Name: Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Scopri la mappatura dei circuiti neuronali inibitori mediante fotostimolazione laser e registrazioni whole cell in topi transgenici GFP. Questo metodo consente di analizzare l'organizzazione funzionale delle reti corticali inibitorie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of concede Salute DA023700 e DA023700-04S1 al XX

1. Cervello fetta preparazione <ol><li> Topi transgenici sono profondamente anestetizzati con sodio pentobarbital (&gt; 100 mg / kg, ip) e rapidamente decapitati, ei loro cervelli estratti in una soluzione di taglio congelato e ossigenato. </li><li> Occhiali GFP sono usati per lo screening visivo se il cervello di topo esprime davvero GFP. </li><li> Sezioni della corteccia somatosensoriale primaria di 400 micron di spessore vengono tagliate con un vibratome in saccarosio-contenente artificiale liquido cerebrospinale (ACSF). Fette vengono prima incubati in saccarosio-contenente ACSF per 30 minuti a 1 ora a 32 ° C, e dopo il periodo di incubazione iniziale, trasferito ACSF registrazione a temperatura ambiente. In tutta l'incubazione e la registrazione, le fette sono continuamente bolle con il 95% O 2 -5% di CO 2. </li></ol> 2. Attrezzature di avvio L'implementazione del sistema complessivo è illustrato nella figura 1. <ol><li> Il sistema di raffreddamento laser e alimentatore è acceso, ricevendo il laser pronto. </li><li> Tutto l'hardware relative al controllo fotostimolazione (compreso il sistema specchio di scansione, un modulatore ottico, un otturatore elettronico e un amplificatore di ingresso fotodiodo) è acceso. </li><li> L'attrezzatura di elettrofisiologia (tra cui un amplificatore Multiclamp 700B e micromanipolatori) è acceso. Le registrazioni elettrofisiologiche, fotostimolazione, e di imaging delle preparazioni fetta sono fatte in una camera di perfusione fetta montato sul palco motorizzato del microscopio. </li><li> La telecamera di imaging (Retiga 2000, Q-imaging, Austin, TX) è acceso. Fette sono visualizzate con il microscopio in posizione verticale (BW51X, Olympus) con un contrasto a infrarossi interferenza differenziale (DIC) e epi-fluorescenza ottica attraverso il sistema di imaging. </li><li> Il software basato su Matlab EPHUS e Q-capture software della fotocamera sono state create. Un'usanza modificati versione del software Ephus (Ephus, disponibile a <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/</a> ) è utilizzato per controllare i protocolli fotostimolazione e acquisire i dati fotostimolazione. </li><li> Dopo che il sistema è acceso, si dovrebbe verificare se il sistema fotostimolazione laser è in uno stato di lavoro. Poiché l'obiettivo 4x microscopio viene utilizzato per fornire i lampi di raggi UV uncaging glutammato, un pezzo di carta bianca può essere messo sotto per osservare il modello di scansione laser, mentre il sistema funziona. </li></ol> 3. La creazione di perfusione fetta <ol><li> Un sistema di perfusione pressione è acceso per alimentare il ACSF registrazione nella camera fetta. La cura è presa per assicurare un livello costante del liquido di 2,0 mm al di sopra della fetta nella camera. </li><li> Un'aliquota della soluzione madre di MNI-gabbia-glutammato viene aggiunto a 25 ml di circolazione ACSF per una concentrazione di 0,2 mM glutammato in gabbia. Si prega di notare che dopo 5-6 ore di sperimentazione, la soluzione bagno e MNI-glutammato sarà aggiornata. </li><li> Una fetta cervello è spostato nella camera di registrazione. Si può eseguire il sistema di imaging per verificare la qualità e la fetta anatomicamente individuare l'area somatosensoriale primaria. Poi la fetta è ancorato con una misura anello in platino a corda. Fare attenzione a non mettere l'ancora sopra la regione del cervello destinata per le registrazioni. </li></ol> 4. Cellula intera patch-bloccaggio di registrazione <ol><li> Elettrodi di vetro (4-6 MΩ resistenza) sono tirati e riempito con una soluzione interna contenente 0,1% biocitina per l'etichettatura e identificazione morfologica delle cellule. </li><li> Per eseguire la registrazione delle patch, le cellule vengono visualizzati in l'obiettivo 60x. Tipi di cellule inibitorie sono prima individuati e selezionati sulla base di visualizzazione di espressione GFP sotto un microscopio DIC / a fluorescenza Olympus, le registrazioni vengono poi eseguiti sotto il controllo visivo aiutato dal monitoraggio video a infrarossi DIC. Si prega di notare che un paio di volte di passare tra le modalità DIC e fluorescenza è necessario per confermare la posizione della cella GFP mentre si