Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation

I virus a RNA utilizzano RNA polimerasi codificate dal virus stesso per replicare i loro genomi. Queste polimerasi presentano una percentuale di errore intrinsecamente più elevata, che consente al virus di adattarsi ed evolversi rapidamente. Questo video presenta un metodo ottimizzato per analizzare e identificare virus con mutazioni nella loro RNA polimerasi che influenzano la percentuale di errore o la fedeltà durante la replicazione.

Per prima cosa, i mutageni vengono applicati alle cellule ospiti virali per determinare il livello massimo di mutageno utilizzabile senza uccidere le cellule o inibire il virus. Una volta stabiliti i parametri ottimali, il virus viene passaggiato sotto la pressione selettiva di mutageni dell'RNA. La popolazione resistente al mutageno viene quindi sottoposta a sequenziamento per identificare la mutazione responsabile.

Successivamente, si isola il mutante resistente al mutageno. Si monitorano la cinetica di replicazione e i risultati mostrano aumenti o diminuzioni della fedeltà della polimerasi. Contestualmente, si osserva una resistenza ampia ai mutageni RNA e alterazioni nella frequenza di mutazione della popolazione virale.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli acidi di fedeltà biochimica utilizzando polimerasi purificate, è che queste tecniche sono valide per qualsiasi virus a RNA che possa essere coltivato in coltura tissutale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia, come il ruolo della polimerasi nell'adattamento e nell'evoluzione virale. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché le pressioni selettive che utilizzano sono troppo forti o troppo deboli, e la dimensione del campione di sequenza analizzata della regione e il numero di cloni non sono stati ottimizzati per garantire un'adeguata potenza statistica.

Iniziare questo esperimento determinando il range di concentrazioni del mutageno che possono essere utilizzate nei successivi esperimenti senza provocare la morte cellulare. Aspirare il mezzo da sei piastre a pozzetto contenenti monocapate subconfluenti di cellule hilar. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo supplementato con mutageno, impiegando i mutageni ribavirina, 5-fluorouracile, 5-azacitidina, cloruro di magnesio e cloruro di manganese.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, ogni 24 ore per i successivi due o sette giorni, utilizzare una piastra di cellule per verificare la vitalità mediante esclusione del blu di triam. Utilizzando un citometro ematico, calcolare la percentuale di cellule vitali per ciascuna concentrazione di mutageno, inclusi i controlli non trattati che determinano una mortalità cellulare inferiore al 50% al termine dell'infezione.

Quando vengono raggiunte le titolazioni massime ideali, il passo successivo della procedura consiste nel determinare la concentrazione del mutageno che eserciterà una pressione selettiva ottimale senza ipermutare la popolazione alle concentrazioni appropriate. Ogni genoma viene mutato in almeno una o due posizioni. Il mutageno genererà quindi la mutazione di resistenza, che verrà successivamente selezionata durante il passaggio.

Se vengono introdotte troppe mutazioni, i mutanti portatori della mutazione di resistenza risulteranno essi stessi letali. L'agenti mutageni impediscono il loro isolamento in piastre a sei pozzetti seminate con le. Le nostre cellule in due millilitri di mezzo integrato con agente mutageno utilizzano lo stesso intervallo di concentrazioni di prima, escludendo quelle concentrazioni che hanno determinato oltre il 50% di morte cellulare.

Incubare per due ore per consentire l'assorbimento del mutagene dopo l'incubazione. Aspirare il mezzo e infettare con il virus a bassa multiplicità di infezione in 200 microlitri, incubare per 15-60 minuti per permettere al virus di infettare le cellule, agitando la piastra a intervalli regolari per assicurare che l'inoculo ricopra uniformemente il monostrato cellulare. Aspirare il virus inoculato e lavare due volte con due millilitri di PBS per rimuovere quanta più parte possibile dell'inoculo.

Quindi aggiungere il mezzo contenente il mutageno in ogni pozzetto e incubare le cellule per un periodo corrispondente a tre-sei cicli di replicazione, solitamente da due a sette giorni. Raccogliere il virus da ogni pozzetto ed eseguire un saggio standard di placche o una diluizione limite per determinare l'effetto antivirale sul titolo virale calcolato. Identificare la concentrazione di mutageno che riduce i titoli virali rispetto all'infezione di controllo non trattata di 0,5-2 log, ma che non risulti altamente tossica per le cellule.

