Name: A lungo termine Cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Scopri la coltura a lungo termine di tessuto tumorale primario di cancro al seno e la quantificazione tridimensionale della crescita mediante tomografia ottica di proiezione. Questo metodo consente di valutare le risposte individuali ai farmaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Lorna Renshaw (Breast Unit di Edimburgo) per la sua preziosa assistenza per ottenere campioni clinici. Utilizzo di materiale tumorale è stato approvato dal Comitato Etico di ricerca Lothian (08/S1101/41) e ottenuto sotto l&#39;egida del Centro di Medicina Sperimentale Cancer programma (Edimburgo). Questo lavoro è supportato dal Consiglio scozzese finanziamento. ADL è una signorina Margaret Butters Reekie compagni Fiducia clinica.

1. Estrarre collagene da Tails Rat <ol><li> Luogo fresco congelato code di ratto in etanolo al 70%. </li><li> Deglove la cute sovrastante i tendini con un bisturi esporre. </li><li> Striscia tendini dalla coda e il luogo in etanolo al 70% per sterilizzare. </li><li> Pesare i tendini raccolta e trasferimento in acido acetico (tendine 1g per 250 ml di acido acetico 0,5 M). Mescolare per 48 ore a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il mix acido tendine / acetico a 10.000 g per 30 minuti e scartare il pellet. </li><li> Aggiungere un volume equivalente del 10% (w / v) di NaCl il supernatante e lasciare il mix riposare per una notte a 4 ° C. </li><li> Raccogliere il collagene ricchi, strato insolubile fondo e centrifugato per un ulteriore 30 min a 10.000 g </li><li> Risospendere il collagene materiale ricco in acido acetico 0.25M a 4 ° C e dializzato contro 1:1000 acido acetico al 4 ° C per 3 giorni, cambiando il buffer di dialisi due volte al giorno. </li><li> Sterilizzare ulteriormente la soluzione di collagene per centrifugazione (20.000 g per 2 ore) e conservare a 4 ° C. </li><li> Diluire collagene come richiesto con l'aggiunta di acido sterile 1:1000 acetico ad una concentrazione stock di 1mg/ml. </li></ol> 2. Saggio di creazione 3D L'analisi 3D è basato su una linea cellulare saggio, pubblicato in precedenza 2. <ol><li> Biopsie multiple core vengono raccolte da pazienti consenzienti al momento della resezione chirurgica curativa per il tumore mammario invasivo. </li><li> Ad occhio, dividere i nuclei con un bisturi in 1 millimetro 3 frammenti. Tagliare ed eliminare il grasso macroscopicamente distinte. </li><li> Immergere i frammenti in MEGM mezzi di comunicazione completa. Il tessuto può essere immagazzinato in questo stato per un massimo di 1 ora. </li><li> Per creare il gel di collagene, mix sul collagene ghiaccio coda di topo 1mg/ml, 1:1000 filtrato acido acetico, 10x DMEM/F12 e NaOH 0.22M in un rapporto di 3:5:1:1 per creare una concentrazione finale di 0,3 collagene mg / ml. </li><li> Iniettare 1,2 ml di miscela di collagene nei singoli pozzetti di una piastra ben 24 e riporre in un incubatore a 37 ° C per 10 minuti per iniziare gelificante. </li><li> Dopo 10 minuti, rimuovere la piastra ben 24 dal termostato. Mettere i pezzi tumore al collagene gelificazione e delicatamente spingere al centro del gel con una punta 10μl pipetta. Ritorna il piatto ben 24 per l'incubatore per 1 ora. </li><li> Per i tumori ER +, supplemento MEGM mezzi Completo di β-estradiolo a una concentrazione di 3.2x10 -10 M. Una volta che i saggi di gel hanno gelificato per 1 ora, con attenzione introdurre 1,2 mL del supporto integrato in ciascun pozzetto. La finale β-estradiolo concentrazione all'interno del saggio sarà equilibriate di 1.6x10 -10 m di ricapitolare i livelli di estrogeni fisiologici trovato nel tessuto mammario 3. </li><li> Eseguire una punta 10μl pipetta attorno al bordo interno di ogni bene, rilasciando ogni gel circonferenza in modo che ciascuno gel di galleggiare liberamente all'interno dei media. Ritorna il piatto ben 24 per l'incubatrice. </li><li> Scambio integrato dei media due volte alla settimana fino al termine dell'esperimento. Interrompere l'esperimento, eliminando i media e l'aggiunta di un fissativo formalina. </li></ol> 3. La colorazione degli anticorpi del saggio in preparazione per la Tomografia Ottica di proiezione Abbiamo adottato un metodo precedentemente pubblicato per 4 intera colorazione del campione. <ol><li> Lavare campioni fissati in formalina