avvicina l'elettrodo alla cella di destinazione. </li><li> Tradizionali tecniche di patch-bloccaggio vengono applicati. L'elettrodo viene riempito con pressione positiva, si è trasferito vicino alla superficie della cellula per stabilire una fossetta visibile sulla membrana delle cellule bersaglio, e poi la pressione negativa viene applicata rapidamente per formare un gigaseal e rottura durante il monitoraggio delle risposte iniezione di corrente sul monitor video. </li><li> Al momento di rottura in, le immagini della cellula a 60x in modalità DIC e fluorescenza sono presi per la verifica on-line. Prima raccolta di dati fotostimolazione, iperpolarizzante e impulsi di corrente depolarizzante vengono iniettate per esaminare le proprietà elettrofisiologiche di base di ogni cella. </li><li> Una volta che le registrazioni stabili cellula intera si ottengono con una buona resistenza di accesso (di solito &lt;20 MΩ), l'obiettivo microscopio passa da 60x a 4x per fotostimolazione scansione laser. L'immagine fetta a 4x è acquisito e sarà utilizzato per la guida e la registrazione di siti fotostimolazione. </li></ol> 5. Laser scanning fotostimolazione <ol><li> I parametri di acquisizione dati e fotostimolazione è fissato dal attivando il modulo switch di configurazione Ephus. Normalmente, 1 ms laser (20 mW), con un intervallo di stimolo di 1 secondo viene utilizzato per la mappatura fotostimolazione. Tracce di dati di 1 secondo campionato a 10 kHz vengono acquisiti. </li><li> L'immagine fetta 4x viene caricata nel modulo mapper di Ephus. La posizione del soma cellulare è definito, e siti fotostimolazione di uno schema 16x16 (80 micron x 80 micron spaziatura) sono costituiti intorno alla posizione della cella, che copre tutti gli strati corticali. </li><li> Il profilo di eccitazione del neurone registrato è mappata esaminando le posizioni spiking in risposta alla fotostimolazione alla modalità morsetto corrente. Il nostro software user-friendly con l'on-line funzioni di visualizzazione facilita gli esperimenti di mappatura. </li><li> Locali collegamenti del circuito eccitatorio sono mappati dal rilevamento di correnti post-sinaptici eccitatori (EPSC) dalla cella registrato mentre scansione laser in luoghi diversi. La cella è tenuto a -70 mV in modalità morsetto tensione verso l'interno per rilevare le correnti eccitatorie. Le mappe EPSC si ripetono 2-3 volte con il modello fotostimolazione ruotato o capovolto. </li><li> Opzionale: Locale collegamenti del circuito inibitorio può anche mappati con il rilevamento delle correnti post-sinaptiche inibitorie (IPSC) dalla cella registrata presso vicino a 0 mV in modalità morsetto tensione verso l'esterno per rilevare correnti inibitorie. Si noti che è meglio usare la soluzione interna elettrodo con potassio sostituito con cesio per la mappatura IPSC. </li><li> Dopo tutte le analisi fisiologiche sono state completate, l'elettrodo viene delicatamente rimosso dalla cella registrati. La fetta cervello è portato fuori e fissate in 4% paraformaldeide notte. Le cellule registrato è macchiato contro biocitina. Morfologia cellulare viene esaminato con confocale o epi-microscopia a fluorescenza, che conferma anche che ogni cellula è infatti registrato il GFP che esprimono interneurone originariamente mirati. </li></ol> 6. Fotostimolazione analisi dei dati La nostra metodologia di nuova concezione e realizzazione di software 11 è applicato alla rilevazione e misura di fotostimolazione-sinaptici evocati eventi nelle mappe di dati grezzi. Come esemplificato nella figura 2, codice colore mappe sono costruite per illustrare il modello di ingresso sinaptico al neurone registrato. 7. Rappresentante dei risultati: Risultati Esempio di registrazione elettrofisiologica e la mappatura fotostimolazione sono illustrati nella Figura 2. Registrazioni mirata di specifici tipi di cellule inibitorie sono rese possibili utilizzando topi transgenici che esprimono GFP nel noto tipi di cellule inibitorie. Data la diversità di interneuroni inibitori, analisi di espressione GFP, intrinseche caratteristiche morfologiche e di elettrofisiologia (Figura 2A) si combinano per arrivare alla classifica finale tipo di cellula. Figura 2B-C mostrano che fotostimolazione scansione laser consente la mappatura completa di connessioni locali circuito corticale a singoli neuroni inibitori. La mappa di dati grezzi è mostrato in Figura 2C. Le risposte uncaging diretti sono esclusi dalle analisi dei dati (Figura 2C). Le mappe di input quantitativi sono color-coded, mostrato in Figura 2D-F. Il fast-spiking interneuroni esempio inibitori ricevuto un