Name: Eviscerazione delle Vitreous Mouse e Retina per analisi proteomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Impara a isolare il vitreo, la retina e il cristallino dall'occhio di topo mediante dissezione e centrifugazione. Questo protocollo consente analisi proteomiche precise su campioni oculari puri.

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Il finanziamento è stato fornito da Lotta per la vista e la ricerca per prevenire la cecità.

1. Dissezione del segmento anteriore. <ol><li> Tessuto sclerale posteriormente al limbus è afferrato con una pinza 0,22 e il globo (bulbo oculare) è stabilizzata. </li><li> Una lama microchirurgico è usato per fare un'incisione lineare nella cornea da limbus a limbus. </li><li> Un Colibri 0,12 pinza viene quindi utilizzata per afferrare la cornea alla incisione. </li><li> Il fluido della camera anteriore viene poi assorbito con un Weck-Cel lancia chirurgico. </li></ol> 2. Lens eviscerazione. <ol><li> Un Colibri 0,12 pinza afferrare la cornea viene utilizzato per stabilizzare il mondo. </li><li> Un supporto con ago sottile curva (o curva Pinza medicazione) viene inserito dietro l'obiettivo verso la parte posteriore del globo. Il titolare ago è parzialmente chiusa, e tirò avanti. La pressione viene applicata utilizzando il forcipe sulla superficie esterna della sclera, che spinge in avanti la lente attraverso l'incisione della cornea lasciando intatta la parete dell'occhio. Il vitreo si presenta come un gel trasparente ed è parzialmente aderente alla lente. </li><li> L'obiettivo vitreo-tessuto viene poi inserito in un tubo di centrifugazione filtrato contenente 20 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi (Roche) disciolto in PBS. </li></ol> 3. Retina eviscerazione. <ol><li> Continuare a stabilizzare il mondo con 0,12 pinze Colibri cogliere l'incisione della cornea. </li><li> Un supporto con ago sottile curva (o curva Pinza medicazione) è posta per quanto possibile posteriore al mondo il più possibile, vicino al nervo ottico. Il titolare ago è parzialmente chiusa, e tirò avanti. La pressione viene applicata utilizzando il forcipe sulla superficie esterna della sclera, che spinge in avanti la retina attraverso l'incisione della cornea. Il vitreo si presenta come un gel trasparente aderente alla retina. La retina è visualizzato come un giallo, il tessuto vascolarizzato. Le strisce di tessuto pigmentato può essere staccato con una pinza. </li><li> La retina, vitreo tessuto viene poi inserito nel tubo da centrifuga filtrato contenente l'obiettivo vitreo-tessuto. </li></ol> 4. Filtrata centrifugazione. <ol><li> Il tubo di centrifuga filtrato viene posto in una centrifuga da banco. Girano a 14.000 g per 12 minuti. </li><li> Aspirare il eluente dalla camera inferiore, che è il vitreo. La retina rimane nella sala al piano superiore. Questi campioni possono essere utilizzati per gli studi di proteine. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Vitreo campioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (Figura 2). I campioni sono stati utilizzati anche per un saggio di attività enzimatica (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma a occhio Mouse. Trasversale schematica dell'occhio umano e del mouse mostra il volume relativo vitreo più piccoli nell'occhio del mouse grazie al suo obiettivo più grande. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Monodimensionale SDS-PAGE di vitreo del mouse e della retina. Profili proteici di vitreo topo, 13,6 mg / ml (corsia 1), e della retina, 11,35 mg / ml (corsia 2). Elettroforesi su gel è stata effettuata a 150 kV per 45 minuti, macchiata di macchia gel Flamingo fluorescenti ed è visualizzato mediante un sistema di VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Superossido dismutasi (SOD) attività enzimatica nel topo e nel vitreo umano. Misurazione dell'attività SOD totale (SOD attività colorimetrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) è stata eseguita su vitreo e retina raccolte eviscerazione dai topi DBA e albino. Questo è stato confrontato con attività SOD nel cuore umano vitreo e retina umana raccolti da post-mortem occhi donatore umano per determinare l'attività relativa. Non diluito carotaggi vitreo sono stati aspirati manualmente utilizzando una 23-gauge, 11 e retina è stato raccolto dalla fioritura l'occhio e il taglio del tessuto dal RPE / coroide complesso. Anche se il test non fa distinzione tra isoforme SOD, l'attività SOD vitreo è probabile che SOD3 riflettere, dal momento che è l'unica isoforma extracellulare 12 L'attività SOD retina riflette probabilmente tutte le isoforme SOD tre:. Intracellulare SOD1, mitocondriale SOD2, ed extracellulare SOD3. 12 Per saggi enzimatici altamente sensibili, tra cui questo saggio SOD, la possibilità di contaminazione incrociata di proteine ​​è possibile e richiede ulteriori studi. Barre di errore rappresentano SEM.

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</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l&#39;Associazione per la Ricerca e della visione nella dichiarazione Oftalmologia per l&#39;uso degli animali nel oftalmica e di ricerca Vision.