per 30 min in PBS. Disidratare i gel graduale in metanolo diluito in PBS contenente 0,05% di Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% e 100% per ≥ 15 minuti ad ogni passo. </li><li> Incubare il tessuto in appena preparato MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 ad un rapporto di 2:01:03 (15% v / v H 2 O 2) a temperatura ambiente per 24 ore per spegnere l'autofluorescenza. </li><li> Lavare i campioni due volte per 30 minuti in metanolo. Congelare i campioni a -80 ° C cinque volte per almeno 1 ora ogni volta e torna a temperatura ambiente (RT) per assicurare che gli antigeni nelle parti più profonde del tessuto sono resi accessibili. </li><li> Reidratare il tessuto torna al 0,05% PBST con metanolo come diluente (33%, 66% e 100% per 15 minuti ad ogni passo). </li><li> Bloccare il tessuto nel bloccare soluzione (10% di siero in PBST 0,05%) per 24 ore. </li><li> Incubare il tessuto con l'anticorpo primario per identificare il contenuto epiteliali, utilizzando coniglio anti-citocheratina ad una concentrazione di 1:500 diluito in 1,5 ml di soluzione bloccante contenente il 5% DMSO per 48 ore. </li><li> Lavare i campioni quattro volte con PBST 0,05% per ogni 30 min. </li><li> Incubare il tessuto fluorescente con anticorpo secondario (1:100 capra anti-coniglio Alexa555), diluito in 1,5 ml soluzione bloccante contenente il 5% DMSO per 48 ore. </li><li> Lavare i campioni di nuovo con 0,05% PBST quattro volte per 30 minuti ciascuno. </li></ol> 4. Proiezione Tomografia ottica Tomografia ottica di proiezione è una tecnica di microscopia precedentemente sviluppato per produrre immagini 3D ad alta risoluzione di campioni biologici fluorescente con uno spessore fino a 15 millimetri 5. <ol><li> Montare il sgel mantenuto in 1% di agarosio a basso punto di fusione e disidratare in 100% di metanolo per 24 ore. Cancella il campione in BABB soluzione (1:2 alcool benzilico, benzil benzoato) per 48 ore e la scansione con lo scanner OPT 3001M (Bioptonics). </li><li> Bersaglio e autofluorescenza vengono catturati utilizzando il Cy3 set di filtri (eccitatore 545nm/30 nm, emettitore 610/75 nm) e GFP1 set di filtri (eccitatore 425nm/40 nm, emettitore LP475 nm) rispettivamente. </li></ol> 5. Ricostruzione e quantificazione 3D <ol><li> L'insieme di proiezioni angolari acquisita da OPT può essere ricostruita utilizzando NRecon software (SkyScan) per creare una serie di fette di sezione trasversale attraverso l'analisi invasione. Questo software è disponibile per il download gratuito a <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Analizzare i dati ricostruiti utilizzando un software Volocity (PerkinElmer). Software dimostrativo gratuito è disponibile per il download all'indirizzo <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> Al fine di quantificare il volume epiteliali dalla colorazione citocheratina, impostare una soglia minima di intensità voxel per ridurre le interferenze da fluorescenza di fondo nel canale di destinazione. Abbiamo definito questa soglia empiricamente a 9000 au Utilizzando un elenco dei parametri disponibili nella richiesta di misura, abbiamo quantificato il volume di epitelio in continuità con il nucleo originario (delimitata nel canale autofluorescenti). Questo ci ha permesso di quantificare i volumi di escrescenza epiteliali tra le diverse campioni di tumore. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Durante lo sviluppo del test, un totale di 52 campioni di tumore della mammella biopsia con una vasta gamma di istopatologia sono stati utilizzati. Di questi &lt;10% (5 / 52) non è riuscito a fornire almeno un test valido invasione. Fallimento del test è dovuto a uno sovra-infezione batterica o insufficiente materiale tumorale biopsia. Pertanto l'applicazione del test non è limitato a uno specifico sottotipo di tumore al seno. Saggi tipici (figura 1) fissato dopo 20 giorni in cultura collagene e successivamente colorati per citocheratina. Il software Volocity è in grado di riconoscere sia il grosso epiteliale continuo con il nucleo originario e gruppi distaccata di invadere le cellule e quantificare ogni volume separatamente. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Saggi Invasion dopo la fissazione e la quantificazione. Il saggio sostiene campioni ottenuti da più sottotipi cancro al seno: a) ER + b) HER2 + e c) ER-.

