iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere una mappa dell'intero trascrittoma dei siti di legame di una proteina legante l'RNA alla risoluzione del singolo nucleotide. Ciò si ottiene mediante irradiazione UV di cellule viventi per reticolare covalentemente proteine e RNA in vivo come secondo passo. La proteina legante l'RNA viene immunopurificata in condizioni rigorose al fine di recuperare i frammenti di RNA reticolati.

Successivamente, la trascrizione inversa genera CDNA che spesso troncano al peptide attaccato, preservando le informazioni sulla posizione del cross-link all'interno dell'RNA Si ottengono risultati che mostrano tutti i siti di legame all'interno del trascrittoma in base al sequenziamento ad alto rendimento della libreria di cDNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dell'RNA, come ad esempio il modo in cui l'interazione di diverse proteine oniche dell'RNA regola l'elaborazione dell'RNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aumentiamo sia le prestazioni che la risoluzione delle nostre mappe di interazioni tra proteine e RNA per iniziare la procedura di reticolazione UV delle cellule di coltura tissutale.

Rimuovere il terreno da una piastra di 10 centimetri di cellule guaritrici. Aggiungere sei millilitri di PBS ghiacciato e posizionare i piatti sul ghiaccio. Una piastra è sufficiente per tre esperimenti.

Rimuovere il coperchio e irradiare le cellule. Una volta a 254 nanometri con 150 millijoule per centimetro quadrato, raccogliere le cellule raschiandole via dalle piastre con un sollevatore di cellule, trasferire due millilitri di sospensione cellulare in ciascuno dei tre microtubi per pellettare le cellule. Girali alla massima velocità per 10 secondi a quattro gradi Celsius.

Quindi rimuovere il chiodo supinato, congelare i pellet di cella su ghiaccio secco e conservare fino a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Aggiungi 100 microlitri di proteine, una perlina dyna per esperimento a un microtubo nuovo. Se si lavora con anticorpi di topo o capra, utilizzare perle di proteina G dyna.

Lavare le perle due volte con il tampone di lisi, che si trova nel protocollo scritto allegato. Risospendere le perle in 100 microlitri di tampone di lisi con due a 10 microgrammi di anticorpi. Ruotare il tubo a temperatura ambiente per 30-60 minuti.

Quindi lavare le perle tre volte con 900 microlitri di tampone di lisi e lasciarle nell'ultimo lavaggio fino a quando non si è pronti a procedere. Per l'immunoprecipitazione Palazzo cellulare di Thor sul ghiaccio. Resus sospeso in un millilitro di tampone di lisi e trasferirlo in una microprovetta da 1,5 millilitri.

Preparare una diluizione da uno a 500 di RNA uno. Quindi aggiungere 10 microlitri insieme a due microlitri di DNA turbo alla cellula. Lisato. Incubare i campioni per esattamente tre minuti a 37 gradi Celsius, agitando a 1.100 rotazioni al minuto, trasferire immediatamente nel ghiaccio.

Quindi centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius e 22.000 volte la gravità per 20 minuti per eliminare il lisato e raccogliere con cura il natante SUP, lasciando circa 50 microlitri di lisato con il pellet per far precipitare le perle in modo immunologico. Rimuovere il tampone di lavaggio, quindi aggiungere i lisati cellulari preparati. Ruotare i campioni per due ore a quattro gradi Celsius.

Scartare l'agente SUP e lavare le perle due volte con 900 microlitri di tampone ad alto contenuto di sale, che si trova nel protocollo scritto allegato. Infine, lavare le perle due volte con 900 microlitri di tampone di lavaggio. Quindi procedi con la defosforilazione e aggiungi un linker alle tre estremità prime dell'RNA.

Per etichettare l'RNA, cinque estremità prime lavorano dietro uno scudo di plexiglass. Rimuovere il supinato dall'ultimo lavaggio della reazione di legatura del linker e risospendere le perle in otto microlitri di miscela PNK calda. Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Togliere il composto PNK caldo e il reus. Sospendi le perline in 20 microlitri di buffer di caricamento della pagina una volta nuova. Quindi incubare il campione su un termomiscelatore a 70 gradi Celsius per 10 minuti.

Posizionare immediatamente il campione su un magnete per far precipitare le perle vuote. Carica i campioni su una nuova pagina dal 4 al 12%. Gel Biss secondo le istruzioni del produttore.

