Quantificare attività agonista a G recettori accoppiati alla proteina

L'obiettivo generale di questa procedura è stimare la costante di affinità relativa KB di un agonista per lo stato attivo di un recettore, analizzando la sua curva concentrazione-risposta. Questo viene ottenuto innanzitutto misurando le curve concentrazione-risposta di un gruppo di agonisti nel provocare una risposta a un recettore accoppiato a proteina G. Il passo successivo della procedura consiste nel stimare i valori eemax e EC 50 degli agonisti mediante analisi di regressione non lineare.

Questi valori vengono quindi utilizzati per calcolare le stime iniziali dei parametri per l'analisi successiva di regressione non lineare che coinvolge il modello operativo. Come passo finale, si ottengono stime relative delle costanti di affinità degli agonisti per lo stato attivo del recettore mediante analisi globale di regressione non lineare delle loro curve di risposta concentrazione-dipendente. Infine, utilizzando una forma modificata del modello operativo, la costante di affinità di un agonista per lo stato attivo di un recettore, espressa in relazione a quella di un altro agonista, può essere stimata attraverso l'analisi globale di regressione non lineare delle loro curve di risposta concentrazione-dipendente.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della scoperta di farmaci, ad esempio se un agonista presenta selettività per un particolare percorso di segnalazione. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà a causa dei dettagli dell'analisi matematica. Per la stima dei valori relativi di KB dell'agonista, è necessaria una serie di almeno due curve concentrazione-risposta dell'agonista.

Una discussione sulle considerazioni per questi esperimenti è disponibile nel protocollo scritto. Dopo aver ottenuto le curve di risposta, sottrarre la risposta basale da quella misurata in presenza di ciascuna concentrazione di agonista e iniziare a inserire i dati provenienti dagli esperimenti concentrazione-risposta in una tabella dati. Nel software Prism, tutte le concentrazioni logaritmiche dell'agonista vengono inserite nella colonna etichettata X. Le misurazioni di risposta per l'agonista che presenta la risposta massimale più elevata, o valore eax, vengono inserite nella colonna A, mentre quelle relative agli altri agonisti vengono inserite nelle colonne adiacenti contrassegnate da lettere successive.

Inserire le misurazioni riplicate delle curve di risposta alla concentrazione in sottocolonne di una colonna contrassegnata da una lettera. Selezionare il foglio del grafico su cui sono riportati i dati e selezionare "analizza" per analizzare i dati mediante analisi di regressione non lineare utilizzando l'equazione con pendenza variabile, vincolando il parametro "bottom" a zero ed eseguendo l'analisi di regressione. Registrare i parametri "top" e "log EC 50" per utilizzarli nel calcolo delle stime iniziali dei parametri.

Per calcolare le stime iniziali dei parametri, assegnare il valore log tau K osservato al logaritmo negativo del valore EC 50 dell'agonista standard. Successivamente, calcolare il valore log RAI di ciascun agonista in prova come logaritmo della quantità costituita dal prodotto tra il valore eemax dell'agonista in prova e l'EC 50 dell'agonista standard, diviso per il prodotto tra il valore emax dell'agonista standard e l'EC 50 dell'agonista in prova. In questa equazione, i parametri dell'agonista standard sono indicati con un apice.

Assegnare quindi la costante di affinità logaritmica dell'agonista in prova al logaritmo negativo dei rispettivi valori di CE. Dopo aver inserito i dati in Prism, assicurarsi che i dati dell'agonista con il valore di EMAX più elevato siano inseriti nella colonna A. Questo agonista viene ora indicato come standard, mentre gli altri agonisti sono indicati come agonisti in prova. Successivamente, inserire in Prism un'equazione definita dall'utente, log RAI, su più righe.

In questo caso, l'equazione definita dall'utente prevede un totale di cinque agonisti. Inserire le stime iniziali dei parametri di blocco R e dell'affinità costante degli agonisti in esame. A M sis viene assegnato il valore EMAX dell'agonista standard e a M viene assegnato un valore pari a uno.

Ora inserire le stime iniziali dei parametri dei valori log RAI degli agonisti in prova. Applicare vincoli ai parametri vincolando log K uno a zero e impostando log GR, m, sis e M a un valore condiviso per tutti i set di dati. Successivamente, avviare l'analisi di regressione non lineare.

