Name: Verwijderen van de ingewanden van de muis glasvocht en het netvlies voor Proteoom Analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Leer een dissectiemethode voor het isoleren van glasvocht, netvlies en lens uit het muizenoog. Centrifugatie scheidt weefsels op dichtheid voor zuivere proteoomanalyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering werd verstrekt door Fight for Sight en Onderzoek om blindheid te voorkomen.

1. Anterieure segment dissectie. <ol><li> Sclerale weefsel achter de limbus is gevat met een 0,22 pincet en de wereld (oogbol) is gestabiliseerd. </li><li> Een microchirurgische mes wordt gebruikt om een ​​lineaire incisie in het hoornvlies van de limbus tot limbus te maken. </li><li> Een 0,12 Colibri pincet wordt vervolgens gebruikt om het hoornvlies te begrijpen aan de incisie. </li><li> De voorste oogkamer vloeistof wordt vervolgens geabsorbeerd met een Weck-Cel chirurgische speer. </li></ol> 2. Lens verwijderen van de ingewanden. <ol><li> Een 0,12 Colibri pincet vast te pakken van het hoornvlies wordt gebruikt om de wereld te stabiliseren. </li><li> Een fijne gebogen naald houder (of gebogen dressing pincet) wordt ingevoegd achter de lens in de richting van het achterste deel van de wereld. De naaldhouder is gedeeltelijk gesloten, en trok naar voren. Druk wordt uitgeoefend met behulp van de pincet op het externe oppervlak van de sclera, die de lens duwt vooruit door het hoornvlies incisie terwijl de ogen muur intact. Het glasvocht verschijnt als een doorschijnende gel en is gedeeltelijk aanhanger op de lens. </li><li> De lens-vitreous weefsel wordt vervolgens geplaatst in een gefilterde centrifugebuis met 20 microliter van protease-remmer cocktail (Roche) opgelost in PBS. </li></ol> 3. Retina verwijderen van de ingewanden. <ol><li> Blijf de hele wereld te stabiliseren met 0,12 Colibri tang vast te pakken het hoornvlies incisie. </li><li> Een fijne gebogen naald houder (of gebogen dressing pincet) is geplaatst zo ver posterior aan de hele wereld als mogelijk in de nabijheid van de oogzenuw. De naaldhouder is gedeeltelijk gesloten, en trok naar voren. Druk wordt uitgeoefend met behulp van de pincet op het externe oppervlak van de sclera, die het netvlies duwt vooruit door de cornea incisie. Het glasvocht verschijnt als een doorschijnende gel aanhanger van het netvlies. Het netvlies is gevisualiseerd als een gele, gevasculariseerde weefsel. Elke strips van gepigmenteerde weefsel kan worden afgepeld met een pincet. </li><li> Het netvlies-vitreous weefsel wordt vervolgens geplaatst in de gefilterde centrifugebuis met de lens-vitreous weefsel. </li></ol> 4. Gefilterd centrifugeren. <ol><li> De gefilterde centrifuge buis wordt geplaatst in een benchtop centrifuge. Spin bij 14.000 x G voor 12 minuten. </li><li> Zuig het eluens van de Tweede Kamer, dat is het glasvocht. Het netvlies blijft in de bovenste kamer. Deze monsters kunnen worden gebruikt voor eiwit studies. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Glasvocht monsters werden geanalyseerd door SDS-PAGE (figuur 2). Monsters werden ook gebruikt voor een enzymatische activiteit assay (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Mouse eye diagram. Schematische dwarsdoorsnede van het menselijk oog en de muis toont de relatieve kleinere glasvocht volume in de muis oog te wijten aan de grotere lens. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een-dimensionale SDS-PAGE van de muis glasvocht en het netvlies. Eiwitprofielen van muis glasvocht, 13,6 mg / ml (baan 1), en het netvlies, 11,35 mg / ml (laan 2). Gelelektroforese werd uitgevoerd bij 150 kV gedurende 45 minuten, gekleurd met Flamingo tl-gel vlek en gevisualiseerd met behulp van een VersaDoc Imaging systeem (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Superoxide dismutase (SOD) enzymactiviteit in de muis en menselijke glasvocht. Meting van de totale SOD activiteit (SOD activiteit colorimetrische aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) werd uitgevoerd op glasvocht en het netvlies verzameld door verwijderen van de ingewanden van de DBA en albino muizen. Dit werd vergeleken met SOD-activiteit in de menselijke glasvocht kern en de menselijke netvlies afkomstig van post-mortem menselijk donor ogen om de relatieve activiteit te bepalen. Onverdunde glasvocht bodemmonsters werden handmatig weggezogen met behulp van een 23-gauge naald, 11 en het netvlies werd verzameld door bloeien het oog en het snijden van het weefsel weg van de RPE / choroidea complex. Hoewel de test maakt geen onderscheid tussen SOD isovormen, het glasvocht SOD activiteit is waarschijnlijk SOD3 weer te geven, want het is de enige extracellulaire isoform 12 Het netvlies SOD-activiteit is waarschijnlijk alle drie de SOD isovormen weer te geven:. Intracellulaire SOD1, mitochondriale SOD2, en extracellulaire SOD3. 12 voor zeer gevoelige enzymatische assays, waaronder deze SOD assay, de mogelijkheid van cross-contaminatie van eiwitten is mogelijk en is verder onderzoek nodig. Foutbalken vertegenwoordigen SEM.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &amp, Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Ophthalmol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+RS+%22Systematic+evaluation+of+the+mouse+eye%3A+Anatomy%2C+pathology%2C+and+biomethods%22">Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods</a>. , CRC Press. 161-195 (2002).</li>
<li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li>
<li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+Stickler%27s+syndrome%3A+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+%28pro%29collagen+gene+%28Col2a1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li>
<li>Marneros, A. G. &amp, Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII%2Fendostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li>
<li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li>
<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li>
<li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Association for Research and Vision in Oogheelkunde verklaring voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en Vision Research.

