Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare l'organizzazione funzionale locale dei circuiti neuronali inibitori. La procedura inizia con la preparazione di fette di cervello vivente dalla corteccia somatosensoriale primaria dei topi. Il passo successivo è quello di visualizzare e registrare da GFP mirati che esprimono tipi di cellule inibitorie nella fetta di cervello.

Dopo questa fotostimolazione a scansione laser tramite glutammato, l'uncaging viene utilizzato per attivare piccoli gruppi di neuroni pre-sinaptici come eccitatori o inibitori. Le correnti post-sinaptiche sono registrate nei neuroni che esprimono GFP. Il passo finale consiste nel passare attraverso la fotostimolazione, l'analisi dei dati e generare mappe quantitative dell'input sinaptico ai neuroni registrati.

In definitiva, la fotostimolazione a scansione laser combinata con le registrazioni di intere cellule consente la costruzione di mappe dettagliate degli input sinaptici a specifici tipi di neuroni inibitori, che possono consentire di determinare l'organizzazione e la funzione dei circuiti corticali inibitori locali. La tecnica basata sulla fotostimolazione è stata sperimentata dal Dr.Larry Katz, Ned Calloway, e ulteriormente sviluppata dal Dr.Carols Waboda, il mio pi, il Dr.Xing Z si è formato con il Dr.Dr.Calloway, il Salk Institute, dove ha condotto molti studi che indagano i circuiti interorali. Il nostro gruppo sta attualmente ampliando e continuando questi studi, indagando i circuiti interorali.

Per iniziare questa procedura, sacrificare un topo transgenico a due o tre settimane dopo la nascita mediante decapitazione e rimuovere rapidamente il cervello, mettere il cervello in una soluzione di taglio congelata e ossigenata. Quindi usa gli occhiali GFP per esaminare visivamente il cervello e verificare l'espressione di GFP. Successivamente, tagliare la corteccia somatosensoriale primaria in sezioni di 400 micrometri di spessore con un vibratore.

Incubare le fette nel saccarosio contenente A CSF gorgogliato con il 95% di O2 e il 5% di CO2 a 32 gradi Celsius per 30 minuti a un'ora. Dopodiché, trasferisci le fette nel normale A CSF a temperatura ambiente per preparare il laser per l'esperimento, accendi il sistema di raffreddamento laser e l'alimentatore. Quindi accendi tutto l'hardware relativo al controllo della fotostimolazione, incluso il sistema di specchi di scansione, il modulatore ottico e l'otturatore elettronico e un amplificatore di ingresso per fotodiodi.

Successivamente accendere le apparecchiature elettrofisiologiche come l'amplificatore multi clamp 700 B e i micro manipolatori. Le registrazioni elettrofisiologiche, la fotostimolazione e l'imaging vengono condotte nella camera di perfusione a fette montata sul tavolino motorizzato del microscopio. Successivamente, accendere la fotocamera di imaging, la fetta verrà visualizzata nel microscopio verticale con DIC a infrarossi e ottica epifluorescente attraverso il sistema di imaging.

Quindi apri il software FS basato su MATLAB e il software della fotocamera Q capture sul monitor. Prima di eseguire l'esperimento, controllare il sistema di fotostimolazione laser e assicurarsi che sia in uno stato funzionante. Posizionare un pezzo di carta sotto l'obiettivo del microscopio quattro x per osservare il modello di scansione laser mentre il sistema è in funzione.

Per realizzare il microelettrodo con una resistenza OM da quattro a sei mega, tirare un elettrodo di vetro con l'estrattore per pipette. Quindi riempire l'elettrodo con una soluzione interna contenente lo 0,1% di biotina per la marcatura cellulare e l'identificazione morfologica. Quindi, accendere il sistema di perfusione pressurizzato per pompare A CSF nella camera.

Garantire un livello costante del fluido di 2,0 millimetri sopra la fetta nella camera. Un'aliquota della soluzione madre di glutammato in gabbia MNI viene aggiunta a 25 millilitri di A CSF circolante per una concentrazione di 0,2 millimolari di glutammato in gabbia. Quindi trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione.

Eseguire il sistema di imaging per verificare la qualità della fetta e localizzare anatomicamente l'area somatosensoriale primaria. Quindi, ancorare la fetta con un anello di platino a corde fatto su misura e fare attenzione a non mettere l'ancora sopra la regione del cervello destinata alla registrazione. Visualizzare le cellule con un obiettivo 60x basato sulla visualizzazione dell'espressione di GFP al microscopio a fluorescenza A DIC.

Identificare e selezionare i tipi di cellule inibitorie. Si prega di notare che la registrazione verrà eseguita sotto controllo visivo con l'aiuto di DIC a infrarossi. Il monitoraggio video e la commutazione tra la modalità DIC e fluorescente sono necessari per confermare la posizione della cella GFP mentre si abbassa l'elettrodo sulla cella target.