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW e JF sono dipendenti di MRC Technology, che sta commercializzando Bioptonics scanner OPT. Altri autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

A base di collagene saggi per studiare il comportamento delle linee di cellule tumorali sono ora ampiamente utilizzate 6,7,8. Tuttavia, queste analisi non hanno riflesso in pieno la complessità del tumore e del suo ambiente. In questo studio, abbiamo dimostrato che il cancro al seno umano i materiali possono essere usati in modo simile, ex vivo. Inoltre, OPT è un utile strumento per caratterizzare l&#39;espansione 3D di cancro al seno. Abbiamo scoperto che il limite principale di questa tecnica è la disponibilità di materiali tumore (un unico nucleo biopsia è sufficiente per 4-6 test). Un altro fattore limitante è che l&#39;invasione strutturale si verifica solo nel 40% dei test. Per ovviare a questo, abbiamo regolarmente aggiungere qualsiasi trattamento desiderato intorno al giorno 7 per tutti i test con una crescita visibile. L&#39;uso di OPT potrebbe essere estesa in futuro anche per rilevare i cambiamenti di massa, ex vivo, derivante dalla terapia farmacologica. Ciò a sua volta potrebbe facilitare la terapia del cancro più individualizzata, indipendente di modelli animali. Stiamo attualmente valutando la risposta dei tumori ER + a tamoxifene ex vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo No. </td></tr><tr><td> Completa MEGM </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-estradiolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E8875-250mg </td></tr><tr><td> Coniglio anti-citocheratina </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> Capra anti-coniglio Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> Tutti gli altri reagenti di serie sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich.