Idealmente, con una tossicità inferiore al 50%, per isolare varianti resistenti ai mutageni si inizia passando il virus in cellule ospiti in presenza della concentrazione ottimale di ciascun mutageno; il virus potrebbe dover essere passato fino a 30 volte e, ad ogni passaggio, è necessario titolare il virus e ripetere l'infezione e l'incubazione in presenza del mutageno come illustrato qui. I titoli virali dei campioni trattati con mutageni dovrebbero diminuire durante i primi passaggi rispetto al titolo virale originale e ai titoli del controllo non trattato. Una volta che i titoli virali di una determinata serie raggiungono un'entità paragonabile a quella dei controlli non trattati, ciò suggerisce lo sviluppo di resistenza.

Estrarre l'RNA virale per il sequenziamento utilizzando primer che amplificano i geni della polimerasi o della replicasi del virus di interesse. Generare il DNAc del genoma virale mediante RT-PCR, quindi sequenziare il DNA. Una volta ottenute le informazioni sulla sequenza.

Utilizzare un software di allineamento per allineare le sequenze risultanti con il consenso di riferimento e identificare le nuove mutazioni puntuali. Inoltre, verificare i cromatogrammi alla ricerca di picchi minoritari che potrebbero essere stati trascurati dal software di allineamento. Un mutante che rappresenti dal 20 al 30% della popolazione totale si presenterà comunque come un picco, ma di dimensioni troppo ridotte per essere riconosciuto come un nucleotide misto mediante analisi di sequenza standard. Per identificare la mutazione di interesse, cercare polimorfismi a singolo nucleotide che compaiono esclusivamente nella popolazione trattata con mutageno rispetto al controllo non trattato, proveniente dallo stesso passaggio, come mostrato qui. Una volta identificata una mutazione, la variante resistente deve essere rigenerata da CD NA infettivo oppure isolata in coltura tissutale, e il fenotipo di resistenza deve essere confermato.

Qui isoliamo i mutanti identificati mediante saggio di placca. Preparare diluizioni seriali del campione resistente all'azoto e aggiungerle a monocapate cellulari in piastre a sei pozzetti per un saggio di placca, dopo un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Aggiungere un sovrastrato di agarosio da due a cinque giorni dopo l'infezione.

Le placche devono essere chiaramente visibili. Idealmente, una delle piastre produrrà da 10 a 50 placche ben distanziate. Segnare la posizione delle placche sulla piastra con un punto, utilizzando un pennarello, avendo cura di non spostare o staccare il sovrastrato; inserire delicatamente una punta filtrante P200 attraverso il sovrastrato di agarosio.

Per raggiungere la placca, sollevare con attenzione la punta dal sovraspalmato e trasferire il tappo di aros in una provetta da microcentrifuga contenente 250 microlitri di mezzo. Una quantità sufficiente di virus verrà trasferita indipendentemente dal fatto che il tappo di aros venga rilasciato dalla punta; vortexare la provetta e portare a trattamento per 10X per ute. Conservare una porzione del campione per amplificare successivamente il virus vivo.

Quindi estrarre l'RNA dal resto del campione ed eseguire la R-T-P-C-R per identificare il campione di placca che contiene la mutazione desiderata. Sequenziare il CDNA. Assicurarsi che non siano presenti mutazioni aggiuntive.

Successivamente, preparare una scorta più ampia di questo virus per tutti gli studi successivi. Poi confermare la resistenza conferita dalla mutazione identificata. Ripetere il saggio mutageno utilizzando diverse condizioni mutagene.

Se la variante è resistente a più agenti mutageni, probabilmente presenta una fedeltà aumentata. Poiché le mutazioni che alterano la fedeltà si localizzano nella polimerasi, è fondamentale confermare che la cinetica di replicazione non sia significativamente modificata. Prima di determinare le frequenze di mutazione, esaminare la replicazione mediante almeno due approcci complementari.

