Preparazione E18 neuroni corticali di ratto per compartimentazione in un dispositivo a microfluidi

Ciao e benvenuto nel laboratorio del Dr.Newly John. In un video precedente, abbiamo dimostrato come produciamo il dispositivo neuronale, una piattaforma che consente al ricercatore di separare i corpi cellulari dei neuroni da una frazione assonale pura. La litografia morbida è la tecnica utilizzata per realizzare i dispositivi, che consiste nel fondere e polimerizzare PDMS su un wafer di silicio contenente il design del dispositivo precedentemente prodotto utilizzando la fotolitografia.

In questo video, dimostreremo la preparazione dei neuroni corticali di ratto spro dolly E 18 e come caricare i neuroni nel dispositivo neuronale. Vorrei presentarvi Kiana Lee. Oggi farà le dimostrazioni.

Prima di iniziare, è importante che tutti i terreni e i reagenti necessari siano caldi a 37 gradi nel bagnomaria. Puoi vedere terreni neurobasali 0,25% di tripsina e DMEM contenenti il 10% di FBS. È importante assicurarsi che tutto ciò che viene inserito nella cappa per essere utilizzato per riparare le cellule sia sterilizzato e pulito con etanolo al 70%.

Innanzitutto, il cappuccio di coltura tissutale viene pulito con etanolo al 70%. Successivamente, le rastrelliere di plastica utilizzate per contenere le provette vengono spruzzate con etanolo. Successivamente, la sfera di gomma utilizzata nel processo di tristriazione viene pulita con etanolo.

È importante farlo all'inizio in modo che abbia abbastanza tempo per asciugarsi. Successivamente, i reagenti necessari vengono puliti con etanolo e spostati nella cappa. Due pezzi di corteccia fetale di ratto E 18 che rappresentano un cervello precedentemente sezionato vengono posti in una provetta da 15 ml contenente un tampone di dissezione ml, ghiacciato, privo di calcio, senza magnesio, un ml di tripsina EDTA allo 0,25% viene aggiunto alla corteccia nel tampone di dissezione, portando il volume finale a due mulini e la concentrazione finale di tryin allo 0,125% Viene quindi posizionato il tubo da 15 ml contenente la corteccia con la tripsina ora aggiunta in un bagno d'acqua a 37 gradi per otto minuti, mentre la corteccia fetale è in incubazione a 37 gradi in tripsina.

Tre pipette per pasta sono lucidate a fuoco. La punta della pipetta di vetro viene posizionata appena a contatto con la fiamma vicino alla parte blu della fiamma e ruotata lentamente fino a quando l'apertura diventa arancione. Mentre diventava arancione.

È importante continuare a ruotare la pipetta di vetro in modo che non collassi. Si noti che le aperture delle pipette di vetro sono progressivamente più piccole. È anche importante notare che non si desidera rendere le aperture troppo piccole in quanto ciò può causare la lisi delle cellule dopo che la corteccia è stata incubata per otto minuti a 37 gradi con la tripsina 10 ml di DMEM contenente il 10% di FBS vengono aggiunti alla corteccia per aiutare a fermare la reazione della tripsina.

La provetta da 15 ml contenente la corteccia e il DMEM 10%FBS viene centrifugata a 2.500 giri/min per due minuti. Nella cabina di biosicurezza, l'aspirazione a vuoto collegata a una pipetta di vetro viene utilizzata per rimuovere il surnatante dalla corteccia. Facendo attenzione a non disturbare o spostare il pellet.

Un ml di terreno basale neurale contenente B 27 e glutammato viene aggiunto al pellet della corteccia e pipettato delicatamente su e giù. È molto importante non creare bolle d'aria durante il pipettaggio su e giù, poiché le bolle d'aria possono danneggiare le cellule per ossidazione. Successivamente, la pipetta posteriore lucidata a fuoco con l'apertura più ampia utilizzata per tri la corteccia attaccando un bulbo di gomma sterile all'estremità della pipetta e pipettando su e giù circa cinque volte.

Facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Ok. Il processo è proseguito con le altre due pipette di vetro, ciascuna con le dimensioni dell'apertura ridotte. Come affermato in precedenza, è importante assicurarsi che non vengano introdotte bolle durante il processo di tristriazione.

Dovresti anche notare che non vedi più alcun blocco visibile. È importante mantenere il tri rating fino a quando non si riesce più a vedere nessuno dei pezzi della corteccia nei media. Dopo l'azione, le celle vengono nuovamente concentrate a 2.500 giri/min per due minuti.

Questa è circa la dimensione approssimativa del pellet che ci si aspetterebbe da due pezzi di corteccia. Dopo la centrifugazione, il sup natina viene nuovamente rimosso dal pellet cellulare. Dopo la rimozione della super natina, un ml di terreno neuro basale contenente B 27 e glutammato viene aggiunto alla corteccia e utilizzato per sospendere la corteccia.

Il pellet di cella viene nuovamente pipettato su e giù con cura per evitare di aggiungere bolle e garantire che il pellet di cella sia distribuito e frantumato uniformemente. Un altro mil di terreno neuro basale viene aggiunto alla sospensione cellulare portando il volume finale a due mil. Successivamente, la soluzione di cella risospesa viene filtrata attraverso un filtro cellulare da 40 micron di BD biosciences per contare le cellule e valutarne la vitalità.