a lungo termine cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Il cancro al seno è una delle principali cause di mortalità nel mondo occidentale. E &#39;ben noto che la diffusione del tumore al seno, prima localmente e poi distalmente, è un fattore importante nella prognosi dei pazienti. Sistemi sperimentali di tumore al seno si basano su linee cellulari derivate da tumori di solito primaria o versamento pleurico. Due gli ostacoli principali ostacolare questa ricerca: (i) alcune note sotto-tipi di tumori al seno (in particolare scarsa prognosi dei tumori luminale B) non sono rappresentati all&#39;interno di raccolte di linea corrente, (ii) l&#39;influenza del microambiente tumorale di solito non è presa in considerazione. Dimostriamo una tecnica per i campioni del cancro al seno primario cultura di tutti i sub-tipi. Questo è ottenuto utilizzando tridimensionale (3D) sistema di coltura in cui sono inserite piccole parti di tumore nel ratto collagene I cuscini morbidi. Entro 2-3 settimane, le cellule tumorali diffuse nel collagene e forma diverse strutture simili a quelli osservati in tumours1 umano. Adipociti vitali, le cellule epiteliali e fibroblasti all&#39;interno del nucleo originario erano evidenti sulla istologia. Maligna delle cellule epiteliali con morfologia squamoidi sono state dimostrate in invadendo il collagene circostante. Pleomorfismo nucleare era evidente all&#39;interno di queste cellule, insieme a figure mitotiche e corpi apoptotici. Abbiamo impiegato Tomografia Ottica di proiezione (OPT), una tecnologia di imaging 3D, al fine di quantificare l&#39;entità della diffusione del tumore nella cultura. Abbiamo usato OPT per misurare il volume della cultura di massa del tumore, un parametro di routine misurati durante la terapia neo-adiuvante dei pazienti con cancro al seno per valutare la risposta alla terapia farmacologica. Qui, vi presentiamo l&#39;opportunità di tumori al seno cultura umana, senza sotto-tipo di polarizzazione e quantificare la diffusione di questi ex-vivo. Questo metodo potrebbe essere utilizzato in futuro per quantificare la sensibilità ai farmaci nel tumore originale. Questo può fornire un modello più predittivo di linee cellulari attualmente in uso.

Abbiamo sviluppato una base di collagene<em&gt; In vitro</emTest&gt; che promuove la proliferazione e l&#39;invasione da campioni di tutti i sottotipi di tumore al seno. Tomografia ottica di proiezione, una tecnica di microscopia a tre dimensioni è stato utilizzato per visualizzare e quantificare l&#39;espansione del tumore. Il test può essere utilizzato per quantificare risposta ai farmaci dei singoli campioni tumorali.