Utilizzando la tecnica convenzionale di patch clamping. Innanzitutto, applicare una pressione positiva all'elettrodo. Spostalo vicino alla superficie cellulare per stabilire una fossetta distinguibile sulla membrana cellulare bersaglio.

Quindi applicare rapidamente una pressione negativa per formare un giga seal e rompere la cella monitorando le risposte di iniezione correnti sul monitor video. Al momento dell'irruzione, scattare le immagini della GFP registrata che esprime intraneuroni con un ingrandimento di 60 x in modalità DIC e fluorescente per la verifica online. Prima di raccogliere i dati della fotostimolazione, iniettare impulsi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti per esaminare le proprietà elettrofisiologiche di base di ciascuna cellula.

Una volta stabile, la registrazione di intere cellule si ottiene con una buona resistenza di accesso, che di solito è inferiore a 20 mega ohm, commutare l'obiettivo del microscopio da 60 x a quattro x con ingrandimento per la fotostimolazione a scansione laser, acquisire un'immagine a fette con un ingrandimento quattro x e utilizzarla per guidare e registrare i siti di fotostimolazione. Impostare i parametri di fotostimolazione e acquisizione dati attivando il modulo interruttore di configurazione di phys. Utilizzare un impulso laser di un millisecondo di circa 20 milliwatt con un intervallo di stimolo di un secondo.

Per la mappatura della fotostimolazione, acquisire tracce di dati di un secondo campionate a 10 kilohertz. Quindi, carica l'immagine della quattro x slice nel modulo mapper di phys. Definisci la posizione del soma e imposta i siti di fotostimolazione di un modello 16 per 16 con 80, micrometro per 80 micrometri.

Spaziatura intorno alla posizione della cella, che copre tutti gli strati corticali. Quindi mappare il profilo di eccitazione del neurone registrato esaminando le posizioni di picco in risposta alla fotostimolazione in modalità di morsetto di corrente. Il nostro software di facile utilizzo con le funzioni di visualizzazione online facilita gli esperimenti di mappatura.

Successivamente, mappare le connessioni del circuito eccitatorio locale rilevando le correnti eccitatorie post-sinaptiche dalla cella registrata Con la scansione laser in diverse posizioni, tenere la cella a 70 millivolt negativi in modalità voltage clamp per rilevare le correnti eccitatorie verso l'interno. Quindi ripetere le mappe della corrente post-sinaptica eccitatoria due o tre volte con il modello di fotostimolazione ruotato o capovolto. Per mappare le connessioni del circuito inibitorio locale, rilevare le correnti post-sinaptiche inibitorie dalla cellula registrata.

Tenere la cella a una velocità vicina a zero millivolt, in questo caso, a 15 millivolt negativi in modalità voltage clamp per rilevare le correnti inibitorie verso l'esterno. Dopo aver completato tutti i test fisiologici, rimuovere delicatamente l'elettrodo dalla cella registrata. Rimuovere la fetta di cervello dalla camera, quindi fissarla in para formaldeide al 4% durante la notte e colorare le cellule registrate contro la biotina.

In questo esperimento, la combinazione dell'espressione della GFP, dell'elettrofisiologia intrinseca e delle caratteristiche morfologiche è stata utilizzata per classificare i neuroni inibitori. Mostrato. Ecco l'esempio e una mappa di dati grezzi per illustrare la fotostimolazione a scansione laser, che consente un'ampia mappatura delle connessioni del circuito corticale locale al neurone inibitorio registrato. Ecco gli esempi delle mappe di input quantitative codificate a colori derivate dalle tracce grezze appena mostrate nella Figura D.Le ampiezze degli eventi sinaptici rilevati nell'interneurone registrato sono codificate a colori e sovrapposte topograficamente alle posizioni di fotostimolazione.

La posizione del corpo della cella è indicata dal cerchio rosso aperto nella barra della scala. I colori caldi indicano forti input sinaptici e i colori freddi indicano una connettività debole o assente con la cellula bersaglio. Allo stesso modo, la figura E presenta il numero di eventi sinaptici per la posizione di uncaging campionata al neurone registrato.

La Figura F mostra il tempo di insorgenza del primo evento sinaptico rilevato alla cellula registrata dopo la fotostimolazione nella barra della scala. I colori caldi indicano un input breve, una latenza e colori più freddi indicano latenze sinaptiche più lunghe. Pertanto, LSPS consente la costruzione di mappe dettagliate della posizione, della forza, della latenza e del numero di input che incidono su specifici tipi di neuroni inibitori.

Bene, partecipando a questa procedura, è importante essere pazienti, fare in modo pulito l'esperimento, ma neuron in modo efficace e molto attento per passare da un alto ingrandimento dell'oggetto a una bassa modifica. Poi l'ultimo utilizzo del software di terra molto bene.