Ad esempio, un approccio che esamina la produzione di virus, come il saggio di placca o il TCID 50, può essere eseguito in aggiunta a un approccio che esamina la sintesi di RNA, come la R-T-P-C-R quantitativa o il northern blot. Successivamente, per confermare che la modifica della polimerasi identificata, responsabile della resistenza all'agente mutageno, altera la replicazione, si misurano le frequenze di mutazione per fedeltà. Questo può essere eseguito sia sulla popolazione di virus infetti che su quella totale di virus.

Per determinare le frequenze di mutazione dell'intera popolazione virale, che comprende varianti vitali e non vitali, estrarre l'RNA ed eseguire l'amplificazione mediante R-T-P-C-R di una regione di 800-1.200 nucleotidi di una sequenza codificante nota per presentare varianti genetiche, ad esempio quella che codifica per una proteina strutturale. Successivamente, clonare mediante topo TA il prodotto purificato per ciascuna popolazione virale da studiare. Selezionare 96 colonie identificate come portatrici di un inserto positivo mediante selezione bianco-blu su piastre rivestite con xga.

Eseguire una PCR su singola colonia per confermare la validità della selezione bianco-blu. Utilizzando la dimensione del frammento e le condizioni indicate sopra, circa il 90% delle colonie dovrebbe risultare positivo. Per ogni colonia bianca positiva, utilizzare un bastoncino per trasferire ciascuna colonia in un millilitro di terreno LB in 96.

Le piastre di coltura batterica vengono incubate tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione costante. Il giorno successivo, isolare il DNA preparando minipreparazioni in formato 96 pozzetti, sequenziando ogni piastra con quantità sufficiente di primer per ottenere la massima copertura del segmento clonato.

Dovrebbero essere sufficienti due primer con un'ampiezza di 600 basi. Eseguire l'analisi della sequenza utilizzando una sequenza di riferimento o consenso per ciascuna popolazione e un software di allineamento appropriato in grado di identificare facilmente i polimorfismi a singolo nucleotide. Cercare il software man da DNA star laser.

Il gene viene utilizzato innanzitutto per scartare sequenze di scarsa qualità, come quelle con chiamata di basi errata su molte estremità o quelle troppo corte in lunghezza. Allineare le sequenze rimanenti. Identificare il range di nucleotidi coperto da tutte le sequenze nell'analisi.

Eliminare le linee che non sono completamente coperte in questa regione. Per motivi di confronto, è essenziale che la stessa regione sia interamente coperta. Identificare e contare i polimorfismi a singolo nucleotide che differiscono dal ceppo di riferimento.

Calcolare la frequenza delle mutazioni dividendo il numero totale di polimorfismi a singolo nucleotide per il numero totale di nucleotidi sequenziati. Riportare questo valore come numero medio di mutazioni ogni 10.000 nucleotidi sequenziati. Se lo stesso polimorfismo a singolo nucleotide appare in un elevato numero di cloni, presentare due valori che includano o escludano queste mutazioni ripetute.

Determinare la distribuzione delle mutazioni. Creare un elenco ordinato del numero di cloni in ciascuna popolazione che presenta 0, 1, 2, 3 e così via mutazioni nella regione sequenziata, come opzione.

Utilizzare le sequenze modificate per calcolare tutti i possibili confronti a coppie all'interno di un campione, al fine di ottenere i valori medi della diversità della popolazione. Sono disponibili diversi programmi di allineamento. Il programma di analisi genetica molecolare, noto anche come mega, viene utilizzato per determinare le condizioni ottimali per la selezione della resistenza alla mutagenesi dell'RNA.

Le nostre cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti di ribavirina e infettate con il virus Cox AKI B di tipo selvaggio a un indice di infezione (MOI) di 0,01, 48 ore dopo l'infezione. Il virus progenitore è stato raccolto e il titolo è stato determinato mediante TCID50. Questo grafico indica la percentuale di cellule sopravvissute al trattamento al di sotto dell'asse x, valutata mediante colorazione con blu di tripano a 48 ore dall'infezione.

I risultati mostrano che concentrazioni di 100 e 200 micromolar riducono il titolo virale da uno a due log senza influenzare la vitalità cellulare. Per selezionare popolazioni resistenti al mutageno, il virus CHI ganga è stato passaggiato in cellule hilar in presenza barre grigie o assenza barre nere di 50 micromolar di ribavirina; dopo ogni passaggio, la progenie virale è stata quantificata mediante saggio classico di placche su cellule BHK come mostrato qui. L'effetto mutageno è evidente durante i primi passaggi, in cui il titolo virale trattato è diminuito di due log.

