaging, purché questi agenti di contrasto possono essere destinate a svolgere anche un fluoroforo rilevabile da OPT.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

L&#39;insulina producono β-cellule sono fondamentali per la capacità del corpo per controllare il glucosio nel sangue omeostasi. Pertanto, le valutazioni di distribuzione del pancreas BCM sono indispensabili per molte aree di ricerca pre-clinica del diabete. Nelle valutazioni dei regimi terapeutici, ad esempio, l&#39;impatto di ablazione genica mirata sulla differenziazione delle cellule del sistema endocrino o su studi di eziologia del diabete in modelli di roditori per la malattia spesso dipendono da tali analisi. Tradizionalmente, questi tipi di valutazioni sono affidati a tempo consumando stereologica approcci che sono difficili da eseguire a causa delle dimensioni e complessa costituzione anatomica del pancreas. La maggior parte di imaging ad alta risoluzione approcci attualmente (tipicamente ottico), non forniscono una profondità sufficiente a consentire la penetrazione di imaging intero pancreas nei roditori. Al contrario, gli approcci di imaging che non si limitano con la loro profondità di penetrazione (tipicamente nucleare) fornire a bassa risoluzione per risolvere la distribuzione completa e BCM sono ostacolatidalla mancanza di mezzi di contrasto adeguati 4,5. Tomografia a proiezione ottica è una modalità di imaging 3D che consente ad alta risoluzione valutazioni di campioni biomedici sulla scala mm a cm 6. Con la presente, le informazioni sulla posizione spaziale e il volume del individuale di insulina esprimere isole di Langerhans possono essere estratte in tutto il volume del pancreas in topi normali e diabetici 3,7-10. Lo scopo di questo studio è di migliorare ulteriormente la capacità di questa tecnica per la valutazione delle β-cellule pancreatiche; loro distribuzione endogena, quando innestato in altri tessuti, la loro relazione con altri costituenti pancreatici (come infiltrarsi tipi cellulari) e in grande preparazioni pancreatiche rispetto al passato. Il vicino infrarosso tomografia ottica di proiezione (NIR-OPT) di installazione In seguito protocolli, uno scanner OPT in base al set up originale descritto da Sharpe <em&gt; 1 et al, atto a imaging nel vicino infrarosso descritto ed utilizzato. Per valutazioni singolo canale del pancreas mouse (es. BCM), SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner può essere utilizzato. Una lampada ad alogenuri metallici che fornisce energia di eccitazione superiore una lampada a mercurio a lunghezze d&#39;onda superiori a 650 nm, fornisce la luce di eccitazione. La luce viene trasferita attraverso una guida di luce liquida. Una utile combinazione di fluorocromi e filtri passa banda per NIR fluorescenza imaging e separazione dei canali sono mostrati in Figura 3. La luce emessa viene rilevata con una telecamera CCD retroilluminato, con alta efficienza quantica nello spettro NIR. La scansione OPT è automatizzata utilizza una piattaforma LabView che controlla la fotocamera e motore passo-passo. Per supportare campioni nella dimensione di pancreas di ratto intatto, uno specchio d&#39;argento rivestito e protetto da una cuvetta grande viene utilizzata. Infine, un porta-campioni che elimina indesiderate movemen verticalits del campione durante la scansione creata.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> 30% H 2 O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyl Alcohol </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> Benzoato di benzile </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> Basso punto di fusione agarosio </td><td> LONZA </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide (PFA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Topo anti-asma-Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6198 </td><td> Anticorpo primario </td></tr><tr><td> Coniglio anti-CD3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7930 </td><td> Anticorpo primario </td></tr><tr><td> Guinea Pig anti-Ins </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> Anticorpo primario </td></tr><tr><td> Donkey contro GP-IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-Rb DyeLight750 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 35570 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-GP Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11.076 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-GP Alexa488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11.008 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Capra antiGP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11.012 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-GP Alexa680 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21.076 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-GP Alexa750 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21.039 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> OPT Skyscan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-Scanner </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Stereomicroscopio </td></tr><tr><td> Leica Obiettivo 0.5x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Camera adattatore 1,0 x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> EL6000 ioduri metallici </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lightsource </td></tr><tr><td> Liquid Light Guide </td&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> Cuvette </td><td> Hellma Analytics </td><td> 6030-OG </td><td> 55 x 55 x 52.5 mm </td></tr><tr><td> Specchio </td><td> Edmund Optics </td><td> F68-334 </td><td> 50 x 50 mm </td></tr><tr><td> Andor Ikon-M </td><td> Andor Tecnologia </td><td> DU934N-BV </td><td> Retroilluminato CCD </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 41021-MZFLIII </td><td> TXR, Alexa-594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 41022-MZFLIII </td><td> IRDye680, Alexa-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 49037-MZFLIII </td><td> Dylight750, Alexa-750 </td></tr><tr><td> ProteinG-Sepharose perline </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0618-01 </td><td> Protein G Sepharose Fast Flow 4 </td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08591 </td><td> Azide di sodio 0,1 M soluzione </td></tr></tbody></table>

