Name: Un modello murino del saggio Cornea Pocket Study Angiogenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Impara l'assay della tasca corneale murina per studiare l'angiogenesi indotta dal basic FGF. Questo modello riproducibile permette di osservare la crescita dei vasi sanguigni dalla limbus verso il pellet.

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La nostra ricerca è sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Eye Institute.

Tutte le attrezzature e reagenti utilizzati sono sterili. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e utilizzo Comitato (ACUC) al NEI / NIH (protocollo di studio su animali NEI-553), ed è stata eseguita secondo le linee guida NIH e regolamenti. 1. Produrre il fattore angiogenico contenenti pellet In questa parte, il pellet contenente il fattore angiogenico di interesse sono preparati. <ol><li> Prova del 10% (w / v) di sucralfato con PBS. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Fai 12% (w / v) poli-HEMA con etanolo assoluto. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Fare 1 mg / soluzione bFGF microlitri. Conservare a -80 ° C. </li><li> Per fare 50 palline, mescolare 5 ml di poli-HEMA, 1ml di sucralfato e 4 ml di soluzione madre bFGF, vortice accuratamente. </li><li> Posizionare un pezzo di parafilm pulita in una capsula di Petri, esporla ai raggi UV per 15 minuti in una cappa di coltura di tessuti. Goccia 0,2 microlitri della miscela soluzione sul parafilm per un pellet. Così, 10 microlitri della miscela soluzione dovrebbe produrre 50 pellet. Lasciate asciugare il pellet a temperatura ambiente per 1-2 ore. Il pellet essiccato possono essere memorizzati in 4 ° C per diversi giorni, o -80 ° C per diversi mesi. </li><li> Al momento dell'utilizzo, leva e raccogliere le palline con le punte di un paio di pinze. Fare molta attenzione a non romperli o di farli primavera distanza. </li></ol> 2. Esecuzione della cornea saggio topo tasca In questa parte, mostreremo come fare una tasca nella cornea del mouse, e come inserire una pallina nella tasca. Il fattore angiogenico contenuta nel pellet verrà rilasciata gradualmente alle zone circostanti della cornea (Fig. 1). In questa dimostrazione, si usa di 8 settimane femmina C57/Bl6 topi. <ol><li> Il mouse è profondamente anestetizzati sistematicamente con la miscela di ketamina (75 mg / kg) e xilazina (5mg/kg, iniezione ip). Ciò manterrà il mouse in uno stato di anestesia per 30-60 min. Anestetico locale (0,5% proparacaina HCl) viene applicato alla cornea. Dopo 5 minuti, fissare un occhio sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Un taglio molto delicato è nel bel mezzo della cornea 1,2 -1,4 mm dal limbus corneale (come illustrato nella figura 1) con un coltello von Graefe cataratta. Fare molta attenzione a non tagliare la cornea. </li><li> Una tasca è fatto sotto lo strato epitelio della cornea da parte orizzontalmente inserendo il coltello verso il centro della cornea ed estendendo il coltello verso la cura limbus (Fig.1). La dimensione della tasca deve essere abbastanza grande per ospitare una fattore angiogenico contenenti pellet. Fare molta attenzione a non forare attraverso la cornea. </li><li> Inserire un pellet con una pinza nella tasca lentamente. Provate a fare il pellet più piatta possibile. </li><li> Dopo l'impianto di pellet, un argomento di attualità pomata oftalmica antibiotica viene applicato per l'occhio. Gli strumenti sono puliti con tamponi imbevuti di alcool al 70% tra gli animali. </li><li> Muovi il mouse in una zona calda e secca e monitorarlo, fino a quando non è in grado di mantenere una postura eretta e poi tornare alla sua gabbia casa. Analgesici sistemici (es. buprenorfina, 2 mg / kg, iniezione ip) e di attualità pomata antibiotica (es. gentamicina) sono dati due volte al giorno per 2 giorni dopo l'intervento e il mouse è strettamente monitorati per 3 giorni. La guarigione è previsto di completare entro le prime 48 ore post-intervento chirurgico. L'occhio con la tasca saranno esaminate sotto un lampada a fessura portata biomicro tra i giorni 4-10 dopo l'impianto a pellet. </li></ol> 3. Rappresentante risultati <ol><li> Sette giorni dopo l'impianto a pellet, il mouse è anestetizzato sistemico e topico, come descritto al punto 2.1. </li><li> Osservare i vasi sanguigni nella cornea indotta dal fattore angiogenico sotto un microscopio da dissezione. Nella cornea trattata con veicolo, non la crescita dei vasi sanguigni possono essere osservati (Fig. 2A, veicoli trattati con cornea). Nella cornea trattata con bFGF, angiogenesi robusta può essere visto (Fig. 2B). La crescita dei vasi sanguigni può essere valutato utilizzando la lunghezza massima dei vasi sanguigni (dai vasi normali limbare alla parte superiore dei vasi nuovi), e il totale aree vaso sanguigno (Fig. 2B, delineato da una linea rossa tratteggiata nel bFGF trattati con cornea). Altri metodi di quantificazione sono stati descritti anche 2,5. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A. Cornea normale con colorazione H &amp; E. Nessun vaso sanguigno esiste in una cornea normale. B. Fai una tasca al di sotto dello strato epitelio della cornea. C. Incorpora una pallina nella tasca. D. Il fattore angiogenico viene rilasciato dal pellet, e crescere nuovi vasi sanguigni dai vasi normali limbari. <img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultato Rappresentante cinque giorni dopo l'impiantagione del pellet. Un. Cornea con un pellet contenente il solo veicolo. Nessuna nuova formazione dei vasi sanguigni nella cornea. Solo i vasi normali preesistenti limbari sono visibili. B. Cornea con un pellet contenente bFGF. Robusto nuovi vasi sanguigni (dot-allineati) sono cresciuti dai vasi normali preesistenti limbare.