forte ingresso sinaptica eccitatoria (EPSCs) da livello 4 e strati più profondi. Mettendo in relazione l'organizzazione sinaptica ingresso della cellula di definire percorsi corticali, siamo in grado di inferire il suo possibile ruolo (ad esempio, le risposte e l'inibizione feedforward) in elaborazione delle informazioni corticale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Strumentazione sistema generale di fotostimolazione scansione laser. Il nostro sistema complessivo è costituito da controllo fotostimolazione, immagini video e sistemi di registrazione elettrofisiologica. Abbiamo adottato la progettazione del sistema LSP descritto in precedenza 7,17. Una unità laser è usato per generare laser UV 355 nm per uncaging glutammato. Il raggio laser viene indirizzato attraverso il percorso ottico del nostro sistema. Brevi periodi di lampi laser (per esempio, 1 - 3 ms) sono controllati tramite un modulatore elettro-ottico (ad esempio, la cella di Pockels) e un otturatore meccanico. Potenza del fascio laser è modulato da una ruota gradiente di densità neutrale e monitorato deviando una piccola frazione del fascio laser con un coprioggetto di vetro per un fotodiodo. Il sistema di scansione laser include una coppia XY di specchi di scansione, la lente di acquisizione, la lente del tubo, e la lente obiettiva. Gli specchi consegnare il raggio laser attraverso una lente di acquisizione, poi il raggio entra nel microscopio attraverso uno specchio dicroico e si concentra da una misura permeabile ai raggi UV lente del tubo. Il raggio underfill l'apertura posteriore del microscopio obiettivo di fornire più un colonnare (al contrario di forma conica) fascio illuminante, mantenendo la mappatura bidimensionale come possibile riducendo la risoluzione assiale. Sotto l'obiettivo 4x, il raggio laser forme punti uncaging, ogni approximating un profilo gaussiano con una larghezza di 153 micron lateralmente al piano focale (vedi inserto). Varie posizioni di stimolazione laser può essere raggiunto attraverso galvanometri-driven specchi di scansione XY, come gli specchi e l'apertura posteriore dell'obiettivo sono su piani coniugati, traducendo posizioni specchio in diverse posizioni di scansione sul piano focale lente dell'obiettivo. Durante uncaging, un numero variabile di siti fantasia che copre tutto il campo vengono stimolati in modo sequenziale in una nonraster, la sequenza non casuale al fine di evitare rivisitazione prossimità di siti di recente stimolato. Si prega di fare riferimento a Xu et al. (2010) per informazioni più dettagliate. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Mappatura locali collegamenti del circuito eccitatori ad un GFP che esprimono fast-spiking interneuroni nel livello 4 del topo corteccia sensoriale primaria. A1 e A2 mostrare le immagini DIC e fluorescente GFP della cellula bersaglio a titolo dell'obiettivo 60x nella fetta cervello vivente, mentre la A3 mostra la morfologia delle cellule rivelato da colorazione biocitina nel post-registrazione, fetta fisso. A4 mostra i modelli di tiro della cellula GFP registrato, caratteristica di un fast-spiking interneurone inibitorio, in risposta alle iniezioni intrasomatica attuale dei punti di forza diversi. B mostrano l'immagine fetta sovrapposti con i 16 siti fotostimolazione x16 (*). La posizione della cella è indicato dal cerchietto rosso. C mostra una serie di fotostimolazione evocati tracce risposta dalle posizioni stimolo mostrato in B, mentre la cella si è tenuta a -70 mV per rilevare le correnti verso l'interno eccitatori. Le diverse forme di risposte fotostimolazione sono illustrati dalle tracce in luoghi di 1 e 2, che vengono espansi e distinto nel inserto. La traccia 1 è un esempio delle risposte dirette (indicato dalla frecce rosse) al glutammato uncaging sul corpo cellulare e dendriti promximal. Altre tracce in 2 sono tipici esempi di risposte ingresso sinaptica eccitatoria (blu). Risposte dirette e ingressi sinaptici si distinguono per le loro ampiezze e latenze di risposta. D, E e F sono i colori mappe (16x16 siti) EPSC di media ampiezza, i numeri EPSC, e il primo latenza rilevato EPSC per sito, rispettivamente, per i dati grezzi mappa mostrato in C. L'ampiezza media di ingresso di ogni sito stimolazione è l'ampiezza media delle EPSCs nella finestra di analisi, con la risposta di base spontanea sottratto dalla risposta fotostimolazione del sito stesso. Il numero di EPSCs e l'orario di arrivo o di latenza della EPSC prima rilevazione per ogni sito sono inoltre misurati e tracciati. Si prega di fare riferimento a (Shi et al., 2010) per maggiori dettagli.