Topi transgenici sono un importante modello per lo studio delle malattie della retina e vitreo-retinica. 6-10 Il corpo vitreo del mouse, invece, comprende una proporzione significativamente più piccola dell&#39;occhio rispetto al corpo vitreo umano a causa della grande lente nell&#39;occhio del mouse. 5 Questo rende difficile isolare e purificare il corpo vitreo del mouse. Comprendere i cambiamenti delle proteine ​​associate al vitreo in corso di malattie come la retinopatia diabetica proliferativa, età degenerazione maculare, uveite, e distacco della retina darà comprensione dei meccanismi con cui si progresso. Questo protocollo visualizzati sperimentale fornisce un mezzo per ottenere e purificare il corpo vitreo del mouse, massimizzando la resa di proteine ​​enzimatiche e di analisi proteomica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver microchirurgica Lama </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Castroviejo sutura Pinza </td><td> Storz oftalmica </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri forcipe </td><td> Storz oftalmica </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontrollore centrifuga Filtro Ultracel YM-100 o YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> SOD Attività colorimetrico Assay Kit </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgico lance </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi cocktail </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo gel fluorescenti macchia </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

eviscerazione delle vitreous mouse e retina per analisi proteomica

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Mentre la retina del mouse è emersa come un importante modello genetico per le malattie ereditarie della retina, il vitreo mouse rimane da esplorare. Il vitreo è una matrice extracellulare altamente acquosa sovrastante la retina dove intraoculare così come le proteine ​​extraoculari si accumulano durante la malattia. 1-3 interazioni anomale tra vitreo e la retina alla base di numerose malattie come il distacco di retina, retinopatia diabetica proliferativa, uveite, e proliferazione vitreoretinica 1. , 4 Il volume relativo vitreo del mouse è significativamente più piccolo del vitreo umano (Figura 1), dal momento che l&#39;obiettivo del mouse occupa quasi il 75% del suo occhio. 5 Questo ha fatto studi biochimici del vitreo del mouse impegnativo. In questo articolo video, vi presentiamo una tecnica per sezionare ed isolare il vitreo del mouse dalla retina, che permetterà l&#39;uso di modelli di topi transgenici per definire più chiaramente il ruolo di questa matrice extracellulare nello sviluppo di patologie vitreo-retinica.

La tecnica di dissezione illustra l&#39;eviscerazione del vitreo, retina, e la lente dall&#39;occhio del mouse, la separazione mediante centrifugazione, e la caratterizzazione con i dosaggi della proteina.

Eviscerazione delle Vitreous Mouse e Retina per analisi proteomica

Sebbene la retina di topo sia emersa come un importante modello genetico per le malattie retiniche ereditarie, il corpo vitreo del topo rimanga ancora da esplorare. Il corpo vitreo è...

L'occhio umano è riempito da una matrice extracellulare liquida chiamata umor vitreo, presente anche nell'occhio del topo. Questo spazio è occupato principalmente dalla lente. Per isolare l'umor vitreo e la retina, dobbiamo prima dissezionare il segmento anteriore, stabilizzare l'occhio con una pinzetta e utilizzare una lama estremamente affilata per praticare un singolo taglio attraverso la cornea.Una lama smussata può lacerare la cornea e richiedere diverse passate. Viene utilizzata una spugna per cellule WEX per assorbire il liquido nella camera anteriore. Le frecce indicano i punti in cui premeremo con la pinza per espellere il cristallino e il vitreo, chiuderemo parzialmente la pinza e tireremo in avanti.L'obiettivo appare come una sfera trasparente e dietro di esso si estende il gel vitreo. In questo esempio, il vitreo rimane aderente alla parte posteriore dell'obiettivo; per isolare la retina, le pinzette vengono posizionate più indietro, vicino al nervo ottico, premendo delicatamente ed estraendo in avanti. La retina ha l'aspetto di un materiale giallastro e gelatinoso.In alcuni casi, la retina, il vitreo e il cristallino usciranno come un unico tessuto. Il passo successivo consiste nell'isolare e separare questi tre tessuti utilizzando un dispositivo per la centrifugazione con filtro. Il pezzo filtrante va inserito nella parte superiore di una provetta einor e aggiungiamo del salino fosfato tamponato.Mentre ciascuno dei tessuti viene isolato, viene posizionato nel pozzetto superiore superiore contenente il filtro. Le lenti si trovano nell'angolo superiore sinistro e la retina con il corpo vitreo è nel quadrante inferiore destro. I tubi vengono posti in una microcentrifuga ed eseguiti a 14.000 G per 12 minuti.Il vitreo ruoterà sul fondo della lente della provetta einor, mentre la retina rimarrà nella parte superiore. Useremo una pinzetta per separare la lente dalla retina, quindi isoleremo la retina dal pozzetto superiore. Tutti questi tessuti possono essere posizionati in provette einor e successivamente sottoposti ad analisi proteomiche.

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Questo video mostra una tecnica efficace per differenziare e sezionare le varie semitrasparente strutture del corpo vitreo in post mortem occhi.

Dissezione di Human Elements corpo vitreo per l&#39;analisi proteomica

Tripsina digest è uno dei metodi più comunemente utilizzati per analizzare vascolarizzazione retinica. Questo manoscritto descrive il metodo in dettaglio, comprese le alterazioni fondamentali per ottimizzare la tecnica e rimuovere il tessuto non vascolare preservando l'architettura generale dei vasi.

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Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.

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La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. L'istologia, il test di rottura della barriera emato-retinica e l'angiografia a fluorescenza sono tecniche preziose per comprendere la fisiopatologia della retina, che potrebbe migliorare ulteriormente l'efficiente screening farmacologico contro la retinopatia diabetica.

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Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati per la preparazione di campioni retinici per la microscopia elettronica volumetrica, concentrandosi sulle caratteristiche strutturali dei terminali dei fotorecettori retinici.

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Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione 

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

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