A lungo termine Cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione

Il cancro al seno è una delle principali cause di mortalità nel mondo occidentale. È ben noto che la diffusione del cancro al seno, prima a livello locale e successivamente...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una coltura a lungo termine di tessuto tumorale primario del seno e quantificare il modello di crescita tridimensionale. Questo viene ottenuto estraendo innanzitutto il collagene di tipo I dalle code dei ratti. Successivamente, il campione di biopsia tumorale viene preparato e incorporato nella matrice di collagene.Dopo 20 giorni di coltura, il tessuto del cancro al seno viene colorato mediante immunofluorescenza e scansionato utilizzando la tomografia a proiezione ottica, quindi i dati vengono ricostruiti e quantificati. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano il modello di invasione del tumore di un individuo, che può essere ulteriormente quantificato mediante analisi tridimensionale. Il vantaggio principale delle colture ex vivo è che utilizza materiali tumorali reali in un contesto fisiologico.A differenza delle colture di linee cellulari, la dimostrazione visiva di questa tecnica è importante poiché è difficile ottenere tessuto tumorale primario. La tecnica corretta ottimizzerà le probabilità di un esito sperimentale di successo. A illustrare questa tecnica sarò io e Joanne Farrell di MRC Technology, per iniziare l'estrazione del collagene di tipo uno.Posizionare le code di ratto congelate in etanolo al 70% fino a scongelamento. Utilizzando un bisturi, rimuovere la pelle sovrastante per esporre i tendini, staccare i tendini dalla coda e posizionarli in etanolo al 70% per sterilizzarli. Pesare i tendini raccolti e trasferirli in acido acetico.Agitare per 48 ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare la miscela di acido acetico e tendine a 10.000 ×g per 30 minuti e scartare il pellet.Aggiungere un volume uguale di cloruro di sodio al 10% al sopranatante S e lasciare riposare la miscela tutta la notte a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare lo strato superiore. Quindi raccogliere lo strato inferiore insolubile ricco di collagene e centrifugare per 30 minuti a 10.000 volte.Successivamente, risospendere per gravità il materiale ricco di collagene in acido acetico 0,25 molare a quattro gradi Celsius e trasferirlo con una pipetta in un sacchetto da dialisi. Eseguire la dialisi contro acido acetico da 1 a 1000 a quattro gradi Celsius per tre giorni.Cambiare il buffer di dialisi due volte al giorno. Il collagene può essere ulteriormente sterilizzato mediante un'ulteriore centrifugazione e sospensione in acido acetico per questo saggio. Iniziare con prelievi multipli mediante biopsia a carota, ottenuti da pazienti consenzienti al momento della resezione chirurgica curativa per carcinoma mammario invasivo, effettuando la selezione ad occhio nudo e utilizzando un bisturi.Dividere il campione in frammenti di un millimetro cubo, eliminare e scartare qualsiasi grasso macroscopicamente distinto. Montare il campione su una lama di bisturi permette una migliore visualizzazione all'interno della cappa e rende la dissezione precisa e sicura. Immergere i frammenti nel mezzo completo MEGM.Il tessuto può essere conservato in questo stato per un massimo di un'ora per ottenere una miscela di gel di collagene a 0,3 milligrammi per millilitro. Preparare la collagene su ghiaccio, con 1 milligrammo per millilitro di collagene da coda di ratto, acido acetico filtrato 1:1000, D-M-E-M-F 12 e idrossido di sodio 0,22 molare; pipettare 1,2 millilitri della miscela di collagene in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e inserire nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Per avviare la gelificazione, rimuovere la piastra dall'incubatore.Posizionare i frammenti tumorali sul collagene gelificato e utilizzare la punta di una pipetta da 10 microlitri per spingerli delicatamente al centro del gel. Rimettere la piastra nell'incubatore per un'ora. Integrate il mezzo completo A-M-E-G-M con beta-estradiolo fino a una concentrazione finale di 3,2 × 10⁻¹⁰ M.Dopo che i saggi su gel sono stati incubati per un'ora, introdurre con attenzione 1,2 millilitri di mezzo supplementato in ogni pozzetto. La concentrazione finale di beta-estradiolo si equilibrerà a 1,6 × 10⁻¹⁰ M per riprodurre i livelli fisiologici di estrogeni presenti nel tessuto mammario. Passare la punta di una pipetta da 