Gradualmente Titus è tornato a livelli normali non trattati. Non si osservano differenze significative in cinque popolazioni trattate con mutageni rispetto a quelle non trattate, suggerendo che sono stati selezionati varianti resistenti. Effettivamente, il sequenziamento ha identificato mutazioni uniche nella popolazione virale sottoposta a trattamento con ribavirina. Per confermare una resistenza ampia a mutageni RNA di struttura diversa, la variante ad alta fedeltà A 3 72 V del virus COA B tre, inizialmente isolata nel test, è stata valutata per una sensibilità ridotta a diverse concentrazioni dei mutageni RNA ribavirina, cinque fluorouracile e cinque azacitidina.

Le nostre cellule sono state trattate con le concentrazioni indicate di ribavirina e infettate con il virus Cox AKI di tipo selvaggio B a una multiplicità di infezione di 0,01, 48 ore dopo l'infezione. Il virus progenie è stato raccolto e i titoli sono stati determinati mediante TCID50. Qui vengono mostrati i titoli del tipo selvaggio e della variante A372 in funzione della concentrazione del mutageno. La variante A372V presenta costantemente titoli più elevati rispetto al tipo selvaggio.

In tutte le condizioni testate per determinare la cinetica di crescita in un unico passaggio della produzione virale, le nostre cellule sono state infettate con una multiplicità di infezione di 10 con l'uno o l'altro dei seguenti virus: ceppo selvatico, variante ad alta fedeltà A372V o variante con replicazione difettosa CX64 del virus Coxsackie B3. Nei tempi indicati, la progenie virale è stata raccolta da cellule e supernatanti mediante cicli di congelamento e scongelamento e titolata con il metodo TCID50. L'aumento di fedeltà della variante A372V non coincide con un difetto replicativo osservabile in coltura tissutale. La variante CX64 presenta un significativo ritardo nella cinetica di replicazione e raggiunge titoli massimi inferiori di 1000 volte rispetto al virus selvatico.

Utilizzando l'approccio descritto in questo video, ogni clone sequenziato deriva da un genoma unico all'interno della popolazione totale di virus e presenta quindi mutazioni uniche. Questa figura mostra un allineamento tipico dopo la pulizia delle sequenze di scarsa qualità e la visualizzazione dei polimorfismi di singolo nucleotide. I polimorfismi totali di singolo nucleotide all'interno di una popolazione vengono conteggiati e il numero di polimorfismi di singolo nucleotide presenti in ciascun clone viene annotato.

Ad esempio, la linea sottolineata da una barra contiene due mutazioni uniche, mentre altre otto linee contengono una singola mutazione unica. Questi dati vengono utilizzati per compilare una tabella come quella mostrata qui. La tabella illustra la distribuzione ordinata delle linee sequenziate in base al numero di mutazioni.

Il confronto statistico di valori ordinati può determinare se una distribuzione è significativamente diversa da un'altra. Per una più facile interpretazione, i dati numerici ottenuti dall'analisi di sequenza e statistica possono essere rappresentati come grafico o istogramma. Come mostrato qui, il virus A 3 72 V genera meno mutazioni rispetto al tipo selvatico e presenta una frequenza di mutazione significativamente inferiore, con un valore P minore di 0,01.

La stessa popolazione virale di ganga del pollo produce frequenze di mutazione simili, indipendentemente dal fatto che per l'estrazione dell'RNA venga utilizzato il ceppo virale o una diluizione 10 alla quinta. Pertanto, seguendo questo procedimento, si potrebbe desiderare di eseguire saggi biochimici in vitro o studi di cristallizzazione per comprendere meglio le basi meccanistiche e strutturali della fedeltà in questo varianti della polimerasi.

Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia per esplorare la correlazione tra diversità genetica e idoneità del virus in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come aumentare le probabilità di isolare varianti di fedeltà di virus a RNA e di come utilizzare le frequenze di mutazione per identificare queste differenze di fedeltà.