Inoltre, caricare cinque microlitri di un marcatore dimensionale di proteine prestainate. Far funzionare il gel per 50 minuti a 180 volt. Trasferire i complessi proteici di RNA dal gel a una membrana di nitrocellulosa utilizzando l'apparecchio di trasferimento a umido NOVA secondo le istruzioni del produttore.

Dopo il trasferimento, sciacquare la membrana in tampone PBS. Quindi avvolgerlo in un involucro Saran ed esporlo a pellicola a meno 80 gradi Celsius. Eseguire esposizioni per 30 minuti, un'ora e durante la notte.

Successivamente, isolare la regione della membrana in base ai complessi di RNA proteici dagli RNA bassi. Sperimenta usando l'autoradiografia come maschera. Recuperare l'RNA dalla membrana con la digestione della proteinasi K e l'estrazione del cloroformio fenolo.

Trascrivere l'RNA utilizzando uno dei primer AYP per gelificare il CDNA. Mescolare sei microlitri di campione di CDNA con sei microlitri di tampone di caricamento dell'urea due volte TBE. Appena prima di caricare i campioni su un gel.

Riscaldare i campioni a 80 gradi Celsius per tre minuti. Quindi caricare i campioni su un gel di urea prefabbricato al 6% di TBE insieme a un marcatore a basso peso molecolare. Lasciare agire il gel per 40 minuti a 180 volt come descritto dal produttore utilizzando il colorante superiore e i segni sul supporto del gel di plastica per guidare l'escissione.

Tagliare tre bande a 120-200 nucleotidi, 85-120 nucleotidi e 70-85 nucleotidi. Si noti che l'innesco del labbro dell'arco e la sequenza L tre insieme rappresentano 52 nucleotidi della sequenza clip. Aggiungere 400 microlitri di te e schiacciare la fetta di gel in piccoli pezzi.

Utilizzando uno stantuffo da siringa da un millilitro, incubare i pezzi di gel agitandoli a 1.100 rotazioni al minuto per due ore a 37 gradi Celsius. Posizionare due prefiltri in vetro da un centimetro in una colonna spinx CoStar. Trasferire la parte liquida del campione nella colonna di rotazione per un minuto a 13.000 rotazioni al minuto in una provetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 0,5 microlitri di glico blu e 40 microlitri di acetato di sodio pH 5,5. Quindi mescolare il campione. Aggiungere un millilitro di etanolo al 100%.

Mescolare nuovamente e far precipitare il campione durante la notte a meno 20 gradi Celsius. Infine, circolarizzare le molecole di CD NA per collegare la regione dell'adattatore alle cinque estremità prime. Successivamente, la rilinearizzazione e l'amplificazione PCR secondo il protocollo scritto di accompagnamento prima del sequenziamento della libreria di clip oculari, il successo dell'esperimento può essere monitorato in due fasi.

L'autoradiografia del complesso proteico di RNA dopo il trasferimento della membrana e l'immagine su gel dei prodotti PCR nell'autoradiografia dei campioni di RNA bassi, la radioattività diffusa dovrebbe essere vista al di sopra del peso molecolare della proteina per i campioni di RNA elevati. Questa radioattività è focalizzata più vicino al peso molecolare della proteina. Quando non viene utilizzato alcun anticorpo nell'immunoprecipitazione, non deve essere rilevato alcun segnale.

Ulteriori importanti controlli per la specificità dell'immunoprecipitazione emettono irradiazione UVE o utilizzano cellule che non esprimono la proteina di interesse. L'immagine su gel dei prodotti PCR deve dimostrare un intervallo di dimensioni che corrisponde alla frazione CD NA. Si noti che i primer per PCR, P tre Celexa e P cinque Celexa introducono ulteriori 76 nucleotidi rispetto alle dimensioni del CD NA. Se durante l'immunoprecipitazione non viene utilizzato alcun anticorpo, non deve essere rilevato alcun prodotto PCR corrispondente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ciascuno dei 64 passaggi è fondamentale e deve essere eseguito con una precisione del cento per cento. I dati ICL possono essere integrati computazionalmente con saggi funzionali a livello di trascritto. In questo modo, ad esempio, si possono ottenere informazioni sulla regolazione dell'elaborazione dell'RNA in funzione della posizione.

Per l'analisi computazionale dei dati, ci riferiamo alle nostre recenti pubblicazioni in collaborazione con Nicholas KA European Bioinformatics Institute e bla zupan dell'Università di Liana. E ora è il momento di iniziare i vostri esperimenti. Buon divertimento.