<ol><li>Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiogenic+activity+and+hypoxia+induction+of+heterodimers+of+placenta+growth+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor.</a> The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nature. 2, 2545-2550 (2007).</li>
<li>Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+as+a+transplantation+site+for+live+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+is+dispensable+for+blood+vessel+growth+but+critical+for+their+survival%2C+and+VEGF-B+targeting+inhibits+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).</li>
<li>Tong, S., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+angiogenesis+to+basic+fibroblast+growth+factor+in+rat+corneal+pocket+assay%3A+I.+Experimental+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations.</a> Microvascular research. 75, 10-15 (2008).</li>
<li>Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 205, 1416-1418 (1979).</li>
<li>Ziche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+assay+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Corneal assay for angiogenesis.</a> Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).</li>
<li>Ziche, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+pocket+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The corneal pocket assay.</a> Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La cornea del mouse modello tascabile test è stato descritto nel 1979 da Muthukkaruppan VR e Auerbach R 6. Protocolli dettagliati sono stati pubblicati da diversi laboratori 2,3,7,8. Il nostro laboratorio ha modificato e utilizzato questo metodo nei nostri studi per molti anni 4. La cornea saggio topo tasca è un modello relativamente semplice, con grande riproducibilità. Un altro vantaggio di questo modello è che, poiché la cornea non ha vasi sanguigni in genere, non c&#39;è importo mini...

<table border="1"><tbody><tr><th> Attrezzatura </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> PZMIV-BS </td></tr><tr><td> Von Graefe cataratta coltello (1.5x25mm lama, piatto) </td><td> Ambler chirurgica </td><td> 3401E </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinze </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11252-50 </td></tr><tr><td> Lampada a fessura </td><td> Zeiss </td><td> 30 SL-M </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Attrezzature <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> bFGF (fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti) </td><td> Peprotech INC </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Sucralfato (saccarosio octasulfate-alluminio complessi) </td><td> Sigma </td><td> S0652 </td><td> 10% in PBS </td></tr><tr><td> poli-HEMA (Poly (2-idrossietil metacrilato)) </td><td> Sigma </td><td> P3932 </td><td> 12% in etanolo </td></tr></tbody></table> Reagenti tabella 2. E materiali

