Name: Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Scopri il metodo Ice-Cap per la genotipizzazione ad alto rendimento di Arabidopsis thaliana e pomodoro in piastre da 96 pozzetti. Questa tecnica consente di isolare tessuti radicali per l'estrazione del DNA in modo rapido e non distruttivo.

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Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio della National Science Foundation (codice di autorizzazione MCB-0447750).

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
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<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
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<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La calotta di ghiaccio metodo presentato qui uno scienziato permette di raccogliere campioni di tessuto da centinaia o addirittura migliaia di singole piante in un solo giorno ed efficiente estrarre il DNA genomico da questi campioni per l&#39;utilizzo in reazioni genotipizzazione. Dando uno scienziato individuo la possibilità di genotipo migliaia di piantine in un breve periodo di tempo, la calotta di ghiaccio metodo ha il potenziale di facilitare una serie di esperimenti genetici che altrimenti non sarebbero pratici da eseguire. Numerosi esempi sono forniti di seguito. <ol><li> Mappatura genetica. Scala fine mappatura genetica può essere accelerato se il ricercatore è in grado di identificare eventi di ricombinazione all&#39;interno di uno specifico intervallo lungo del cromosoma 3. Se questo intervallo comporta una distanza molto breve genetica, poi gli eventi di ricombinazione sarà relativamente rara nella popolazione mappatura segreganti. Per questo motivo, può essere necessario a migliaia schermo delle singole piante per trovare il re desideratoindividui ricombinanti. Questo processo potrebbe essere notevolmente accelerato mediante l&#39;utilizzo di Ice-Cap. Anche nell&#39;era del genoma ri-sequenziamento, è ancora necessario dimostrare direttamente che una mutazione è direttamente responsabile di un fenotipo di interesse. In questi casi, sarà necessario separare la mutazione di interesse lontano da altre mutazioni legate strettamente al fine di dimostrare una mutazione candidato è in realtà causale. In queste situazioni, Ice-Cap fornirebbe un metodo efficace per rompere il collegamento tra una coppia di mutazioni strettamente collegati. </li><li> Multi-mutanti. E &#39;diventato comune per i ricercatori che studiano Arabidopsis di combinare alleli mutanti di diversi loci distinti in un singolo individuo al fine di superare la ridondanza funzionale 4-6. Come esempio, consideriamo un caso in cui si vuole combinare alleli mutanti da quattro loci differenti in un singolo impianto attraverso incrocio genetico. Per questo progetto, sarà necessario generare unn individuo che è eterozigote in questi quattro loci come parte del sistema di attraversamento. Quando questo quadruplo eterozigote semi-set, il quadruplo omozigote dovrebbe essere presente al ritmo di uno su 256 nella popolazione risultante della progenie. Lo screening per questa persona rara con i metodi tradizionali sarebbe abbastanza laborioso. In confronto, con Ice-Cap per questo progetto avrebbe fornito lo scienziato con una strategia efficace per identificare i omozigote rara quadrupla in una sola generazione. </li><li> iTILLING. Il nostro laboratorio ha recentemente descritto un nuovo approccio allo screening per la presenza di mutazioni indotte nei geni di interesse in Arabidopsis 7. Questo metodo è una variante di una tecnica consolidata chiamata TILLING che viene utilizzato per trovare mutazioni nella popolazione ordinata di individui trattati con un mutageno chimico 8-10. Abbiamo chiamato il nostro metodo iTILLING perché è una versione personalizzata di TILLING che permette ad un individual scienziato a realizzare qualcosa che ha sempre richiesto un grande team di ricerca da completare. Ice-Cap costituisce parte integrante del metodo iTILLING 7, come descritto di seguito. </li></ol> L&#39;idea alla base iTILLING è quello di produrre una popolazione mutante effimero, che è in contrasto con le popolazioni resistenti mutante creato per i tradizionali progetti TILLING. Per iTILLING, i semi di una popolazione gonfiato M2 vengono seminati in blocchi di ghiaccio dal 50-100 Cap, e il DNA viene estratto utilizzando il ghiaccio-Cap metodo. Piantine di Arabidopsis vengono poi poste a 4 ° C mentre screening delle mutazioni viene