Transgene muizen zijn een belangrijk model voor het onderzoeken van het netvlies en vitreoretinale ziekte. 6-10 De muis glasachtig lichaam, echter, bestaat een aanzienlijk kleiner deel van het oog in vergelijking met de menselijke glasvocht door de grote lens in de muis oog. 5 Dit maakt het het moeilijk te isoleren en te zuiveren van de muis glasvocht. Inzicht in de eiwit veranderingen die gepaard gaan met het glasvocht tijdens ziekten zoals proliferatieve diabetische retinopathie, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, uveïtis, en netvliesloslating geven inzicht in de mechanismen waarmee zij de voortgang. Deze zichtbaar experimentele protocol biedt een middel te verkrijgen en te zuiveren van de muis glasachtig lichaam, terwijl het maximaliseren van het eiwit opbrengst voor enzymatische en proteomics analyses.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver Microchirurgische Blade </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Castroviejo hechten Forceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0.12 Colibri pincet </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontroller centrifugaalfilter Ultracel YM-100 of YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> SOD activiteit colorimetrisch Assay Kit </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgische speren </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaseremmer cocktail </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo TL-gel vlek </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

verwijderen van de ingewanden van de muis glasvocht en het netvlies voor proteoom analyses

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Terwijl de muis netvlies heeft zich ontpopt als een belangrijk genetisch model voor erfelijke retinale ziekten, de muis glasvocht moet nog worden onderzocht. Het glasvocht is een zeer waterige extracellulaire matrix bovenliggende het netvlies waar het intra-oculaire evenals extraoculaire eiwitten accumuleren tijdens ziekte. 1-3 Abnormale interacties tussen glasvocht en het netvlies liggen ten grondslag aan een aantal ziekten, zoals netvliesloslating, proliferatieve diabetische retinopathie, uveitis, en proliferatieve vitreoretinopathie 1. , 4 De relatieve muis glasvocht volume is aanzienlijk kleiner dan het menselijk glasvocht (figuur 1), aangezien de muis lens neemt bijna 75% van zijn oog. 5 Dit is biochemisch onderzoek van de muis glasvocht gemaakt uitdagend. In deze video artikel zullen we een techniek te ontleden en de muis glasvocht isoleren van het netvlies, waardoor het gebruik van transgene muis modellen om de rol van deze extracellulaire matrix duidelijker te definiëren in de ontwikkeling van vitreoretinale ziekten.

De dissectie techniek illustreert ingewanden te ontdoen van het glasvocht, netvlies, en de lens van de muis oog, scheiding door centrifugeren, en karakterisering met eiwit assays.

Verwijderen van de ingewanden van de muis glasvocht en het netvlies voor Proteoom Analyses

Hoewel het netvlies van de muis een belangrijk genetisch model is geworden voor erfelijke netvliesziekten, moet het glaskerne van de muis nog verder worden onderzocht. Het glaskerne is ...