near infrared tomografia ottica di proiezione per la valutazione delle β-cellule grande distribuzione in diabetes research

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Adattando OPT per includere la capacità di imaging nel vicino infrarosso (NIR) dello spettro, si illustrano qui la possibilità di corpi immagine più grande di tessuto pancreatico, come il pancreas di ratto, e per aumentare il numero di canali (tipi cellulari) che possono essere studiato in un singolo campione. Approfondiremo l&#39;attuazione di una serie di strumenti di calcolo che forniscono: posizionamento 1 / accurata di un campione (nel nostro caso il pancreas) centro di massa (COM) in corrispondenza dell&#39;asse di rotazione (AR) 2; 2 algoritmi / perfezionati per posta -messa a punto di allineamento che impedisce distorsioni geometriche durante la ricostruzione tomografica 2 e 3 / un protocollo per l&#39;equalizzazione per aumentare l&#39;intensità del segnale ai rapporti di rumore in OPT-based determinazioni BCM 3. Inoltre, si descrive un porta-campioni che minimizza il rischio di movimenti accidentali del campione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Insieme, questi protocolli consentire una valutazione della distribuzione del BCM e OTHcaratteristiche er, da svolgersi in tutto il volume del pancreas intatta o altri organi (ad esempio, in studi di trapianto di isole), con una risoluzione fino al livello dei singoli isolotti di Langerhans.