eseguita utilizzando il ghiaccio-Cap DNA prep. Piantine di pomodoro sono conservati a 12 ° C.. Una volta piantine mutazioni portando desiderati sono stati identificati, sono recuperati dalla Ice-Cap piastre e trasferiti a terra. iTILLING non è destinato a fornire una lunga popolazione mutante per una comunità intera ricerca a schermo. Invece, iTILLING fornisce una strategia con la qualeuno scienziato può schermo una popolazione mutante su misura per le mutazioni in una manciata di geni in modo rapido, efficiente e ad un costo relativamente basso. Abbiamo trovato Ice-Cap di essere un metodo efficace per la coltivazione e la genotipizzazione Arabidopsis, il pomodoro e riso. Ci aspettiamo che le altre specie di piante devono essere suscettibili di Ice-Cap. Una limitazione sulla varietà di specie che possono essere ospitati da Ice-Cap è la dimensione dei semi. Solo le piante con semi abbastanza piccolo da entrare nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti sarà compatibile con calotta di ghiaccio nella sua attuale configurazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Macchina per scuotimento piastre Root per l&#39;estrazione del DNA </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0384 </td><td> Manuale di tenuta della macchina di calore utilizzato per lastre di root prima di disgregazione del tessuto </td></tr><tr><td> Centrifuga dotata di supporti per micropiastre oscillante </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Qualsiasi centrifuga con supporti per micropiastre oscillante sarebbe adatta </td></tr><tr><td> Microfill Dispenser per micropiastre </td><td> Biotek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Dispenser automatico di liquido per micropiastre riempimento </td></tr><tr><td> Bialetti marchio17x11 pollici Foglio commerciale Cookie Grandi </td><td> Obiettivo Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> Questo strato di biscotto specifico è la profondità ideale per Ice-Cap </td></tr><tr><td> Custom Made Rack in metallo </td><td> Ferramenta </td><td></td><td> Cfr. il testo per la descrizione completa </td></tr><tr><td> 33 litri in plastica contenitore </td><td> Obiettivo Department Store </td><td> Sterilite Marca </td><td> Per Ice-Cap Fontana. Stoccaggio scatola di plastica abbastanza grande da contenere il foglio 17x11 cm cookies </td></tr><tr><td> 30 gallone Pompa Fontana ore </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Piccolo sommergibile pompa fontana disponibile nei negozi di giardino </td></tr><tr><td> Tubo per pompa fontana </td><td> Ogni laboratorio società di fornitura </td><td></td><td> Tubo compatibile con pompa fontana </td></tr><tr><td> Pinza in plastica </td><td> Ferramenta </td><td></td><td> Fascetta per tenere tubo cookiesfoglio </td></tr><tr><td> Coperchi di plastica trasparente dal basso Falcon Microtest piatto piastre a 96 pozzetti in polistirene </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Chiaro coperchi di plastica per la copertura di ghiaccio-Cap Piastre Seedling </td></tr><tr><td> 3M Micropore nastro chirurgico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch diametro sfere in acciaio inox </td><td> Tecnologie Hartford, Rocky Hill, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> Utilizzato per distruggere il tessuto radice dopo la raccolta </td></tr><tr><td> 3 bande pollici capelli elastici </td><td> Drogheria locale </td><td></td><td> Utilizzati per fissare Piastra Root to Plate Seedling </td></tr><tr><td> 4 spiedini di legno mm di diametro </td><td> Drogheria locale </td><td></td><td> Questi spiedini sono tipicamente utilizzati per la preparazione kabobs </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marchio, 1-mL piastre filtranti senza fritta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> 96-pozzetti Seedling con fori nella parte inferiore. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Well Tall-camino Piastre PCR </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-Root e Piastre </td></tr><tr><td> Agar - colture cellulari testati </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic acido (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige e Skoog (MS), miscela di sale basale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Peel calore facile tenuta foglio </td><td> ABgene USA </td><td> AB-0745 </td><td> Calore pellicola sigillante per sigillare piastre radice prima di disgregazione del tessuto </td></tr><tr><td> Anatra Marca extra largo nastro di imballaggio, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Articolo no. 21242139 </td><td> Nastro adesivoper micropiastre sigillatura contenenti estratti di DNA per la conservazione </td></tr><tr><td> Tenuta Roller </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Mano lo strumento per lo stampaggio a rotazione nastro adesivo di tenuta su micropiastre </td></tr><tr><td> 96-blocco di metallo e termica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Utilizzato per congelare le tavole Root per la raccolta dei tessuti </td></tr><tr><td> Carta da filtro Whatman </td><td> Whatman internazionale </td><td> 1002 090 </td><td> Utilizzato per le sementi superficie sterilizzazione </td></tr><tr><td> Pipetta Pasteur monouso </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;usa e getta pipetta Pasteur utilizzato per trasferire i semi per piastra Seedling </td></tr><tr><td> Pyrex teglia (20 cm x 30 cm) </td><td> Obiettivo Department Store </td><td></td><td> Usato per costruire una ghiaccio secco / etanolo da bagno. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: un metodo per la crescita arabidopsis e piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di high-throughput genotipizzazione

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Sta diventando comune per gli scienziati impianto di sviluppare progetti che richiedono la genotipizzazione di un gran numero di piante. Il primo passo in qualsiasi progetto di genotipizzazione è quello di raccogliere un campione di tessuto da ogni singolo impianto. L&#39;approccio tradizionale a questo compito è quello di piante campione one-at-a-tempo. Se si vuole genotipo centinaia o migliaia di individui, tuttavia, usando questa strategia i risultati in un collo di bottiglia significativo in cantiere genotipizzazione. La calotta di ghiaccio metodo che descriviamo qui fornisce un elevato throughput soluzione a questa sfida, consentendo uno scienziato per la raccolta di tessuto da diverse migliaia di piantine in un solo giorno 1,2. Questo livello di velocità è reso possibile dal fatto che il tessuto viene raccolto da piante 96-at-a-tempo, piuttosto che un at-a-tempo. La calotta di ghiaccio metodo fornisce una piattaforma integrata per l&#39;esecuzione di crescita delle piantine, raccolta dei tessuti, e l&#39;estrazione del DNA. La base per Ice-Cap è la crescita di seedliNGS in un paio sovrapposti di piastre a 96 pozzetti. I pozzetti della piastra superiore contengono spine di media crescita agar su cui semenzali singoli germinare. Le radici crescono verso il basso attraverso i media agar, uscire la piastra superiore attraverso un foro, e passare in acqua piastra inferiore che contiene. Per la raccolta di tessuto per l&#39;estrazione del DNA, l&#39;acqua nella piastra inferiore contenente tessuto radice è rapidamente congelato, mentre le piantine nella piastra superiore rimanere a temperatura ambiente. La piastra superiore è poi staccato dalla piastra inferiore, si possa ottenere una piastra con 96 campioni di radice di tessuto congelato nel ghiaccio e un piatto con 96 piantine vitali. La tecnica si chiama &quot;Ice-Cap&quot; perché utilizza il ghiaccio per catturare il tessuto radice. La piastra a 96 pozzetti contenenti le piantine possono poi avvolto in un foglio e trasferiti a bassa temperatura. Questo processo sospende l&#39;ulteriore crescita delle piantine, ma non influenza la loro vitalità. Una volta che l&#39;analisi del genotipo è stata completata, piantine con il genotipo desiderato può essere trasferita dal 96-bene pin ritardo a terra per ulteriore moltiplicazione. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità del ghiaccio-Cap metodo utilizzando Arabidopsis thaliana, pomodoro, e le piantine di riso. Ci aspettiamo che il metodo deve essere applicabile anche ad altre specie di piante con semi abbastanza piccolo da entrare nei pozzetti di piastre a 96 pozzetti.

La calotta di ghiaccio metodo permette di coltivare le piante in piastre con 96 pozzetti e non distruttivo dei tessuti radice raccolta da ogni piantina. DNA estratto da questo tessuto radice può essere utilizzata per le reazioni di genotipizzazione. Abbiamo scoperto che Ice-Cap funziona bene per<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Pomodoro, e piantine di riso.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

Sempre più spesso i ricercatori in ambito botanico sviluppano progetti che richiedono la genotipizzazione di un numero elevato di piante. Il primo passo in qualsiasi genotipizzazione...