Het menselijk oog is gevuld met een vloeibare extracellulaire matrix die in het muisenoog glazuim wordt genoemd. Deze ruimte wordt grotendeels ingenomen door de lens. Om het glazuim en het netvlies te isoleren, moeten we eerst het anterieure segment dissecteren, het oog stabiliseren met een pincet en een uiterst scherp mesje gebruiken om één incisie over het hoornvlies te maken.Een bot mes kan het hoornvlies scheuren en meerdere bewegingen vereisen. Een WEX-cel-spons wordt gebruikt om vloeistof in de voorste oogkamer te absorberen. De pijlen geven aan waar we de lens en het glaspulpa met een pincet zullen uitknijpen, waarna we het pincet gedeeltelijk sluiten en naar voren trekken.De lens ziet eruit als een heldere bol en daarachter bevindt zich de glasvochtgel. In dit voorbeeld blijft het glasvocht aan de achterkant van de lens kleven; om het netvlies te isoleren worden de netvliespincetten verder naar achteren geplaatst, nabij de oogzenuw, waarna men voorzichtig knijpt en naar voren trekt. Het netvlies ziet eruit als een geelachtig gelatineachtig materiaal.In sommige gevallen komen het netvlies, het glasachtig lichaam en de lens als één enkel weefsel vrij. De volgende stap is om deze drie weefsels te isoleren en te scheiden met behulp van een filtercentrifugatieapparaat. Het filterstuk wordt in de bovenkant van een einor-buis geplaatst en we voegen wat fosfaatgebufferde zoutoplossing toe.Zodra de weefsels zijn geïsoleerd, worden ze in de bovenste put geplaatst die het filter bevat. De lenzen bevinden zich in de linkerbovenhoek en het retina vitreous in de rechterbenedenhoek. De buisjes worden in een microcentrifuge geplaatst en 12 minuten gecentrifugeerd bij 14 000 Gs.Het glasachtig lichaam zal naar de bodem van de einor-buis lens zakken, terwijl het netvlies in het bovenste gedeelte blijft. Gebruik een pincet om de lens van het netvlies te scheiden en isoleer vervolgens het netvlies uit het bovenste reservoir. Al deze weefsels kunnen in einor-buisjes worden geplaatst en vervolgens worden verwerkt voor proteomanalyses.

evisceration-of-mouse-vitreous-and-retina-for-proteomic-analyses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont een effectieve techniek voor het differentiëren en het ontleden van de verschillende semi-transparante structuren van het menselijk glasachtig lichaam in post mortem ogen.

Dissectie van de Mens glasvocht Elementen voor proteoomanalyse

Trypsine digest is een van de meest gebruikte methoden voor retinale vasculatuur analyseren. Dit manuscript beschrijft de methode in detail, met inbegrip van belangrijke wijzigingen aan de techniek te optimaliseren en te verwijderen van de niet-vaatweefsel met behoud van de algehele architectuur van de schepen.

Trypsine Digest Protocol bij het netvlies Vasculature van een muismodel Analyseer

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.

Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van muriene postnatale retinale endotheelcellen die zijn geoptimaliseerd voor celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid. Deze cellen zijn geschikt voor next-generation sequencing benaderingen.

Isolatie van murine retinale endotheelcellen voor next-generation sequencing

Er werd een beschermingstest ontwikkeld om de veerkracht van het netvlies tegen overlijden door diabetes/diabetische retinopathie-gerelateerde beledigingen zoals oxidatieve stress en cytokines te controleren.

Een test om bescherming van het netvlies te detecteren tegen diabetesgerelateerde sterfte bij muizen

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde stappen voor het voorbereiden van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie, met de nadruk op de structurele kenmerken van retinale fotoreceptorterminals.

Voorbereiding van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie

De pericyten in het retinale vaatstelsel werden onderzocht door middel van immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β na retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine. Het gelabelde netvlies werd verder behandeld met de weefselopruimingsmethode en in zijn geheel gemonteerd voor het visualiseren van de driedimensionale beelden van pericyten rond het netvliesvaatstelsel onder een confocale microscoop.

3D-visualisatie van retinale vasculaire pericyten bij muizen door immunokleuring 

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Leer een dissectiemethode voor het isoleren van glasvocht, netvlies en lens uit het muizenoog. Centrifugatie scheidt weefsels op dichtheid voor zuivere proteoomanalyses.

Verwijderen van de ingewanden van de muis glasvocht en het netvlies voor Proteoom Analyses

Meer video's verkennen