Name: iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Impara la tecnica iCLIP per mappare le interazioni proteina-RNA a risoluzione di singolo nucleotide nel trascrittoma. Questo metodo combina UV cross-linking, immunoprecipitazione e sequenziamento ad alta portata.

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Gli autori ringraziano tutti i membri dei laboratori Ule, Luscombe e Zupan di discussione e di assistenza sperimentale. Ringraziamo James Hadfield e Nik Matthews per high-throughput sequencing. Vorremmo far notare che il metodo descritto qui iClip parti diverse fasi con il protocollo clip originale, sviluppato da Kirk Jensen e JU nel laboratorio di Robert Darnell. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca concedere 206726-CLIP per JU e una a lungo termine Scienze Umane Frontiers borsa di studio del programma a JK

1. UV cross-linking di coltura dei tessuti delle cellule <ol><li> Rimuovere il supporto e aggiungere 6 ml ghiacciata PBS alle cellule coltivate in un piatto di 10 cm (sufficiente per tre esperimenti). </li><li> Togliere il coperchio e posizionare sul ghiaccio. Irradiare una volta con 150 mJ / cm 2 a 254 nm. </li><li> Raccogliere le cellule raschiando con un sollevatore di cellulare. </li><li> Trasferire 2 ml di sospensione cellulare a ciascuna delle tre microtubi. Girare alla massima velocità per 10 secondi a 4 ° C per le cellule pellet, quindi rimuovere il surnatante. </li><li> Snap-congelare il pellet cellulare in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso. </li></ol> 2. Tallone preparazione <ol><li> Aggiungere 100 ml di proteina A Dynabeads (Dynal, 100,02) per sperimentare un microtubo fresco (Usa Dynabeads proteina G per un mouse o anticorpi di capra). </li><li> Lavare perline 2x con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; deossicolato di sodio allo 0,5%, 1 / 100 della proteasi cocktail III, Calbiochem). </li><li> Risospendere le sfere in 100 microlitri tampone di lisi con 2-10 mg di anticorpi. </li><li> Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 30-60 min. </li><li> Lavare 3x con 900 microlitri tampone di lisi e lasciare in ultimo lavaggio fino al momento di passare al punto 4.1. </li></ol> 3. Lisi cellulare e parziale digestione dell'RNA <ol><li> Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone di lisi e il trasferimento a 1,5 microprovette ml. </li><li> Preparare un 1 / 500 di diluizione di RNasi I (Ambion, AM2295). Aggiungere 10 microlitri RNasi di diluizione e 2 microlitri DNasi Turbo al lisato cellulare (1 / 500 RNase diluizioni I [bassa RNAsi] sono utilizzati per la preparazione della biblioteca; 1 / 50 diluizioni [alta RNAsi] sono indispensabili per controllare per specificità anticorpale) . </li><li> Incubare i campioni per esattamente 3 minuti a 37 ° C, agitando a 1.100 giri al minuto. Trasferire immediatamente in ghiaccio. </li><li> Spin a 4 ° C e 22.000 g per 20 minuti per eliminare il lisato. Raccogliere accuratamente il sopranatante (lasciare circa 50 microlitri lisato con il pellet). </li></ol> 4. Immunoprecipitazione <ol><li> Rimuovere il tampone di lavaggio dai grani (dal punto 2.5), quindi aggiungere il lisato cellulare (dal punto 3.4). </li><li> Ruotare i campioni per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Eliminare il supernatante e lavare le perle di 2x con 900 microlitri di alto sale del buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 M di NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS; deossicolato 0,5% di sodio). </li><li> Lavare 2x con 900 microlitri di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0.2% Tween-20). </li></ol> 5. Defosforilazione di 3'ends RNA <ol><li> Eliminare il supernatante e risospendere il mix di perle in 20 microlitri PNK (15 microlitri di acqua, 4 microlitri pH 5x PNK 6,5 buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2]; enzima 0,5 microlitri PNK; 0,5 microlitri RNasin [Promega]). </li><li> Incubare per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di buffer lavarsi e lavare 1x con alto contenuto di sale buffer. </li><li> Lavare 2x con tampone di lavaggio. </li></ol> 6. Legatura linker per RNA 3 ' <ol><li> Rimuovere con attenzione il sopranatante e risospendere il mix di perle in 20 microlitri legatura (9 microlitri di acqua, 4 microlitri di buffer legatura 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL 2; 40 ditiotreitolo mm]; 1 ml di RNA ligasi [NEB]; RNasin 0,5 microlitri [Promega]; 1,5 microlitri di pre-adenylated linker L3 [20 mM], 4 microlitri PEG400 [81170, Sigma]). </li><li> Incubare per una notte a 16 ° C. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio e poi lavare 2x con 1 ml di alto sale buffer. </li><li> Lavare 2x con 1 ml di tampone di lavaggio e lasciare in 1 ml di secondo lavaggio. </li></ol> 7. Fine RNA 5 'etichettatura <ol><li> Rimuovere il supernatante e risospendere le sfere in 8 ml di caldo mix PNK (0,4 microlitri PNK [NEB]; 0,8 microlitri 32 P-γ-ATP; 0,8 microlitri di buffer 10x PNK [NEB]; 6 acqua microlitri). </li><li> Incubare per 5 min a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il mix caldo PNK e risospendere le sfere in 20 l tampone di caricamento Nupage 1x (Invitrogen). </li><li> Incubare su un Thermomixer a 70 ° C per 10 min. </li><li> Immediatamente sul posto un magnete per far precipitare le perline vuoto e caricare il surnatante sul gel (vedi punto 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE e trasferimento a membrana <ol><li> Caricare i campioni su un NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Utilizzate da 0,5 l di 1x tampone MOPS esecuzione (Invitrogen). Anche carico 5 ml di un pre-macchiato marcatore proteico dimensioni (ad esempio PAGE righello plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Esegui il gel per 50 min a 180 V. </li><li> Rimuovere la parte anteriore gel ed eliminare i rifiuti solidi (contiene libero radioattivi ATP). </li><li> Trasferire la proteina-RNA complessi dal gel ad una membrana di nitrocellulosa con l'apparecchiatura di trasferimento Novex umido secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen, trasferire 1 ora a 30 V). </li><li> Dopo il trasferimento, lavare la membrana in un tampone PBS, poi avvolgetelo nella pellicola trasparente e di esporla a una pellicola Fuji a -80 ° C (posto un adesivo fluorescente accanto alla membrana per allineare in seguito tche film e la membrana; eseguire esposizioni per 30 minuti, 1 ora e durante la notte). </li></ol> 9. RNA isolamento <ol><li> Isolare la proteina-RNA complessi dal basso RNasi esperimento utilizzando il autoradiograph dal punto 8.5 come una maschera. Tagliare questo pezzo di membrana in diverse fettine e metterli in un microtubo 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 200 microlitri di buffer PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) e 10 microlitri proteinasi K (Roche, 03115828001) ai pezzi membrana. Incubare agitando a 1.100 rpm per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 200 ml di PKurea tampone (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M urea) e incubare per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Raccogliere la soluzione e aggiungere insieme con 400 ml di fenolo / cloroformio (Ambion, 9722) in una fase 2 ml di tubo di blocco Gel pesanti (713-2536, VWR) RNA. </li><li> Incubare per 5 minuti a 30 ° C, agitando a 1.100 giri al minuto. Separare le fasi di filatura per 5 min a 13.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire lo strato acquoso in un nuovo tubo (attenzione a non toccare il gel con la pipetta). Aggiungere 0,5 microlitri glycoblue (Ambion, 9510) e 40 microlitri 3 M di sodio acetato pH 5.5 e mescolare. Poi aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C. </li></ol> 10. Trascrizione inversa <ol><li> Spin per 20 minuti a 15.000 rpm e 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 0,5 ml di etanolo al 80%. </li><li> Risospendere il precipitato in 7,25 microlitri di RNA / Primer Mix (6,25 microlitri di acqua, 0,5 fondo Rclip microlitri [0.5pmol/μl]; 0,5 microlitri dNTP mix [10 mM]). Per ogni esperimento o replicare, utilizzare un primer diverso Rclip contenenti sequenze di codici a barre individuale (v. 14). </li><li> Incubare per 5 minuti a 70 ° C prima di raffreddamento a 25 ° C. </li><li> Aggiungi 2,75 microlitri RT mix (2 microlitri di buffer 5x RT; 0,5 microlitri 0.1M DTT; 0,25 microlitri Apice III della trascrittasi inversa [Invitrogen]). </li><li> Incubare 5 minuti a 25 ° C, 20 min a 42 ° C, 40 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C prima di raffreddamento a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 90 microlitri di buffer TE, 0,5 microlitri glycoblue e 10 microlitri acetato di sodio pH 5.5 e mescolare. Poi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C. </li></ol> 11. Gel purificazione di cDNA <ol><li> Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 6 ml di acqua. </li><li> Aggiungere 6 microlitri 2x TBE-urea tampone di caricamento (Invitrogen). Campioni di calore a 80 ° C per 3 minuti prima di caricare direttamente. </li><li> Caricare i campioni su un 6% prefabbricato TBE-urea gel (Invitrogen) e correre per 40 min a 180 V, come descritto dal produttore. Anche caricare un marker a basso peso molecolare per il taglio successivi (vedi sotto). </li><li> Tagliare tre bande a 120-200 nt (alto), 85-120 nt (media) e 70-85 nt (basso). Usa theupper colorante ei segni sul supporto in plastica gel per guidare l'escissione (vedi figura 3). Si noti che il primer Rclip e la sequenza L3 insieme rappresentano il 52 nt della sequenza CLIP. </li><li> Aggiungere 400 microlitri TE e schiacciare la fetta gel in piccoli pezzi con una siringa da 1 ml stantuffo. Incubare agitando a 1.100 giri al minuto per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Inserire due 1 centimetro di vetro pre-filtro (Whatman, 1.823.010), in una colonna Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Trasferire la parte liquida del campione alla colonna. Spin per 1 minuto a 13.000 giri al minuto in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 0,5 microlitri glycoblue e 40 microlitri di acetato di sodio pH 5.5, poi mescolare il campione. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100%, mescolare ancora e precipitare per tutta la notte a -20 ° C. </li></ol> 12. Legatura di primer per la 5'end del cDNA <ol><li> Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 8 mix legatura microlitri (6,5 microlitri di acqua; 0,8 microlitri 10x CircLigase Buffer II; 0,4 microlitri 50 mM MnCl 2; 0,3 microlitri; Circligase II [Epicentre]) e incubare per 1 ora a 60 ° C. </li><li> Aggiungere 30 microlitri mix di oligo ricottura (26 microlitri di acqua, 3 Buffer FastDigest microlitri [Fermentas]; 1 ml cut_oligo [10 mM]). Incubare per 1 minuto a 95 ° C. Poi diminuire la temperatura ogni 20 sec di 1 ° C fino a 25 ° C si raggiungono. </li><li> Aggiungere 2 microlitri BamHI (Fast Fermentas) e incubare per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 50 microlitri TE e 0,5 microlitri glycoblue e mescolare. Aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio pH 5.5 e mescolare, poi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%. Mescolare di nuovo e precipitare per tutta la notte a -20 ° C. </li></ol> 13. Amplificazione PCR <ol><li> Spin down e lavare i campioni (vedi 10.1), poi risospendere il pellet in 19 microlitri di acqua. </li><li> Preparare la miscela di PCR (19 microlitri cDNA; 1 ml fondo mix P5/P3 Solexa, 10 mM ciascuno, 20 microlitri Accuprime Supermix 1 enzima [Invitrogen]). </li><li> Eseguire il seguente programma di PCR: 94 ° C per 2 minuti, [94 ° C per 15 sec, 65 ° C per 30 secondi, 68 ° C per 30 sec] 25-35 cicli, 68 ° C per 3 minuti, 4 ° C per sempre. </li><li> Mix 8 microlitri prodotto di PCR con 2 ml di tampone 5x carico TBE e caricare su un 6% gel prefabbricati TBE (invitRogen). Macchiare il gel con Sybrgreen I (Invitrogen) e analizzare con un imager gel. </li><li> Il codice a barre nella primer Rclip permettono ai campioni di diversi multiplex prima della presentazione per il sequenziamento throughput elevato. 15 ml di presentare la biblioteca per il sequenziamento e conservare il resto. </li></ol> 14. Linker e primer sequenze DNA linker pre-adenylated 3 ': [Ordiniamo l'adattatore DNA da IDT e poi fare aliquote di 20μM.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="DNA"> 15. Rappresentante dei risultati: Prima del sequenziamento della biblioteca iClip, il successo di questo esperimento può essere monitorato in due fasi: la autoradiograph della proteina-RNA complesso dopo il trasferimento a membrana (passo 8.5) e l'immagine gel dei prodotti di PCR (passo 13,4). Nel autoradiograph del basso-RNasi campioni, la radioattività diffusa deve essere vista al di sopra del peso molecolare della proteina (Figura 2, campione 4). Per l'alta RNAsi campioni, questa radioattività è focalizzata più vicino al peso molecolare della proteina (Figura 2, campione 3). Quando non viene utilizzato anticorpi nel immunoprecipitazione, nessun segnale deve essere rilevato (Figura 2, i campioni 1 e 2). Ulteriori controlli importante per la specificità del immunoprecipitazione omettere irradiazione UV o cellule uso che non esprimono la proteina di interesse 14. L'immagine gel dei prodotti di PCR (passo 13,4) dovrebbe mostrare un intervallo di grandezza che corrisponde alla frazione cDNA (alta, media o bassa) purificata nel passo 11,4 (Figura 4, corsie 4-6). Si noti che la PCR primer P3Solexa e P5Solexa introdurre un ulteriore 76 nt alla dimensione del cDNA. Se nessun anticorpo è utilizzato durante la immunoprecipitazione, nessun prodotto corrispondente PCR dovrebbe essere rilevato (Figura 4, corsie 1-3). Dimero prodotto primer può apparire a circa 140 nt. Per i risultati rappresentativi di high-throughput sequencing e la successiva analisi bioinformatica vedere 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo iClip. Proteina-RNA sono complessi covalentemente reticolato in vivo, utilizzando radiazioni UV (fase 1). La proteina di interesse è purificata con l'RNA legato (passi 2-5). Per consentire la sequenza-specifica adescamento di trascrizione inversa, un adattatore RNA è legatura al 3 'del RNA, mentre il 5' è radioattivo (punti 6 e 7). Reticolato proteina-RNA complessi sono purificati da RNA gratuitamente utilizzando SDS-PAGE e trasferimento a membrana (punto 8). L'RNA è recuperato dalla membrana da digerire le proteine ​​con proteinasi K lasciando un polipeptide rimane alla cross-link nucleotide (punto 9). Trascrizione inversa (RT) tronca il polipeptide rimanente e introduce due regioni adattatore cleavable e sequenze di codici a barre (punto 10). Selezione del formato rimuove senza fondo RT prima circularization. La linearizzazione segue genera modelli adatti per l'amplificazione PCR (passi 11-15). Infine, high-throughput sequencing genera legge in cui le sequenze di codici a barre sono immediatamente seguite da nucleotide ultimo dei cDNA (passo 16). Dal momento che questo nucleotide individua una posizione a monte del reticolato nucleotide, il sito di legame si può dedurre con alta risoluzione. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Autoradiograph di cross-linked hnRNP C-RNA complessi mediante elettroforesi su gel di denaturazione e trasferimento di membrana. hnRNP C-RNA sono stati complessi immuno-purificato da estratti cellulari utilizzando un anticorpo contro hnRNP C (α hnRNP C, campioni 3 e 4). RNA è stato parzialmente digerito con bassa (+) o alto (+ +) concentrazione di RNAsi. Complessi spostando verso l'alto dalla dimensione della proteina (40 kDa) possono essere osservati (campione 4). Il cambiamento è meno pronunciato quando alte concentrazioni di RNasi sono stati utilizzati (esempio 3). Il segnale radioattivo scompare quando non anticorpale è stato utilizzato nel immunoprecipitazione (campioni 1 e 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Schematica 6% TBE-urea gel (Invitrogen) per guidare l'escissione di prodotti iClip cDNA. Il gel viene eseguito per 40 minuti a 180 V che porta ad un modello migratorio riproducibile di cDNA e coloranti (chiaro e blu scuro) nel gel. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare (linea rossa) l'alto (H), medio (M) e bassa (L) frazioni cDNA. Iniziate tagliando a metà del colorante azzurro e immediatamente sopra il marchio sulla cassetta gel di plastica. Dividere le frazioni di media e bassa e tagliare la frazione alta circa 1 cm sopra il colorante azzurro. Usa tagli verticali guidati dalla tasche e il colorante per separare le corsie diverse (in questo esempio 1-4). Il vicolo marcatore (m) può essere colorate e ripreso il controllodimensioni dopo il taglio. Dimensioni frammento sono indicati sulla destra. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. L'analisi di PCR-amplificato librerie iClip cDNA usando elettroforesi su gel. RNA recuperato dalla membrana (figura 1) è stata trascrizione inversa e la dimensione-purificati mediante elettroforesi su gel denaturante (Figura 2). Tre frazioni dimensione del cDNA (alta [H]: 120-200 nt, media [M]: 85-120 nt e bassa [L]: 70-85 nt) sono stati recuperati, circularized, ri-linearizzata e PCR-amplificato. I prodotti di PCR di distribuzione di diverse dimensioni si possono osservare a seguito di diverse dimensioni delle frazioni di ingresso. Dal momento che il primer PCR presenta 76 nt al cDNA, le dimensioni deve essere compresa tra 196-276 nt per alta, nt 161-196 per le medie e 146-161 nt per le frazioni bassa dimensione. I prodotti di PCR sono assenti quando non anticorpale è stato utilizzato per l'immunoprecipitazione (corsie 1-3).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Dato che il protocollo iClip contiene una vasta gamma di reazioni enzimatiche e fasi di purificazione, non è sempre facile identificare un problema quando un esperimento fallisce. Al fine di controllo per la specificità della RNA identificato cross-link siti, uno o più controlli negativi devono essere mantenuti per tutto l&#39;esperimento completo e la successiva analisi computazionale. Questi controlli possono essere il non-anticorpo del campione, la non cross-linked cellule, o immunoprecipitazione da cellule knockout o tessuto. Idealmente, questi esperimenti di controllo non dovrebbe purificare ogni proteina-RNA complessi, e quindi dovrebbe dare nessun segnale sul gel SDS-PAGE, e nessun prodotto rilevabile dopo amplificazione PCR. High-throughput sequencing di queste librerie di controllo dovrebbe restituire sequenze uniche pochissime. Knockdown cellule non sono raccomandati come controllo di sequenziamento, dal momento che le sequenze risultanti sempre conforme ai cross-link siti della stessa proteina, che è purificato dalle cellule atterramento in piccole quantità. Precauzioni devono essere adottate per evitare la contaminazione con prodotti di PCR di precedenti esperimenti. Il modo migliore per minimizzare questo problema è quello di separare spazialmente fasi pre-e post-PCR. Idealmente, l&#39;analisi dei prodotti di PCR e tutti i passi successivi devono essere eseguite in una stanza separata. Inoltre, ogni membro del laboratorio deve utilizzare il proprio set di buffer e altri reagenti. In questo modo, le fonti di contaminazione possono essere più facilmente identificati.