L'obiettivo generale di questo esperimento è isolare campioni di tessuto radicale da piantine cresciute in piastre a 96 pozzetti per l'estrazione del DNA e il genotipaggio. Questo viene realizzato innanzitutto germinando le piantine in particolari piastre a 96 pozzetti contenenti un mezzo di crescita a base di agar e dotate di fori nella parte inferiore di ciascun pozzetto. Il secondo passaggio consiste nell'impilare la piastra con le piantine su una piastra standard a 96 pozzetti riempita con acqua.Una volta che le radici sono cresciute verso il basso e hanno raggiunto la piastra inferiore a 96 pozzetti, le piastre impilate vengono posizionate in un blocco congelatore per congelare l'acqua nella piastra inferiore. L'ultimo passaggio consiste nel staccare la piastra superiore da quella inferiore, spezzando le radici, che rimangono congelate nella piastra inferiore. Alla fine, i campioni di tessuto radicale ottenuti possono essere utilizzati per estrarre campioni di DNA da ciascuna pianta individuale per l'analisi del genotipo.Il principale vantaggio del metodo ice cap rispetto ai metodi alternativi è che consente di isolare il DNA da migliaia di piante in un singolo giorno. Questo livello di produttività è possibile perché con ice cap le piante vengono trattate 96 alla volta, anziché una alla volta come nel metodo tradizionale. Alcuni esempi di applicazioni di ice cap includono lo screening di ampie popolazioni di piante per identificare ricombinanti rari tra geni strettamente associati, la generazione di piante portatrici di un elevato numero di mutazioni mappate differenti e l’esecuzione di selezione assistita da marcatori in specie colturali.Fondamentalmente, qualsiasi esperimento che preveda il genotipaggio di un elevato numero di piante individuali potrebbe trarre beneficio dal contenitore icecap. Abbiamo sviluppato originariamente icecap per l'uso con l'asscesso del coniglio, ma abbiamo ottenuto risultati positivi anche nell'acquisizione di tessuto da piantine di riso e pomodoro. Riteniamo che icecap possa essere efficace anche su altre specie, purché i loro semi siano abbastanza piccoli da poter essere inseriti in una piastra a 96 pozzetti.Avvolgere innanzitutto le piastre per piantine con della pellicola e sterilizzare in autoclave contemporaneamente. Dopo il ciclo di autoclave, immergere i coperchi in plastica trasparente per le piastre in etanolo al 95%, quindi far asciugare completamente sia le piastre che i coperchi in una cappa a flusso laminare. Una volta che le piastre sono completamente asciutte, applicare del nastro adesivo da imballaggio alla base di ciascuna piastra per piantine e sigillare con fermezza utilizzando un rullo.Quindi utilizzare un distributore per micropiastre microfill o una pipetta multicanale per dispensare 450 microlitri di terreno di crescita fuso nei pozzetti di ciascuna piastra di semine. Coprire le piastre con coperchi di plastica e lasciare solidificare il terreno di crescita a temperatura ambiente. Cospargere i semi asciutti sulla carta da filtro Watman e coprire completamente ogni seme con etanolo al 95%.Quindi lasciare asciugare completamente i semi all'aria. Successivamente, trasferire i semi sulle piastre per piantine toccando prima la punta sigillata a fiamma di una pipetta di vetro modificata sulla superficie del terreno agarico. Questo inumidisce la punta della pipetta e consente di prelevare facilmente un singolo seme e trasferirlo sulla superficie dell'agar.Una volta che ogni pozzetto contiene un seme, coprire ciascuna piastra di semine con un coperchio di plastica trasparente e sigillare con nastro chirurgico microporoso. Avvolgere le piastre impilate con carta d'alluminio e conservare a quattro gradi Celsius per quattro giorni per stratificare i semi e sincronizzare la germinazione. Dopo quattro giorni, posizionare le piastre di semine sotto luce fluorescente a 18-20 gradi Celsius per ulteriori quattro giorni.Per avviare la germinazione, assemblare la fontana con coperchio di ghiaccio su uno scaffale nella stanza di crescita delle piante in modo che la superficie della fontana con coperchio di ghiaccio riceva illuminazione fluorescente diretta. Per assemblare, posizionare prima la struttura del telaio personalizzata