Nella presente relazione si descrive un protocollo per l&#39;estrazione e l&#39;elaborazione dei dati di calcolo in BCM pancreas roditori (e altri tessuti) con NIR-OPT (Figura 1). Come illustrato in figura 2, autofluorescense tessuto pancreatico dal campione è notevolmente diminuita come previsto nello spettro NIR. Questo porta ad un aumento significativo segnale medio di rumore (S: N) per la valutazione di isolotti di Langerhans insulina marcata. Dagli adattamenti di OPT all&#39;imaging nella parte NIR dello spettro, come qui descritto, almeno tre canali specifici possono essere visualizzati con sufficiente S: rapporto N per consentire una valutazione di tipi cellulari anticorpo marcato in tutto il volume del pancreas murino con distinta canale di separazione (vedi figura 3 e 4). Applicata all&#39;imaging dei processi diabetogeni e / o valutazioni BCM in generale, la tecnica permette quindi la visualizzazione e la quantificazione deiaree insulina positive relative alle circostante e / o interagendo tipi cellulari (vedi Figura 4). Tali valutazioni sono grazie alla maggiore profondità di penetrazione del tessuto ottenuto nella gamma NIR possibile effettuare in campioni molto più grandi rispetto al passato, compreso il pancreas di ratto, che è 3-5 volte più grande rispetto al suo omologo mouse (vedi Figura 5). Indipendentemente dal fatto che le lunghezze d&#39;onda visibili o NIR sono utilizzati, l&#39;attuazione di CLAHE può facilitare notevolmente OPT valutazioni base di BCM durante diverse condizioni genetiche e fisiologiche aumentando la sensibilità di rilevamento della tecnica (vedere Figura 6). Uno schema per il supporto del campione sviluppata è mostrato in Figura 7. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagramma di flusso che descrive i passaggi critici per OPT analisi basate su BCM in murpancreas ine. Il tempo necessario per valutare un pancreas tipico mouse è 13-14 giorni. La maggior parte del tempo viene consumato durante la lavorazione e la colorazione immunoistochimica del tessuto (10 giorni), la compensazione dei tessuti richiede circa 2 giorni, mentre la durata della scansione dipende dal tempo di esposizione necessario (normalmente circa 1 ora). La successiva elaborazione computazionale viene tipicamente eseguita in un giorno. Nota, il protocollo di colorazione relativamente lungo è ideale per l&#39;elaborazione batch di grandi quantità di campioni. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> Figura 2. Segnale rumore rapporto di valutazione della BCM a diverse lunghezze d&#39;onda. Un lobo duodenale pancreas mouse colorati per l&#39;insulina e con un cocktail di anticorpi secondari coniugati con fluorocromo (Alexa 488, 594, 680 e750), è stato utilizzato per determinare S: N coefficienti a lunghezze d&#39;onda diverse. A, Le immagini mostrano il primo fotogramma di proiezione per ogni canale del segnale. B, grafico illustrante la media S: N per ciascun canale di segnale. I coefficienti sono stati determinati come l&#39;intensità isolotto media (basata su 215 isolotti) divisa per l&#39;intensità di fondo (la fluorescenza tessuto endogeno dal tessuto esocrino). C, il grafico mostra S: rapporti di N per le isole individuali in ogni canale normalizzata con l&#39;S: N ottenuti per il canale 594 di Alexa. Un modo ANOVA è stato utilizzato per le analisi statistiche. Livelli di significatività indicati corrispondono agli ** p &lt;0.01. Scala in bar (A) corrisponde a 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> Figura3. Separazione dei canali. A, anticorpi secondari coniugati con coloranti Alexafluor elencati nella tabella sono stati immobilizzati separatamente proteinG-sefarosio perline. B, Le perle fluorescenti sono stati poi integrati a diversi livelli in un fantasma agarosio e ripreso utilizzando filtri indicati. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> Figura 4. OPT imaging basato multicanale nella ricerca sul diabete. A, OPT base iso-superficie di ricostruzione di un pancreas (12 settimane, lobo duodenale) dal diabetico non obeso (NOD) modello per diabete di tipo 1. Il campione è macchiato di insulina (isole β-cellule, pseudo colore blu); muscolatura liscia α-actina (vasi sanguigni, rossi) e CD3 (linfociti T infiltranti, verde). Gli anticorpi secondari utilizzati sono stati corrispondenti, Cy3, IRDye-680 e DyeLight-750, rispettivamente. Ilinserti (A&#39;-A&#39;&#39; &#39;), mostrano i canali dei segnali singoli. B, immagine OPT (blow up vista) di un lobo epatico mouse (lateralis lobus sinistri) innestato con isolotti singenici e ripreso con NIR-OPT due settimane dopo trapianto. Le isole di insulina che esprimono sono pseuodocolored in blu e il muscolo liscio α-actina navi positivi sono in rosso. L&#39;approccio consente valutazioni di trapianto delle isole di distribuzione all&#39;interno della rete vascolare. Barre scala corrisponde a 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> Figura 5. NIR-OPT facilita l&#39;imaging di grandi campioni. A, Iso-superficie di rendering della distribuzione BCM in un pancreas di ratto dal modello Zucker Fatty per diabete di tipo 2 (lobo splenico a 9 mesi), che esemplifica la possibilità di provino immagine sul ratto scala pancreas di NIR-OPT. Come determinatoda questa tecnica il lobo visualizzato è ~ 6 volte più grande (v / v) rispetto al suo omologo mouse e ospita 10.139 insulina esprimere isole di Langerhans cui β-volume cellulare costituisce 1,32% del volume totale lobulare. B, corrispondente alla sezione tomografica linea tratteggiata in (A) illustra che le isole di tutte le profondità del tessuto vengono rilevati. C, Iso-superficie di rendering della distribuzione BCM in un pancreas topo (lobo splenico a 8 settimane) hanno mostrato come riferimento dimensione. Il lobo visualizzata ospita 2.490 isolotti di insulina che esprimono la cui β-cellule del volume costituisce il 0,89% del volume totale lobulare. Il pancreas sono macchiati con GP anti-insulina seguita da Alexa594 capra coniugato anti-GP (mouse) e IRDye 680 Donkey coniugata anti-GP (ratto) anticorpi rispettivamente. I campioni in (AC) sono raffigurati in scala e la barra di scala in (C) corrisponde a 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:cONTENUTO-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg&quot; /&gt; Figura 6. CLAHE facilita la rilevazione di isolotti nel pancreas murino per immagini OPT. AC, Rappresentante iso-superficie le immagini di rendering di un OPT C57Bl / 6 pancreas mouse (lobo splenico a 8 settimane) marcato per l&#39;insulina. Iso-superficie ricostruzioni di immagini OPT stati eseguiti prima (A, verde pseudo colorato) e dopo il protocollo CLAHE stato applicato (B, pseudo colore rosso). C, sovrapposizione dei dati non normalizzati in (A) ed i dati CLAHE trasformati in (B). C&#39;-C &quot;, rappresentativa overlay alto ingrandimento dei non normalizzati (A) e CLAHE trasformati (B) le immagini. Come mostrato dalla presenza di&quot; red-solo &quot;isolotti, lo script CLAHE facilita il rilevamento di piccolo segnale e bassa isolotti intensità. Nell&#39;esempio raffigurato il campione attuale (dopo CLAHE trasformazione) harbored 2419 isolette con un volume di 1,74 mm 3 (numeri in base ai dati corrispondenti proiezione non trasformate 1057 isolette with un volume di 1,77 mm 3). D ed E, i dati di esempio di controllo (D) e l&#39;ob / ob modello murino di diabete di tipo 2 12 (E) a 6 mesi che implementano il protocollo CLAHE. Si noti il ​​massiccio aumento generale delle dimensioni delle isole in ob / ob pancreas (E). In (D) e (E) il contorno pancreas (grigio) è basato sul segnale dal autofluorescenza tessuto. Barra della scala in C è di 500 micron di AC. Barra della scala in C &quot;corrisponde 200 micron in C &#39;e C&#39;&#39;. Scala bar E corrisponde a 1 mm (D) e (E). Immagini di (AC) sono adattato da Hörnblad et al 3 e sono stati generati utilizzando il Bioptonics 3001 scanner. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Supporto del campione per il fissaggio dei campioni OPT. Il campione viene fissato inserendo aghi attraverso il distanziatore agarosio attraverso i fori predisposti nelle flange. Il titolare è incernierato al motore passo-passo tramite unforte magnete situato nella sua base. Questa configurazione omette l&#39;uso di colle instabili e impedisce movimenti indesiderati del campione durante la scansione.