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Per elettroforesi su gel e il trasferimento della membrana si raccomanda l&#39;uso di t ha XCell SureLock ® Mini-Cell e XCell II ™ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), che è compatibile con l&#39;uso dei prefabbricati minigels differenti che sono specificati in tutto il protocollo . Il numero del marchio e l&#39;ordine di tutti i materiali utilizzati è menzionato durante il protocollo. L&#39;elenco degli enzimi utilizzati nel protocollo è riportato nella tabella sottostante. <table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Proteina A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> utilizzare G proteine ​​per gli anticorpi del mouse o di capra </td></tr><tr><td> I RNasi </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> attività può cambiare da lotto a lotto </td></tr><tr><td> T4 RNA ligasi I </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinasi K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Apice III della trascrittasi inversa </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ Supermix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> questo mix PCR dà i risultati migliori nelle nostre mani </td></tr></table>

iclip - trascrittoma livello mappatura delle interazioni proteina-rna con risoluzione individuale nucleotide

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

L&#39;esclusiva composizione e la disposizione spaziale di RNA-binding proteins (RBPs) su una trascrizione guida i diversi aspetti della regolazione post-trascrizionale 1. Quindi, un passo essenziale verso la comprensione regolamento trascrizione a livello molecolare è quello di ottenere informazioni sulla posizione i siti di legame del RBPs 2. Le interazioni proteina-RNA può essere studiato con metodi biochimici, ma questi approcci non affrontano l&#39;RNA vincolante nel suo contesto nativo cellulare. I tentativi iniziali per lo studio delle proteine-RNA complessi nel loro ambiente cellulare impiegata purificazione di affinità o di immunoprecipitazione in combinazione con display differenziale o analisi microarray (RIP-CHIP) 3-5. Questi approcci sono stati inclini a identificare le interazioni indiretti o non fisiologica 6. Al fine di aumentare la specificità e la risoluzione di posizione, una strategia denominata CLIP (UV cross-linking e immunoprecipitazione) è stato introdotto 7,8. CLIP combina UV cross-linking delle proteine ​​e molecole di RNA con sistemi di purificazione rigorosa tra cui gel elettroforesi di poliacrilammide denaturante. In combinazione con tecnologie high-throughput sequencing, CLIP ha dimostrato come un potente strumento per studiare le interazioni proteina-RNA su un genoma scala (indicato come HITS-CLIP e CLIP-ss) 9,10. Recentemente, PAR-clip è stato introdotto che utilizza analoghi ribonucleosidi fotoreattivo per il cross-linking 11,12. Nonostante l&#39;alta specificità dei dati ottenuti, gli esperimenti CLIP spesso generare librerie cDNA di complessità sequenza limitata. Ciò è in parte a causa della quantità limitata di co-purificato l&#39;RNA e le due inefficiente reazioni legatura RNA necessari per la preparazione della biblioteca. Inoltre, le analisi primer extension indicato che molti cDNA troncare prematuramente al reticolato 13 nucleotidi. Tali cDNA troncato vengono persi durante la preparazione del protocollo standard della libreria CLIP. Abbiamo recentemente sviluppato iClip (individuo-nucleotide CLIP risoluzione), che cattura il cDNA troncato sostituendo uno dei inefficiente intermolecolari passi legatura RNA con una più efficiente circularization intramolecolari cDNA (Figura 1) 14. È importante sottolineare che il sequenziamento del cDNA troncato fornisce intuizioni sulla posizione del cross-link del sito ad una risoluzione nucleotide. Abbiamo applicato con successo allo studio iClip hnRNP organizzazione delle particelle C su un genoma scala e valutare il suo ruolo nella regolazione di splicing 14.

La disposizione spaziale di RNA-binding proteins in una trascrizione è un fattore determinante di regolazione post-trascrizionale. Pertanto, abbiamo sviluppato i singoli nucleotide reticolazione UV risoluzione e immunoprecipitazione (iClip) che permette preciso genoma mappatura dei siti di legame di una RNA-binding protein.