I risultati forniscono i valori di log K osservato e di log RAI degli agonisti in esame per la stima dei valori di KB dell'agonista in unità assolute di unità inverse molariche; a tale scopo si utilizzano saggi in vitro basati su cellule che mostrano un'attività recettoriale costitutiva. Si scelgano gli agonisti e si progetti l'esperimento come descritto nel protocollo scritto. Si calcoli l'attività recettoriale costitutiva e la risposta a ciascuna concentrazione di agonista come risposta misurata meno la risposta basale nelle cellule non trasfettate con il recettore, qui illustrata come risposte a diversi agonisti calcolate in questo modo per un pathway di segnalazione che mostra un'attività costitutiva molto bassa nell'analisi preliminare.

Per prima cosa, inserire i dati nel prism come descritto per l'attività non costitutiva. Accettare. Inserire anche la risposta causata dall'attività recettoriale costitutiva nelle colonne contrassegnate con le lettere appropriate, nella riga corrispondente a una concentrazione logaritmica dell'agonista pari a meno 20. Qui viene inserito un logaritmo negativo elevato per approssimare una concentrazione di agonista pari a zero.

Analizzare i dati come in precedenza, con l'eccezione che per l'attività costitutiva, il parametro "bottom" deve essere vincolato in modo che sia condiviso per tutti i set di dati. Registrare il parametro condiviso, nonché i parametri "top" e "log EC" per ciascun agonista. Dopo aver determinato la costante di affinità logaritmica dell'agonista standard in esperimenti separati, calcolare la stima iniziale del valore log K osservato di ciascun agonista parziale in esame come logaritmo dell'espressione costituita dalla differenza tra il valore emax dell'agonista standard e quello dell'agonista in esame, divisa per il prodotto tra l'EC 50 e la differenza tra il valore eemax dell'agonista standard e la risposta costitutiva.

Calcolare la stima iniziale di log KB per ciascun agonista e la stima iniziale di log T cis per determinare i valori KB dell'agonista. Inserire i dati in Prism e quindi immettere un'equazione definita dall'utente. Inserire log KB in Prism su più righe come illustrato qui per la condizione di due agonisti.

Successivamente, inserire le stime iniziali dei parametri immettendo la posizione di affinità di ciascun agonista. Il log T sis stima il valore M sis, che a sua volta stima il valore M; il valore M sis viene assegnato al valore EMAX dell'agonista standard e il valore M viene fissato a uno. Infine, inserire le stime iniziali di log kb.

Applicare vincoli ai parametri vincolando log K di uno al suo valore precedentemente determinato e impostando log T sis, m sis e M a un valore condiviso per tutti i set di dati. Avviare l'analisi di regressione non lineare. I risultati forniscono il log KB dell'agonista standard, il log K osservato e i valori di log KB degli agonisti parziali.

La risposta massimale del sistema, il valore log T cys per il complesso recettoriale libero e il fattore di pendenza del trasduttore nel modello operativo qui mostrato riguardano l'idrolisi dei fosfoinositidi indotta da agonisti muscarinici in cellule di ovario di criceto cinese, stabilmente esprimenti il recettore muscarinico M tre. Le curve concentrazione-risposta di selezionati agonisti muscarinici sono state misurate in questo saggio, e i dati sono stati analizzati come descritto qui per stimare il valore KB di ciascun agonista espresso in rapporto a quello dell'Oxo Tremaine M. Le curve teoriche rappresentano l'adattamento ai minimi quadrati dell'equazione di regressione ai dati. Le stime del log RAI sono riportate per kabale, a recline, pilocarpina e McNeil.

Un 3, 4 3. Sono state determinate le corrispondenti stime della risposta massima del sistema e del fattore di pendenza del trasduttore. Sono stati inoltre ottenuti i valori di log K osservati per ciascun agonista mostrato.

Di seguito sono riportati i risultati di esperimenti sull'idrolisi stimolata da agonisti muscarinici del fosfoinositide in cellule HC 2 93. L'espressione stabile di G alfa 15 e l'espressione transitoria del recettore muscarinico M tre hanno indotto un aumento dell'idrolisi basale del fosfoinositide, attribuito all'attività costitutiva del recettore. I dati sono stati analizzati per stimare i valori log KB di Oxo Tremaine M e MacNeil, A 3 43.

Le curve teoriche rappresentano l'adattamento ai minimi quadrati dell'equazione di regressione ai dati. Le stime del log KB sono mostrate per Oxo Tremoring M e McNeil, A 3 43. È stata inoltre determinata la stima del valore K osservato per McNeil A 3 43.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di analisi dei dati può essere eseguita in pochi minuti se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come stimare sia i valori KB relativi che quelli effettivi a partire dalle curve concentrazione-risposta degli agonisti per indurre una risposta a valle nel percorso di segnalazione di un recettore accoppiato a proteina G.