un modello murino del saggio cornea pocket study angiogenesi

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Una cornea normale è chiaro dei tessuti vascolari. Tuttavia, i vasi sanguigni possono essere indotte a crescere e sopravvivere nella cornea quando potenti fattori angiogenici sono amministrati 1. Questa unicità ha fatto il test tasca cornea uno dei modelli più utilizzati per gli studi di angiogenesi. La cornea compone di più strati di cellule. E &#39;quindi possibile incorporare un pellet contenente il fattore angiogenico di interesse nella cornea per indagare l&#39;effetto angiogenico 2,3. Qui, mettiamo a disposizione una dimostrazione passo passo su come (I) produrre il fattore angiogenico contenenti pellet (II) incorporare il pellet nella cornea (III) analizzare l&#39;angiogenesi indotta dal fattore angiogenico di interesse. Dato che la base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) è noto come uno dei più potenti fattori angiogenici 4, è qui usato per indurre l&#39;angiogenesi nella cornea.

La cornea è unico in quanto manca di tessuti vascolari. Tuttavia, una robusta crescita dei vasi sanguigni e la sopravvivenza può essere indotta nella cornea da potenti fattori angiogenici. Pertanto, la cornea in grado di fornire con noi uno strumento prezioso per gli studi angiogenico. Questo protocollo illustra come eseguire il modello murino di test cornea tasca e come valutare l&#39;angiogenesi indotta da fattori angiogenici utilizzando questo modello.

Un modello murino del saggio Cornea Pocket Study Angiogenesi

Una cornea normale è priva di tessuti vascolari. Tuttavia, è possibile indurre la crescita e la sopravvivenza di vasi sanguigni nella cornea quando potenti fattori angiogenici sono...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare il modello sperimentale del pocket nella cornea del topo per valutare l'effetto angiogenico del FGF di base. Questo viene realizzato creando un'incisione nella cornea del topo e inserendo all'interno del pocket un pellet contenente FGF di base. Il FGF di base viene quindi rilasciato dal pellet e induce la formazione di nuovi vasi sanguigni a partire dai vasi limbali.In definitiva, questo protocollo può indurre una crescita robusta di nuovi vasi sanguigni dai vasi limbali verso il pellet di FGF basico. Ciao, sono Shuan del laboratorio del dottor Shiley presso l'Istituto Nazionale INIH. Il principale vantaggio di questo modello è che si tratta di un modello relativamente semplice con elevata riproducibilità.Un altro vantaggio è che, poiché la normale cornea è priva di vasi sanguigni, lo sfondo è molto ridotto. Ora abbiamo un'idea generale del modello. Vi mostrerò passo dopo passo come realizzare la malattia della popol corneale.Iniziamo. Per prepararsi a questa procedura, preparare le seguenti soluzioni: sate al 10% peso/volume e PBS al 12% peso/volume, poli-HEMA ed etanolo, e FGF di base a un grammo per microlitro. Il FGF di base deve essere conservato a meno 80 gradi Celsius, mentre le altre due soluzioni possono essere conservate a temperatura ambiente.Per preparare 50 pellet di fattori angiogenici, combinare cinque microlitri di soluzione poli-hema, un microlitro di soluzione sate e quattro microlitri di soluzione di FGF basico in una provetta PCR da 200 microlitri, quindi vortexare accuratamente la miscela. Posizionare ora un pezzo di parafilm in una piastra di Petri ed espellere gocce di 0,2 microlitri della miscela sul parafilm.Ogni goccia si seccherà formando un pellet. Lasciare i pellet asciugare a temperatura ambiente per uno o due ore. I pellet essiccati possono essere conservati a quattro gradi Celsius per diversi giorni oppure a meno 80 gradi Celsius per diversi mesi.Per utilizzare i pellet, staccarli delicatamente dal param usando una pinzetta, avendo estrema cura di non romperli né farli schizzare via. Dopo aver anestetizzato un topo con una miscela di chetamina e xilazina, utilizzare una pipetta per applicare 50 microlitri di cloridrato di propano allo 0,5% sulla cornea. Attendere cinque minuti, quindi posizionare il topo sotto un microscopio stereoscopico in modo che un occhio si trovi esattamente sotto l'obiettivo.Utilizzando un bisturi sterile per cataratta von Graefe, effettuare un taglio molto delicato al centro della cornea, a circa 1,2-1,4 millimetri dal limbo corneale. Prestare la massima attenzione a non tagliare completamente attraverso la cornea. Creare ora una tasca al di sotto del strato epiteliale della cornea inserendo orizzontalmente il bisturi nell'incisione ed estendendolo con cautela.Realizzare una tasca sufficientemente grande da contenere un pellet di FGF basilico. Ancora una volta, prestare la massima attenzione a non perforare la cornea. Posizionare il pellet sulla cornea e piegarlo due volte.Utilizzando una pinzetta, inserire lentamente il pellet nella tasca, quindi appiattirlo il più possibile con la pinzetta. Per completare la procedura, utilizzare un applicatore con punta oftalmica per coprire l'intero occhio. Applicare un unguento oftalmico antibiotico topico e spostare il topo in un'area calda e asciutta. Quando il topo sarà in grado di mantenere una postura eretta, restituirlo al suo contenitore abituale due volte al giorno durante il periodo di recupero.Applicare analgesici sistemici come la buprenorfina e un unguento antibiotico topico sull'occhio tra i quattro e i dieci giorni successivi all'implantazione del pellet, anestetizzare il topo ed esaminare l'occhio. Allo slit lamp e al microscopio biologico, i vasi sanguigni nella cornea indotti dal fattore angiogenico sono stati osservati al microscopio stereoscopico e in una cornea trattata solo con il veicolo. Nessuna crescita di vasi sanguigni è stata osservata in una cornea trattata con FGF basico, evidenza di angiogenesi.La crescita di nuovi vasi sanguigni è stata robusta. La crescita dei vasi sanguigni è stata valutata misurando la loro lunghezza massima tra i vasi limbali normali e l'estremità superiore dei nuovi vasi. Analogamente, è stata misurata anche l'area totale dei vasi sanguigni.Come vedi, si tratta di una procedura relativamente semplice. Una volta acquisita padronanza, può essere eseguita in cinque minuti per un occhio. Durante questa procedura, è necessario prestare particolare attenzione, specialmente quando si cerca di creare la tasca e di inserire la padella nella tasca.Il coltello deve essere maneggiato con precisione in modo da non perforare la cornea. Pertanto, grazie per la vostra attenzione. Buona fortuna.