Descriviamo l&#39;adattamento della tomografia ottica di proiezione (OPT)<sup&gt; 1</sup&gt; All&#39;imaging nello spettro dell&#39;infrarosso vicino, e l&#39;attuazione di una serie di strumenti di calcolo. Questi protocolli consentire una valutazione della pancreatica β-cellulare di massa (BCM) in esemplari più grandi, aumentare la capacità multicanale della tecnica e aumentare la qualità dei dati OPT.

Near Infrared Tomografia ottica di proiezione per la valutazione delle β-cellule Grande Distribuzione in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire valutazioni, basate sulla tomografia a proiezione ottica, della distribuzione della massa delle cellule beta in roditori, nel pancreas o in tessuti che ospitano innesti di isolotti. Viene utilizzato lo spettro nell'infrarosso vicino per consentire lo studio di campioni di maggiori dimensioni e per permettere la visualizzazione simultanea di tipi cellulari interagenti o adiacenti. Questo risultato viene ottenuto grazie a un apparato, lo scanner OPT, dotato di una telecamera sensibile all'infrarosso vicino, di una sorgente luminosa ad alta potenza e di appositi set di filtri.Il campione viene prima isolato, fissato e sottoposto a immunoistochimica per gli ormoni, prima di essere incluso in aros e reso otticamente trasparente. Successivamente viene fissato a un supporto per campioni realizzato su misura. Uno strumento di posizionamento semi-automatico viene utilizzato per garantire un corretto centraggio nello scanner dopo la scansione.Le immagini di proiezione vengono sottoposte a post-elaborazione per correggere eventuali artefatti introdotti dal setup meccanico, se necessario. Viene utilizzato un algoritmo di equalizzazione per migliorare il rilevamento di oggetti a bassa intensità. Infine, vengono eseguite segmentazione, visualizzazione e quantificazione mediante software di elaborazione delle immagini.Le cellule beta produttrici di insulina svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi del glucosio nel sangue. Pertanto, le valutazioni spaziali e quantitative della distribuzione della massa delle cellule beta pancreatiche sono essenziali per molte aree della ricerca sul diabete. In questo protocollo video, descriviamo un'adattamento della tomografia ottica a reazione o OPT che consente l'imaging nell'intervallo del vicino infrarosso, permettendo così di visualizzare campioni più grandi di tessuto pancreatico.Permette inoltre di studiare un numero maggiore di tipi cellulari in un singolo campione. Presentiamo inoltre una raccolta di strumenti computazionali sviluppati e ottimizzati per l'OPT nell'immagine del pancreas in generale e per la valutazione della massa delle cellule beta. In particolare, lo spettro del vicino infrarosso rappresenta la finestra più favorevole per la penetrazione della luce nei tessuti.Per ottenere l'accesso a questa parte dello spettro nell'imaging OPT, sono state apportate diverse modifiche allo scanner OPT originale descritto dai colleghi di Sharpen per la valutazione singola di SH della massa delle cellule beta. Nel pancreas del topo, utilizziamo abitualmente lo scanner Omic 3001. La luce di eccitazione viene fornita da una lampada metal halide che fornisce un'energia di eccitazione maggiore rispetto a una lampada a arco di mercurio a lunghezze d'onda di circa 650 nanometri.La luce viene trasferita attraverso un guida luminosa liquida prima di passare attraverso i filtri di eccitazione. I filtri utilizzati in questo protocollo sono mostrati in questa tabella per valutare la separazione dei canali degli anticorpi. Coniugati con diversi coloranti fluorescenti Alexa, sono stati immobilizzati su microsfera proteiche e inglobati in piani separati di un fantoccio in agarosio.Le immagini dimostrano che non vi è alcun passaggio di segnale tra i diversi canali. La luce emessa viene rilevata mediante una telecamera CCD a illuminazione posteriore, con elevata efficienza quantistica nello spettro del vicino infrarosso. Per facilitare l'imaging di campioni più grandi, il campo visivo viene ampliato incorporando uno specchio riflettore più grande e un vete nello scanner.L'installazione visibile sopra il vete è il motore passo-passo che ruota il campione durante la scansione. Un programma basato su LabU controlla la fotocamera e il motore passo-passo durante la scansione, raccogliendo il pancreas in PBS freddo di ghiaccio per evitare la degradazione proteica. Rimuovere con attenzione il grasso e le membrane circostanti che potrebbero interferire con la procedura di colorazione e scansione.Fissare il campione in PFA al 4% a