<ol><li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology%3A+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li>
<li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li>
<li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons%3A+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li>
<li>Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+sources+of+synaptic+input+to+cortical+inhibitory+interneurons+and+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).</li>
<li>Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-scale+specificity+of+cortical+networks+depends+on+inhibitory+cell+type+and+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity.</a> Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).</li>
<li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li>
<li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li>
<li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li>
<li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cortical+inhibitory+neuron+type+that+coexpresses+somatostatin+and+calretinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin.</a> J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).</li>
<li>Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+of+matched+filtering+for+synaptic+event+detection+and+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction.</a> PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li>
<li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Fotostimolazione a base di tecniche di mappatura sono state effettivamente applicate per l&#39;analisi dei circuiti corticali. Fotostimolazione scansione laser combinato con registrazione cellula intera consente la mappatura ad alta risoluzione della distribuzione laminare di sorgenti di ingresso presinaptico di singoli neuroni, in quanto la registrazione simultanea da un neurone postsinaptico with fotostimolazione di cluster di neuroni presinaptici in molti luoghi diversi fornisce misure quantitative della distribuzion...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> topo transgenico linee </td><td> Jackson laboratorio o altre fonti </td><td></td><td> Si prega di fare riferimento a Xu e Callaway (2009) </td></tr><tr><td> GFP occhiali </td><td> BLS Ltd., Ungheria </td><td></td><td></td></tr><tr><td> vibratome </td><td> Leica Sistemi </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> MNI glutammato in gabbia (4-metossi-7-nitroindolinyl gabbia-l-glutammato) </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> Cat. No. 1490 </td><td></td></tr><tr><td> biocitina </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> elettrodo estrattore </td><td> Sutter Instrument, Novato, CA </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> tubi di vetro per fare elettrodi </td><td></td><td> BF150-86-10 </td><td></td></tr><tr><td> Multiclamp amplificatore 700B </td><td> I dispositivi molecolari, Sunnyvale, CA </td><td> Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> fotocamera digitale CCD </td><td> Q-imaging, Austin, TX </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Ricerca microscopio </td><td> Olympus, Tokyo, Giappone </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> UV laser dell&#39;unità </td><td> I laser DPSS, Santa Clara, CA </td><td> modello 3501 </td><td></td></tr><tr><td> Altre attrezzature per phostimulation scansione laser </td><td></td><td></td><td> Si prega di fare riferimento a Xu et al (2010). </td></tr></tbody></table> Soluzioni: <ul><li> Saccarosio-contenente artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) per il taglio fetta (in mm: 85 NaCl, 75 saccarosio, 2.5 KCl, 25 di glucosio, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, e 24 NaHCO 3). </li><li> Registrazione ACSF (in mm: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, e 10 di glucosio) </li><li> Elettrodo soluzione interna (in mm: 126 K-gluconato, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, e 10 fosfocreatina, pH 7,2, 300 mOsm). </li></ul>

mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Neuroni inibitori sono cruciali per la funzione corticale. Essi comprendono circa il 20% dell&#39;intera popolazione neuronale corticale e può essere ulteriormente suddiviso in sottotipi diversi in base alle loro proprietà immunochimica, morfologiche, fisiologiche e 1-4. Sebbene precedenti ricerche hanno rivelato molto sulle proprietà intrinseche dei singoli tipi di neuroni inibitori, la conoscenza sulle loro connessioni circuito locale è ancora relativamente limitato 3,5,6. Dato che la funzione di ogni singolo neurone è plasmato da suo input eccitatori e inibitori sinaptica nei circuiti corticali, abbiamo usato scansione laser fotostimolazione (LSP) per le connessioni del circuito mappa locale a specifici tipi di cellule inibitorie. Rispetto alle tradizionali stimolazione elettrica o stimolazione sfoglia glutammato, LSP ha vantaggi unici consentendo la mappatura estesa e analisi quantitativa di locali funzionali alla ingressi individualmente registrato neuroni 3,7-9. Fotostimolazione laser tramite uncaging glutammato attiva selettivamente i neuroni perisomatically, senza attivare gli assoni di passaggio o dendriti distali, che assicura una risoluzione sub-laminare mappatura. La sensibilità e l&#39;efficienza di LSP per gli ingressi mappatura da molti siti di stimolazione su una regione di grandi dimensioni sono adatte per l&#39;analisi dei circuiti corticali. Qui vi presentiamo la tecnica di LSP combinato con whole-cell patch di bloccaggio per la mappatura dei locali del circuito inibitorio. Registrazioni mirata di specifici tipi di cellule inibitorie sono facilitate con l&#39;uso di topi transgenici che esprimono proteine ​​verde fluorescente (GFP) in popolazioni limitate neuroni inibitori nella corteccia 3,10, che consente di campionamento coerente del tipi di cellule bersaglio e una chiara identificazione dei tipi di cellule registrato . Per quanto riguarda la mappatura LSP, delineiamo la strumentazione del sistema, descrivere la procedura sperimentale e acquisizione dati, e presentare esempi di mappatura circuito corteccia somatosensoriale primaria del mouse. Come illustrato nei nostri esperimenti, glutammato in gabbia si attiva in una regione nello spazio ristretto della fetta cervello fotolisi laser UV; simultanea voltage-clamp registrazioni consentono di individuare fotostimolazione evocati risposte sinaptica. Mappe di ingresso sia sinaptica eccitatoria o inibitoria al neurone bersaglio sono generati dalla scansione del fascio laser di stimolare centinaia di potenziali siti presinaptici. Così, LSP consente la costruzione di mappe dettagliate di ingressi sinaptici che influiscono su particolari tipi di neuroni inibitori attraverso esperimenti ripetuti. Nel loro insieme, la fotostimolazione tecnica basata neuroscienziati offre un potente strumento per determinare l&#39;organizzazione funzionale dei locali dei circuiti corticali.