60 microlitri di terreno basale neurale fresco vengono inseriti in una provetta sterile per micro fuge. 20 microlitri di cellule vengono quindi aggiunti ai 60 microlitri di terreno neurobasale e, infine, 20 microlitri di blu trian vengono aggiunti alle cellule nel mezzo neurobasale. Il trian blue colorerà le cellule che non sono più in vita dopo che le cellule sono state colorate con trian blue.

Pipettiamo 20 microlitri su un emocitometro e li osserviamo al microscopio. Le cellule vitali appaiono chiare e traslucide, mentre le cellule che hanno le membrane perforate si colorano di blu a causa del trian blue. In genere, otteniamo circa 2,5 milioni di cellule e 8 milioni di cellule per corteccia.

Normalmente otteniamo due pezzi di corteccia da un cervello con le cellule risospese in un volume finale di due mil. Pertanto, la concentrazione finale di cellule è in genere compresa tra 2,5 milioni di cellule per mil e 8 milioni di cellule per mil. Normalmente, carichiamo circa 20 microlitri di celle per dispositivo.

Questo ci dà un intervallo di celle per dispositivo compreso tra 50.000 celle e 160.000 celle. Le densità delle celle possono essere variate a seconda dell'applicazione. Tuttavia, l'inseminazione di neuroni primari a una densità troppo bassa porta tipicamente alla morte cellulare Dispositivi precedentemente preparati contenenti mezzi basali neurali vengono portati nella cabina di biosicurezza per mantenere la sterilità.

Il terreno in eccesso dai pozzetti viene rimosso da una sezione a vuoto. Tuttavia, bisogna fare attenzione a non rimuovere tutti i media. Ci devono essere dei mezzi nel canale principale che aspirano solo i mezzi dai serbatoi.

Solo 20 microlitri di cellule vengono applicati al serbatoio in alto a sinistra del dispositivo. Le celle fluiscono nel dispositivo e si attaccano alla superficie trattata con PLL. Qui puoi vedere le celle mentre scorrono attraverso il canale principale, e inizierai a vedere alcune di esse effettivamente attaccate al vetro.

Dopo il caricamento, i dispositivi contenenti le cellule vengono riposti in un'incubatrice per circa 10 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi. Dopo 10 minuti nell'incubatore, i dispositivi vengono nuovamente portati nella cabina di biosicurezza, i serbatoi vengono riempiti con i terreni e i dispositivi vengono quindi riposti nell'incubatore. Potrebbe essere necessario sostituire alcuni elementi importanti, a seconda dell'incubatrice e del livello di umidità necessari per i fluidi, nei dispositivi ogni due o tre giorni.

È buona norma posizionare i terreni freschi nei pozzetti superiori e lasciare che alcuni materiali freschi fluiscano attraverso il dispositivo e nei canali principali prima di riempire tutti i serbatoi. I neuroni sono visualizzati qui con il calcio come colorante permanente che colora le cellule viventi. Qui puoi vedere il compartimento so o lato cellulare del dispositivo che contiene i corpi cellulari, gli assoni e i dendriti.

Mentre facciamo una panoramica sul dispositivo, puoi vedere le micro scanalature attraverso le quali crescono gli assoni per raggiungere l'altro lato del dispositivo, il lato degli assoni, che contiene una frazione assonale pura. A scopo dimostrativo. Queste cellule marcate in fluorescenza saranno utilizzate per illustrare la procedura di axotomy.

Una delle proprietà del dispositivo neuronale è che consente al ricercatore di eseguire l'esotomia, cioè il taglio degli assoni dalla frazione assonale pura del dispositivo. Al fine di condurre ricerche come lo studio della rigenerazione assonale. Keano dimostrerà ora l'esecuzione dell'ex otomia nel dispositivo neuronale, l'ex otomia viene eseguita dal vuoto.

Una pipetta di vetro sterile viene posizionata all'apertura inferiore del pozzetto sul lato assonale, il terreno viene aspirato dal vuoto. Tutti i media vengono completamente rimossi dal lato assonale del dispositivo, compresi i media nel canale principale. Per ripetere il processo dopo la rimozione del terreno, si forzano 150 microlitri di terreno nel canale principale posizionando la punta della pipetta all'apertura del canale principale e premendo la pipetta con forza.

Successivamente, il vuoto viene applicato all'apertura del canale principale e al pozzetto superiore del lato assonale del dispositivo. Il vuoto viene nuovamente utilizzato per rimuovere tutto il fluido dal lato assonale, compreso il canale principale. Ancora una volta, 150 microlitri di terreno vengono forzati nel canale principale posizionando la punta della pipetta all'apertura del canale principale e premendo la pipetta con forza.

A questo punto, il ricercatore può visualizzare il dispositivo al microscopio per verificare l'efficienza del taglio dell'assone. Se gli assoni non sono tagliati a sufficienza, il processo può essere ripetuto di nuovo, se necessario. In questo video, ti abbiamo mostrato come preparare i neuroni corticali fetal rack fetale E 18 e caricarli nel dispositivo neuronale.

Il vantaggio principale di questi dispositivi è la capacità di separare e compartimentalizzare la coltura dei corpi cellulari neuronali su un lato del dispositivo da una frazione assonale pura sull'altro lato del dispositivo. Ci auguriamo che tu abbia trovato questo video informativo e utile. Questo è tutto dal John Lab.

Grazie per l'attenzione.