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

La composizione unica e la disposizione spaziale delle proteine che legano l'RNA (RBP) su un trascritto guidano i diversi aspetti della regolazione post-trascrizionale...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere una mappa a livello trascrittomico dei siti di legame di una proteina legante l'RNA con risoluzione a singolo nucleotide. Questo risultato si ottiene mediante irradiazione con raggi UV di cellule vive per cross-linkare covalentemente proteine e RNA in vivo come secondo passaggio. La proteina legante l'RNA viene purificata mediante immunoprecipitazione in condizioni stringenti al fine di recuperare i frammenti di RNA cross-linkati.Successivamente, la trascrizione inversa genera cDNA che spesso si troncano a livello del peptide legato, preservando così l'informazione sulla posizione del cross-link all'interno dell'RNA. I risultati ottenuti mostrano tutti i siti di legame all'interno del trascrittoma, basandosi sul sequenziamento ad alto rendimento della libreria di cDNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dell'RNA, come ad esempio come l'interazione tra diverse proteine leganti l'RNA regoli l'elaborazione dell'RNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è che aumentiamo sia le prestazioni sia la risoluzione delle nostre mappe su scala trascrittoma delle interazioni proteina-RNA. Per iniziare la procedura di cross-linking mediante UV su cellule in coltura. Rimuovere il mezzo da una piastra di cellule healer da 10 centimetri. Aggiungere sei millilitri di PBS ghiacciato e posizionare le piastre sul ghiaccio. Una piastra è sufficiente per tre esperimenti.Rimuovere il coperchio e irradiare le cellule. Una volta a 254 nanometri con 150 millijoule per centimetro quadrato, raccogliere le cellule staccandole dalle piastre con un cell lifter e trasferire due millilitri di sospensione cellulare in ciascuna di tre microprovette per ottenere il pellet cellulare. Centrifugare a velocità massima per 10 secondi a quattro gradi Celsius.Quindi rimuovere il tappo a vite, congelare i pellet cellulari su ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Aggiungere 100 microlitri di proteina, un dyna bead per esperimento, in una nuova provetta microcentrifuga. Se si lavora con anticorpi di topo o di capra, utilizzare dyna beads con proteina G.Lavare le perle due volte con il buffer di lisi, disponibile nel protocollo scritto allegato. Risospendere le perle in 100 microlitri di buffer di lisi con due-cinque microgrammi di anticorpo. Ruotare il tubo a temperatura ambiente per 30-60 minuti.Quindi lavare le perle tre volte con 900 microlitri di buffer di lisi e lasciarle nell'ultimo lavaggio fino al momento dell'utilizzo. Per l'immunoprecipitazione, mantenere la cellula Thor palazzo sul ghiaccio. Risospendere in un millilitro di buffer di lisi e trasferire in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.Preparare un'analisi da uno a 500 di RNAs uno. Quindi aggiungere 10 microlitri insieme a due microlitri di turbo DNAs al lisato cellulare. Incubare i campioni esattamente per tre minuti a 37 gradi Celsius, agitando a 1.100 rotazioni al minuto, quindi trasferire immediatamente sul ghiaccio.Quindi centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius e 22.000 ×g per 20 minuti per chiarificare il lisato; raccogliere con attenzione il sopernatante, lasciando circa 50 microlitri di lisato con il pellet. Rimuovere il buffer di lavaggio, quindi aggiungere i lisati cellulari preparati. Incubare i campioni in rotazione per due ore a quattro gradi Celsius.Scartare l'agente SUP e lavare le perle due volte con 900 microlitri di tampone ad alto contenuto salino, disponibile nel protocollo scritto allegato. Infine, lavare le perle due volte con 900 microlitri di tampone di lavaggio. Procedere quindi alla de fosforilazione e aggiungere un linker alle estremità tre primi dell'RNA.Per etichettare le estremità 5' dell'RNA lavorando dietro uno schermo in plexiglass. Rimuovere il soprannatante dall'ultimo lavaggio della reazione di ligazione del linker e risospendere le perle in otto microlitri di mix caldo di PNK. Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la miscela calda di PNK e riutilizzarla. Sospendere le perle in 20 microlitri di tampone di caricamento new page una volta. Successivamente, incubare il campione in un termomixer a 70 gradi Celsius per 10 minuti.Posizionare immediatamente il campione su un magnete per precipitare le perle vuote. Caricare i campioni su un gel Biss di nuova pagina da 4 a 12% seguendo le istruzioni del produttore.Inoltre, caricare cinque microlitri di un marcatore proteico precolorato di dimensioni note. Eseguire l'elettroforesi per 50 minuti a 180 volt. Trasferire i complessi proteina-RNA dal gel su una membrana di nitrocellulosa utilizzando l'apparato di trasferimento umido NOVA seguendo le istruzioni del produttore.Dopo il trasferimento, lavare la membrana in tampone PBS. Quindi avvolgerla nella pellicola trasparente e esporla su pellicola a meno 80 gradi Celsius. Effettuare esposizioni di 30 minuti, un'ora e tutta la notte.Successivamente, isolare la regione della membrana contenente i complessi proteina-RNA a partire dagli RNA a basso peso molecolare. Eseguire l'esperimento utilizzando l'autoradiografia come maschera. Recuperare l'RNA dalla membrana mediante digestione con proteinasi K ed estrazione con fenolo-cloroformio.Trascrivere al contrario l'RNA utilizzando uno dei primer AYP per purificare il CDNA in gel. Mescolare sei microlitri di campione di CDNA con sei microlitri di buffer di caricamento al due volte TBE-urea. Immediatamente prima di caricare i campioni su un gel.Riscaldare i campioni a 80 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, caricare i campioni su un gel preformato di urea 6%TBE insieme a un marcatore di peso molecolare basso. Far correre il gel per 40 minuti a 180 volt come descritto dal produttore, utilizzando il colorante superiore e i segni sul supporto di plastica del gel per guidare l'escissione.Tagliare tre bande a 120-200 nucleotidi, 85-120 nucleotidi e 70-85 nucleotidi. Si noti che il primer arc lip e la sequenza L tre insieme costituiscono 52 nucleotidi della sequenza clip. Aggiungere 400 microlitri di te e frantumare il frammento di gel in piccoli pezzi.Utilizzando lo stantuffo di una siringa da un millilitro, incubare i pezzetti di gel con agitazione a 1.100 giri al minuto per due ore a 37 gradi Celsius. Posizionare due prefiltri in vetro di un centimetro in una colonna CoStar SpinX. Trasferire la frazione liquida del campione nella colonna e centrifugare per un minuto a 13.000 giri al minuto in un tubo da 1,5 millilitri.Aggiungere 0,5 microlitri di glyco blue e 40 microlitri di acetato di sodio pH 5,5. Quindi mescolare il campione. Aggiungere un millilitro di etanolo al 100%.Mescolare nuovamente e precipitare il campione per tutta la notte a meno 20 gradi Celsius. Infine, circolarizzare le molecole di CD NA per agganciare la regione adattatrice all'estremità cinque primi. Successivamente, riaprire in forma lineare e amplificare tramite PCR seguendo il protocollo scritto allegato prima del sequenziamento della libreria eye clip; il successo dell'esperimento può essere monitorato in due fasi.L'autoradiografia del complesso proteina-RNA dopo il trasferimento su membrana e l'immagine del gel dei prodotti di PCR nell'autoradiografia dei campioni con bassa quantità di RNA, si dovrebbe osservare una radioattività diffusa al di sopra del peso molecolare della proteina nei campioni con elevata quantità di RNA. Questa radioattività è concentrata più vicino al peso molecolare della proteina. Quando nell'immunoprecipitazione non viene utilizzato alcun anticorpo, nessun segnale dovrebbe essere rilevato.Ulteriori controlli importanti per la specificità dell'immunoprecipitazione prevedono l'uso di radiazioni UVE o di cellule che non esprimono la proteina di interesse. L'immagine del gel dei prodotti di PCR dovrebbe mostrare un intervallo di dimensioni corrispondente alla frazione di CD NA. Si noti che i primer di PCR, P tre Celexa e P cinque Celexa, aggiungono ulteriori 76 nucleotidi alla dimensione del CD NA. Se durante l'immunoprecipitazione non viene utilizzato alcun anticorpo, non dovrebbe essere rilevato alcun prodotto di PCR corrispondente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che ciascuno dei 64 passaggi è fondamentale e deve essere eseguito con una precisione del cento per cento. I dati ICL possono essere integrati computazionalmente con saggi funzionali su scala trascrittomica. Ciò può, ad esempio, fornire informazioni sulla regolazione dipendente dalla posizione del processamento dell'RNA.Per l'analisi computazionale dei dati, desideriamo rimandare alle nostre recenti pubblicazioni realizzate in collaborazione con Nicholas KA dell'Istituto Europeo di Bioinformatica e bla zupan dell'Università di Liana. Ora è il momento di iniziare i vostri esperimenti. Buon divertimento.