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Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l'angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l'avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.

Rat mesentere angiogenesi Assay

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Neovascolarizzazione (NV) della cornea può complicare molteplici patologie visive. Utilizzando un modello di lesione alcali-un'ustione controllata, un livello quantificabile di NV corneale può essere prodotta per lo studio meccanicistico di NV corneale e valutazione di potenziali terapie per i disordini neovascolare.

Un Injury Modello alcali-burn di neovascolarizzazione corneale nel mouse

Il protocollo descrive il dosaggio micropocket corneale come sviluppato nei topi.

Il corneale MICROPOCKET Assay: Un modello di angiogenesi nel Eye mouse

Qui, presentiamo il protocollo di neovascolarizzazione coroideale indotta da laser (CNV) di topo, un modello sperimentale che ricrea i segni distintivi vascolari della degenerazione maculare neovascolare legata all'età (AMD). Una volta padroneggiato, può indurre in modo affidabile ed efficace la CNV come sistema modello per testare varie misure sperimentali.

Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

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Puntura-indotta di Neovascularization dell'iride come un modello murino di Rubeosis Iridis

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Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Questo protocollo presenta il saggio di germinazione coroide, un modello ex vivo di proliferazione microvascolare. Questo saggio può essere utilizzato per valutare le vie coinvolte nei micro vasi cororoidali proliferano e valutare i trattamenti farmacologici utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.

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Questo protocollo si concentra sulla neovascolarizzazione corneale indotta da ustioni alcaline nei topi. Il metodo genera un modello di malattia corneale riproducibile e controllabile per studiare l'angiogenesi patologica e i meccanismi molecolari associati e per testare nuovi agenti farmacologici per prevenire la neovascolarizzazione corneale.

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