quattro gradi Celsius per due o tre ore. Per evitare di stabilizzare il pancreas in una forma ripiegata, spruzzarlo in una piastra di Petri durante la fissazione prima della colorazione immunoistochimica su preparato intero; lavare il pancreas in eccesso di PBS. La procedura di colorazione è stata descritta in precedenza per la valutazione della distribuzione della massa delle cellule beta.Utilizziamo regolarmente una combinazione di rene di suino, anticorpi primari anti-insulina e anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor per la colorazione. Separare i tre lobi pancreatici principali. Ciò facilita la valutazione comparativa dei lobi e permette la scansione ad ingrandimento maggiore.Risciacquare il pancreas in acqua e immergerlo in agarosio. Per rimuovere eventuali bolle d'aria. Includere il pancreas in agarosio al 1,5% a bassa temperatura di fusione e mantenerlo in osservazione finché non si è stabilizzato.Tagliare l'agarosio bloccando, chiudendo il pancreas. Assicurarsi di lasciare circa un centimetro di spazio tra il campione e la base dell'agarosio. Questo spazio è necessario per fissare il campione al portacampione.Disidratare il pancreas in metanolo al cento per cento prima della chiarificazione ottica in soluzione B clearing, nota anche come Maurice.Clear. Chiarificare il campione fino a renderlo trasparente. Poiché B dissolve la maggior parte delle plastiche, si raccomanda un contenitore in vetro.Cambiare alcune volte la soluzione B per rimuovere tutte le tracce di metanolo. Ora il campione è pronto per la scansione. Durante la scansione, il campione viene trasportato da un magnete fissato a un attuatore passo-passo.Questo permette lo scorrimento del campione lungo il suo asse X e l'asse impostato, facilitando l'allineamento preliminare del campione. Nella maggior parte dei protocolli OPT, il blocco RO viene incollato al portacampione; tuttavia, la maggior parte delle colle dissolve il bulbo, causando movimenti indesiderati del campione. Per questo motivo, è stato progettato un portacampione che evita l'uso di colla.Posizionare il campione trasparente nel supporto e fissarlo inserendo delicatamente due aghi guidati dai fori preforati nelle flange del supporto. Collocare il campione nello scanner ed immergerlo nella soluzione BAB. Qui viene mostrata l'interfaccia utente grafica per il software basato su LabVIEW, utilizzato per controllare il tempo di esposizione della fotocamera, il passo del motore passo-passo e per inserire i parametri sperimentali nei parametri del file di registro, come l'ingrandimento.Le regolazioni focali e la sostituzione dei set di filtri vengono eseguite manualmente sul microscopio. Fermarsi selezionando l'ingrandimento. Illuminare il campione utilizzando il filtro GFP e visualizzare un'immagine di anteprima tramite il software per uso in laboratorio.Ruotare il campione per individuarne la parte più larga; notare che, quando si confronta una serie di pancreas, è necessario utilizzare lo stesso ingrandimento per tutti i campioni. Questo fattore viene impostato in base al campione più grande della serie. Successivamente, passare al set di filtri che visualizza il segnale specifico e regolare la messa a fuoco.Attenzione: il tempo di esposizione deve essere scelto in modo da ottenere il rapporto segnale-rumore più alto possibile senza saturare alcuna parte del campione. Per le valutazioni della massa delle cellule beta pancreatiche, l'intero campione è normalmente la regione di interesse e pertanto il centro di massa del campione (com) deve essere posizionato con precisione sul suo asse di rotazione per ottenere risultati ottimali. L'algoritmo commar calcola il centro di massa del campione e fornisce un'immagine di riferimento che facilita l'allineamento del centro di massa con l'asse di rotazione.Per calcolare le coordinate X, iniziare acquisendo un'istantanea del canale GFP a zero gradi. Quindi cambiare il filtro ed acquisire un'istantanea del segnale specifico nella stessa posizione. Successivamente, applicare un algoritmo di massima verosimiglianza sull'immagine GFP per stabilire la soglia della regione di interesse, applicare un calcolo del centro di massa sull'immagine sogliata, quindi sovrapporre una linea verticale passante per il punto del centro di massa trovato sull'immagine del segnale specifico.Questi passaggi vengono ripetuti per il campione ruotato di 90 gradi al fine di calcolare le coordinate Z. Infine, si utilizzano le immagini acquisite per delimitare i punti del centro di massa come riferimento per spostare il campione in modo che la linea centrale