10 microlitri lungo il bordo interno di ciascun pozzetto, staccando ogni gel in senso circonferenziale, in modo che ciascun gel possa galleggiare liberamente nel mezzo.Riportare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore e sostituire il mezzo supplementato due volte alla settimana fino al termine dell'esperimento. La crescita invasiva può essere osservata in tempo reale mediante microscopio a campo chiaro. Un video con acquisizione a intervalli di tempo e profondità di fuoco estesa dimostra l'invasione dell'epitelio da parte del margine tumorale nel collagene circostante nell'arco di 60 ore, dal giorno sette al giorno nove.Terminare l'esperimento rimuovendo il mezzo e aggiungendo una formula. Fissativo per 48 ore per immunomarcare i campioni del saggio 3D per la tomografia a proiezione ottica. Trasferire prima i campioni fissati con formalina dalle pozzette a un vial.Quindi lavarli per 30 minuti. Eseguire una disidratazione graduale dei gel in PBS utilizzando metanolo diluito in PBS contenente 0,05% di Tween 20; incubare il tessuto in metanolo DMSO 30% perossido di idrogeno appena preparato in un rapporto di due a uno a tre a temperatura ambiente per 24 ore per eliminare la autofluorescenza. Successivamente, lavare i campioni due volte per 30 minuti.Nel congelamento-scongelamento con metanolo, sottoporre i campioni a cinque cicli di passaggio da meno 80 gradi Celsius a temperatura ambiente, mantenendo ciascun ciclo per almeno un'ora, al fine di garantire che gli antigeni nelle parti più profonde del tessuto diventino accessibili. Successivamente, riidratare il tessuto in PBS con 0,05%T tra 20 utilizzando il metanolo come diluente, incubare il tessuto in soluzione bloccante per 24 ore a quattro gradi Celsius per identificare il contenuto epiteliale, quindi incubare i campioni in anticorpi primari coniglio anti-citocheratina diluiti in 1,5 millilitri di soluzione bloccante con 5%DMSO per 48 ore a quattro gradi Celsius. Lavare i campioni in PBS con 0,05%T tra 24 volte per 30 minuti ciascuna.Incubare il tessuto in anticorpi secondari fluorescenti, diluiti in 1,5 millilitri di soluzione bloccante contenente DMSO al 5% per 48 ore a quattro gradi Celsius. Lavare nuovamente i campioni in PBS con 0,05% per 24 volte, ciascuna di 30 minuti. Per preparare i campioni per la tomografia a proiezione ottica, montare il gel colorato in agarosio a basso punto di fusione all'1% e disidratare in metanolo al 100% per 24 ore.Successivamente, chiarire il campione in soluzione BABB per 48 ore. Scansionare i campioni utilizzando lo scanner OPT 3001 M. Sia il segnale target che l'autofluorescenza vengono acquisiti rispettivamente con i set di filtri SI three e GFP one.Il campione è supportato all'interno di un cilindro trasparente di gel aro e ruotato con incrementi angolari di 0,9 gradi. Viene acquisita un'immagine digitale del campione statico in ciascuna delle 400 posizioni ruotate. Utilizzare il software n recon per ricostruire l'insieme delle proiezioni angolari acquisite mediante OPT, creando una serie di sezioni trasversali attraverso il saggio di invasione.Analizzare i dati ricostruiti utilizzando un software di velocità per quantificare il volume epiteliale mediante citocheratina. Colorazione, impostare una soglia minima di intensità del voxel per ridurre l'interferenza della fluorescenza di fondo nel canale bersaglio. Qui. Questa soglia è definita empiricamente a 9.000 unità arbitrarie.Infine, utilizzare un elenco dei parametri disponibili nell'applicazione di misurazione e i dati del canale autofluorescente, che delimita l'epitelio continuo con il core originale, per quantificare il volume dell'epitelio in una proliferazione tumorale. Qui è mostrato un saggio tipico fissato dopo 20 giorni di coltura in collagene e successivamente colorato per la citocheratina. Il software Velocity è in grado di riconoscere sia la massa epiteliale, continua con il core originale, sia i gruppi staccati di cellule invasive, e di quantificare separatamente ciascun volume.I biopsie originali ottenute provenivano da una varietà di tumori dopo colture ex vivo. Si potrebbero utilizzare anche altre tecniche, come l'immunoeistochemia o l'immunofluorescenza, per determinare i tassi di proliferazione o di apoptosi o qualsiasi parametro simile. Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della ricerca traslazionale sul cancro al seno di esplorare metodi per identificare la resistenza ai farmaci in individui affetti da cancro al seno.