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A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e...

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Trascrizioni di RNA sono soggetti ad ampie regolamentazione posttranscriptional che è mediato da una moltitudine di trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Qui vi presentiamo un metodo generalizzabile per identificare con precisione e trascrittoma su scala i siti di legame di RNA RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

Qui, abbiamo dettagliato il metodo di equilibrio di P soralen crosslinked, L igated e S elected H ybrids (SPLASH), che consente mapping a livello genomico delle interazioni RNA-RNA intramolecolari e intermolecolari in vivo . SPLASH può essere applicato per studiare interagenti RNA di organismi compresi lieviti, batteri e umani.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Vi presentiamo approcci sperimentali per studi interattori di RNA double-stranded RNA binding della chinasi di proteina RNA-attivato (PKR) durante il ciclo cellulare dei mammiferi utilizzando cellule HeLa. Questo metodo utilizza la formaldeide a crosslink RNA-PKR complessi e immunoprecipitazione per arricchire associato a PKR RNAs. Questi RNA possono essere ulteriormente analizzati mediante sequenziamento ad alte prestazioni o qRT-PCR.

Lo studio di RNA interattori della chinasi proteica RNA-attivato durante il ciclo cellulare dei mammiferi

Qui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.

Metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eCLIP) per un'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testis del topo

Qui, presentiamo un protocollo per arricchire i siti endogeni di legame dell'RNA o "impronte" di nasi: proteine (RNP) complessi da cellule di mammiferi. Questo approccio comporta due immunoprecipitazioni di sottounità RNP ed è quindi soprannominato immunoprecipitazioni di RNA in tandem (RIPiT).

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.

Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina

Il cross-linking cinetico e l'analisi del cDNA è un metodo che consente di studiare la dinamica delle interazioni proteina-RNA nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale. Qui il protocollo è descritto in dettaglio, compresa la crescita delle cellule di lievito, la reticolazione UV, la raccolta, la purificazione delle proteine e le fasi di preparazione della libreria di sequenziamento di prossima generazione.

Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

Impara la tecnica iCLIP per mappare le interazioni proteina-RNA a risoluzione di singolo nucleotide nel trascrittoma. Questo metodo combina UV cross-linking, immunoprecipitazione e sequenziamento ad alta portata.

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

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