Questo documento introduce un approccio di combinare fotostimolazione scansione laser con registrazioni cellula intera in topi transgenici che esprimono GFP in popolazioni limitate neuroni inibitori. La tecnica permette per la mappatura estesa e analisi quantitativa dei locali circuiti sinaptici di specifici neuroni inibitori corticali.

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

I neuroni inibitori sono fondamentali per la funzione corticale. Costituiscono circa il 20% dell'intera popolazione neuronale corticale e possono essere ulteriormente suddivisi in...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'organizzazione funzionale locale dei circuiti neuronali inibitori. La procedura inizia con la preparazione di fette cerebrali vive dalla corteccia somatosensoriale primaria di topi. Il passo successivo consiste nel visualizzare e registrare attività dalle popolazioni cellulari inibitorie che esprimono GFP mirate all'interno della fetta cerebrale.Successivamente a questa stimolazione fotoelettrica mediante scanning laser tramite glutammato, si utilizza l'uncaging per attivare piccoli gruppi di neuroni pre-sinaptici in modo eccitatorio o inibitorio. Le correnti post-sinaptiche vengono registrate nei neuroni interneuronali che esprimono GFP. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire la stimolazione fotoelettrica, l'analisi dei dati e generare mappe quantitative degli input sinaptici ai neuroni registrati.In definitiva, la stimolazione fotoelettrica con scansione laser combinata con registrazioni in configurazione "whole cell" consente la costruzione di mappe dettagliate degli input sinaptici verso specifici tipi di neuroni inibitori, permettendo così di determinare l'organizzazione e la funzione dei circuiti corticali inibitori loc

mapping-inhibitory-neuronal-circuits-laser-scanning

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video dimostra l'inibizione mediata da microRNA delle correnti sinaptiche eccitatorie in fette di cervello ippocampale di topo. I neuroni CA3 sono stati infettati con un vettore virale ricombinante che ospita un costrutto per esprimere un reporter fluorescente, un canale di membrana attivato dalla luce e un microRNA che riduce l'espressione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti. Dopo aver posizionato una fetta in una camera di registrazione e aver patchato un neurone CA1 con una...

Inibizione mediata da microRNA delle correnti postsinaptiche eccitatorie nelle fette di ippocampo di topo

Questo video mostra una procedura per analizzare la connettività sinaptica tra la corteccia prefrontale mediale (mPFC) e i neuroni dell'amigdala utilizzando fette di cervello acuto dell'amigdala da topi. I neuroni mPFC in questi topi esprimono la canalrodopsina fusa con una proteina fluorescente. Le canalrodopsine facilitano l'afflusso di ioni e la generazione di potenziale d'azione nei neuroni mPFC dopo l'attivazione della luce. Di conseguenza, i neuroni mPFC rilasciano neurotrasmettitori che...

Visualizzazione e mappatura dei percorsi neuronali in una fetta di cervello dell'amigdala

Descriviamo un metodo per caratterizzare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti del proencefalo utilizzando un approccio optogenetico per fotostimolare popolazioni neuronali in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l'attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell'attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro su come combinare artificiale microRNA-mediata RNA interference con optogenetica per stimolare specificamente i boutons presinaptici con ridotta espressione dei geni selettivi all'interno di circuiti neuronali intatti.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

Qui, presentiamo un protocollo per l'ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Come attualmente implementato, l'optogenetica nei primati non umani richiede l'iniezione di vettori virali nel cervello. Un metodo di iniezione ottimale dovrebbe essere affidabile e, per molte applicazioni, in grado di colpire singoli siti di profondità arbitraria che sono prontamente e inequivocabilmente identificati nell'istologia postmortem. Viene presentato un metodo di iniezione con queste proprietà.

Iniezioni di vettori AAV per l'optogenetica in cervello di primati non umani anestetizzati e svegli

I metodi qui descritti delineano una procedura utilizzata per invertire optogeneticamente la plasticità indotta dalla cocaina in un circuito comportamentale rilevante nei ratti. La stimolazione ottica sostenuta a bassa frequenza delle sinapsi talamo-amigdala induce depressione a lungo termine (LTD). La LTD indotta optogeneticamente in vivo in ratti con esperienza di cocaina ha determinato la successiva attenuazione della ricerca di droga motivata da spunti.

Usare l'optogenetica per invertire la neuroplasticità e inibire la ricerca di cocaina nei ratti

Qui, presentiamo due protocolli per la registrazione della micro-elettrocorticografia ad alta densità (μEcoG) in ratti e topi, inclusi metodi chirurgici, di impianto e di registrazione. Le registrazioni μECoG vengono eseguite in combinazione con la registrazione di politrodi laminari nella corteccia uditiva del ratto o con la manipolazione optogenetica dell'attività neurale nella corteccia somatosensoriale del topo.

Indagini multiscala sull'elaborazione corticale integrando politrodi laminari e optogenetica con la microcorticografia nei roditori

Scopri la mappatura dei circuiti neuronali inibitori mediante fotostimolazione laser e registrazioni whole cell in topi transgenici GFP. Questo metodo consente di analizzare l'organizzazione funzionale delle reti corticali inibitorie.

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Esplora altri video