del campo visivo passi attraverso i punti del centro di massa individuati. Al termine della scansione, viene assegnato un valore di allineamento post-scan per regolare con precisione la posizione delle proiezioni lungo l'asse di rotazione prima della ricostruzione.Tuttavia, una piccola aberrazione nell'angolo della telecamera rispetto all'asse ottico può causare distorsioni geometriche durante la ricostruzione. Per evitare tali distorsioni, dopo la scansione di un campione viene utilizzato un allineamento discreto basato su trasformazione libera, noto come FDA. Due proiezioni vengono estratte dal dataset per calcolare l'FDA.Queste proiezioni sono F, il segnale specifico a zero gradi, e G, il segnale specifico a 180 gradi. L'immagine D viene trasposta in modo da corrispondere all'orientamento di F. La funzione DFT viene utilizzata per registrare blocchi di otto pixel di altezza lungo l'intera immagine partendo dalle due proiezioni, e misura gli spostamenti lungo l'asse X per calcolare l'angolo di rotazione necessario, riutilizzando gli stessi parametri per correggere tutti i canali acquisiti tramite la stessa scansione. Ulteriori approfondimenti sui fondamenti degli algoritmi COMMAR e FTA sono disponibili in AL per facilitare la segmentazione di iLet.Viene applicata un'equalizzazione adattativa dell'istogramma con limite di contrasto alle immagini di proiezione. In questo protocollo, è stata utilizzata la funzione integrata di mat adapt hiss egg, applicata con un limite di ritaglio predefinito di 0,01 e un numero di livelli di grigio pari a 256. Tuttavia, la dimensione ottimale del tire deve essere testata empiricamente e può variare in base al campione analizzato. Ulteriori dettagli sull'algoritmo ed esempi possono essere trovati in home blood e shadow.Al passaggio aggiuntivo. I dati allineati, compensati e normalizzati possono ora essere ricostruiti in sezioni tomografiche. Per visualizzare e quantificare la serie di sezioni virtuali ottenute, generare superfici ISO 3D utilizzando un software di elaborazione delle immagini adeguato, come S o velocity.Questa figura mostra una vista di proiezione di un lobo pancreasico colorato per l'insulina con un cocktail di anticorpi secondari coniugati con fluorocromi, inclusi Alexa Fluor 488, 594, 680 e 750. Il rapporto segnale-rumore aumenta notevolmente spostandosi verso la parte dello spettro vicina all'infrarosso. Questo è ulteriormente illustrato in questo grafico, che mostra il rapporto medio segnale-rumore per ogni canale di segnale ottenendo accesso a una porzione più ampia dello spettro.L'imaging vicino alla OPT aumenta la gamma di tipi cellulari che possono essere analizzati in un singolo campione. Questo video mostra il pancreas del modello di diabete di tipo 1 non obeso. Nel video, le isole di Langerhans produttrici di insulina sono in blu, i vasi sanguigni esprimenti l'actina alfa del muscolo liscio sono in rosso e i linfociti T infiltranti marcati con CD3 sono visibili.Il parenchima verde di theacrina in grigio è ricostruito in base alla autofluorescenza tissutale endogena sfruttando la maggiore penetrazione della luce nei tessuti nell'intervallo del vicino infrarosso. L'imaging OT permette valutazioni della distribuzione della massa delle cellule beta in campioni di dimensioni molto maggiori rispetto al passato. Questa figura mostra la ricostruzione della superficie ISO della distribuzione degli isolotti nel lobo splenico di un ratto obeso SER marcato per insulina utilizzando ER erdi sei 80 come anticorpo secondario.Viene mostrata una globulina splenica di topo come riferimento preciso. Queste immagini corrispondono a due diverse ricostruzioni di isosuperficie della distribuzione della massa delle cellule beta in una singola globulina pancreatica, in cui l'acido appare senza l'elaborazione dell'algoritmo in verde e con l'applicazione dell'algoritmo in rosso. Sovrapponendo le due ricostruzioni, si dimostra che l'algoritmo facilita la segmentazione anche per isole con bassa intensità di segnale.Questi appaiono rossi soltanto nell'immagine sovrapposta. Abbiamo appena mostrato come si possa estrarre informazione spaziale e quantitativa sulla massa delle cellule beta in tutto il volume del pancreas e fino al livello dei singoli isolotti di Langerhans. Questi protocolli non sono limitati alla valutazione delle cellule beta o del pancreas in condizioni prossime a quelle di danno; inoltre, gli strumenti computazionali presentati dovrebbero poter essere adattati ad altre aree di ricerca.In bocca al lupo. In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.