long-term-culture-human-breast-cancer-specimens-their-analysis-using

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Huang, Y. et. al., Monitoraggio morfologico e fisiologico longitudinale di sferoidi tumorali tridimensionali mediante tomografia a coerenza ottica. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra l'uso della coerenza ottica tomografia (OCT) per monitorare gli sferoidi tumorali in una piastra multipozzetto acquisendo immagini in sezione trasversale ad alta risoluzione. Analizzando i riflessi di luce dalle strutture cellulari, OCT costruisce modelli 3D per valutare caratteristiche morfologiche...

Monitoraggio morfologico e fisiologico degli sferoidi tumorali mediante tomografia a coerenza ottica 

Masse di tessuto complesse, da organi di tumori, sono composti da vari elementi cellulari. Abbiamo chiarito il contributo di fenotipi cellulari all'interno di un tessuto utilizzando multi-etichettati topi transgenici fluorescenti in combinazione con multiparametrica immunofluorescenza seguita da unmixing spettrale di decifrare origine cellulare e caratteristiche cellulari basati su espressione della proteina.

Quantitative Analysis multispettrali Dopo tessuto fluorescente Trapianto per la visualizzazione delle origini cellulari, tipi e interazioni

L'analisi ex vivo delle lesioni arteriose da modelli animali di malattie cardiovascolari si basa classicamente su tecniche istologiche e immunoistochimiche. Questi forniscono misurazioni bidimensionali in lesioni tridimensionali. Questo manoscritto descrive la generazione di lesioni arteriose per l'analisi quantitativa in 3 dimensioni utilizzando la tomografia a proiezione ottica.

Generazione e quantificazione 3-Dimensional di arteriosa lesioni nei topi mediante tomografia ottica di proiezione

Tre coltura tridimensionale di cellule epiteliali mammarie su una membrana basale ricostituita è un metodo utile ricordare l'architettura in vivo del seno benigno, e per differenziare il fenotipo maligno dal fenotipo seno benigno. È importante sottolineare che questo sistema può essere applicato a studiare carcinomi invasivi in ​​altri tessuti.

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Tomografia a coerenza ottica (OCT), una tecnologia di imaging tridimensionale, è stata utilizzata per monitorare e caratterizzare la cinetica di crescita di sferoidi multicellulari del tumore. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore usando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto morto privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica, sono stati dimostrati.

Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica

Le colture tridimensionali di campioni di BMPC pazienti e xenografi del carcinoma della prostata metastatica ossea mantengono l'eterogeneità funzionale dei loro tumori originali con conseguenti cisti, sferoidi e organoidi complessi simili a tumori. Questo manoscritto fornisce una strategia di ottimizzazione e un protocollo per la cultura 3D di campioni eterogenei derivati dai pazienti e la loro analisi utilizzando IFC.

Istituzione e analisi di organidi tridimensionali (3D) Derivati dagli spettri della metastasi ossea del cancro della prostata del paziente e dai loro xenoinfi

Gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono un potente strumento nella ricerca traslazionale sul cancro, che riflette sia l'eterogeneità genetica che fenotipica della malattia e la risposta alle terapie antitumorali personalizzate. Qui, viene dettagliato un protocollo consolidato per generare DOP di carcinoma della vescica primario umano in preparazione per la valutazione delle analisi fenotipiche e delle risposte ai farmaci.

Coltura di organoidi del cancro della vescica come strumenti di medicina di precisione

Descriviamo un protocollo per la produzione, la coltura e la visualizzazione dei tumori umani, che hanno metastatizzato alle superfici peritoneali. I campioni tumorali resecati vengono tagliati utilizzando un vibratomo e coltivati su inserti permeabili per una maggiore ossigenazione e vitalità, seguiti da imaging e analisi a valle utilizzando microscopia confocale e citometria a flusso.

Coltura e imaging di fette tumorali ex vivo di pseudomixoma peritonei organotipico da campioni tumorali umani resecati

Qui viene fornito un protocollo dettagliato per stabilire organoidi mammari umani da resezioni di tumore al seno derivate da pazienti o tessuto mammario normale. Il protocollo fornisce istruzioni dettagliate complete per la coltivazione, il congelamento e lo scongelamento degli organoidi mammari derivati dal paziente umano.

Istituzione e coltura di organoidi mammari derivati da pazienti

Questo protocollo offre un quadro sistematico per la creazione di organoidi di carcinoma ovarico provenienti da diversi stadi di malattia e affronta le sfide della variabilità specifica del paziente per aumentare la resa e consentire una robusta espansione a lungo termine per le applicazioni successive. Include passaggi dettagliati per la lavorazione dei tessuti, la semina, la regolazione dei requisiti dei terreni e la colorazione in immunofluorescenza.

Strategia per la biobanca degli organoidi del carcinoma ovarico: affrontare l'eterogeneità interpaziente tra sottotipi istologici e stadi di malattia

Scopri la coltura a lungo termine di tessuto tumorale primario di cancro al seno e la quantificazione tridimensionale della crescita mediante tomografia ottica di proiezione. Questo metodo consente di valutare le risposte individuali ai farmaci.

A lungo termine Cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione

Esplora altri video