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Il protocollo seguente delinea il processo di dissezione del pancreas per l'imaging fetta virtuale, e la successiva quantificazione di tutte le GFP-tagged beta-cellule del pancreas intero.

Quantificazione in situ di cellule beta pancreatiche Messa in topi

Metodi computer-assistita romanzo di grandi appalti e l'analisi di campioni di pancreas immunoistochimiche colorati sono descritte: (1) l'acquisizione di Virtual Fetta di tutta la sezione, (2) analisi di massa di dati su larga scala, (3) Ricostruzione di sezioni 2D virtuale , (4) la mappatura delle isole 3D, e (5) Analisi Matematica.

Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

Questo protocollo permette di identificare fattori che modulano funzionale massa delle cellule beta per trovare potenziali bersagli terapeutici per il trattamento del diabete. Il protocollo consiste in un metodo semplificato per valutare la replicazione delle isole e la funzione delle cellule beta in isole di ratto isolati dopo manipolazione genica con adenovirus.

Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Qui, presentiamo la metodologia per generare e somministrare composti di microsfere di acido poli(lattico-co-glicolico) caricate con interessi (PLGA) a isole di topo intatte in coltura con successiva analisi di immunofluorescenza della proliferazione delle cellule β. Questo metodo è adatto per determinare l'efficacia dei mitogeni a cellule β candidate.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

Isole pancreatiche microvascolare vasomotion regola la distribuzione di sangue dell'isolotto e mantiene la funzione fisiologica delle cellule β dell'isolotto. Questo protocollo descrive l'utilizzo di un monitor Doppler laser per determinare lo stato funzionale di isole pancreatiche vasomotion microvascolare in vivo e a valutare il contributo della microcircolazione di isole pancreatiche per malattie del pancreas.

Laser Doppler: Uno strumento per la misurazione dell'isolotto pancreatico Vasomotion microvascolare In Vivo

Qui, presentiamo un passivo di protocollo per sezioni di pancreas umano immagine in tre dimensioni (3D) utilizzando ottimizzato metodi di compensazione. Questo manoscritto viene illustrato queste procedure per schiarimento ottico passivo seguita da più immunofluorescenza che macchia per identificare gli elementi chiave delle reti neurali autonomiche e sensoriale che innervano isolotti umani.

Immagini 3D ad alta risoluzione della rete Neuro-insulari Pancreas umano

L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.

Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore

In questo protocollo, le isole pancreatiche vengono ricostruite e analizzate utilizzando algoritmi computazionali implementati in un'applicazione multipiattaforma dedicata.

Ricostruzione computazionale delle isole pancreatiche come strumento per l'analisi strutturale e funzionale

Noi dettaglio un nuovo fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) catetere per 2-dimensionale di imaging intravascolare molecolare della biologia della...

In vivo Near Infrared fluorescenza (NIRF) intravascolare Imaging Molecolare della placca infiammatoria, un approccio multimodale per Imaging di aterosclerosi

Scopri la tomografia ottica di proiezione nel vicino infrarosso per valutare la massa delle β-cellule pancreatiche. Questo metodo computazionale consente l'imaging di campioni più grandi e migliora l'analisi multicanale per la ricerca sul diabete.

Near Infrared Tomografia ottica di proiezione per la valutazione delle β-cellule Grande Distribuzione in Diabetes Research

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