all'interno di una scatola di plastica per immagazzinaggio, quindi appoggiare una leccarda sopra questa.Utilizzare i dadi di livellamento per regolare il livello del vassoio per biscotti. Quindi posizionare una pompa sommergibile nella scatola di stoccaggio e collegare il tubo di uscita della pompa al lato del vassoio per biscotti utilizzando una fascetta a molla. Successivamente, riempire la fontana del cappuccio di ghiaccio con una miscela di tre parti di acqua distillata e una parte di acqua di rubinetto.Aggiungere acqua fino a quando la pompa sommergibile si trova alcuni centimetri al di sotto del livello dell'acqua. Segnare il livello finale dell'acqua nella scatola di plastica per conservazione utilizzando nastro da laboratorio e un pennarello. Preparare le piastre radice aggiungendo una sfera di acciaio inossidabile in ogni pozzetto di una piastra radice a 96 pozzetti.Quindi distribuire 340 microlitri di una miscela composta da tre parti di acqua distillata e una parte di acqua del rubinetto in ogni pozzetto della piastra radicale. Rimuovere il film adesivo dalla parte inferiore delle piastre di semine e togliere i coperchi di plastica trasparenti.Posizionare ogni piastra di piantine in una piastra per radici contenente una sfera metallica e acqua, e fissare le due piastre insieme utilizzando due fascette elastiche. Successivamente, inserire le piastre sovrapposte nella fontana di ghiaccio. Le piastre accoppiate devono rimanere nella fontana di ghiaccio per 10-14 giorni.In questo periodo, mantenere il livello dell'acqua nella fontana del cappuccio di ghiaccio aggiungendo acqua distillata. Una volta che la maggior parte delle piantine ha sviluppato tessuto radicale che ha penetrato le piastre radicali, rimuovere le piastre dalla fontana del cappuccio di ghiaccio in previsione del raccolto del tessuto radicale. Dopo aver rimosso le piastre dalla fontana del cappuccio di ghiaccio, inserire tre stecchini di legno tra i pozzetti delle piastre impilate di piantine e radici.Gli stecchini solleveranno le punte delle piastre di semine fuori dai pozzetti delle piastre radicali. Lasciare riposare per tutta la notte sotto luci le piastre ice cap impilate con gli stecchini di legno inseriti. Questa incubazione permette una leggera evaporazione del liquido nelle piastre radicali, facilitando i successivi processi di congelamento e di separazione delle piastre.Nel giorno del prelievo del tessuto, preparare un bagno di congelamento. Posizionare una piastra termica metallica da 96 pozzetti in una capsula di Pyrex contenente una miscela di anidride carbonica solida ed etanolo al 95%. Lasciare che la piastra termica raggiunga l'equilibrio termico per circa 20 minuti.Posizionare le piastre per ghiaccio impilate con gli stecchini di legno sul blocco termico refrigerato e incubare per cinque minuti. Durante questo periodo, l'acqua nella piastra radice si congelerà completamente. Rimuovere le piastre per ghiaccio impilate dal bagno di congelamento e posizionarle sul banco del laboratorio a temperatura ambiente; quindi rimuovere le fascette elastiche e gli stecchini di legno dalle piastre impilate.Premere con fermezza sulla parte superiore della piastra delle piantine per rompere le piastre. Quindi staccare con attenzione la piastra delle radici da quella delle piantine. Lasciare che l'acqua nelle piastre delle radici si scongeli a temperatura ambiente.In alternativa, lo scongelamento può essere accelerato incubando le piastre radicale in un blocco termico. Impostare una temperatura di 25 gradi Celsius mentre le piastre radicale si scongelano. Le piastre di semenzali possono essere preparate per la conservazione.Per fare ciò, sigillare la parte inferiore della piastra per piantine con del nastro adesivo. Quindi posizionare un coperchio di plastica trasparente sulla parte superiore della piastra per piantine e fissarlo con del nastro microporo.Accumulare insieme le piastre con le piantine, avvolgerle con una pellicola di alluminio e posizionare le piantine di arabidopsis a quattro gradi Celsius. Le piantine possono essere conservate a queste temperature per diverse settimane senza compromettere la vitalità. Assicurarsi che l'acqua nelle piastre radicolari si sia completamente scongelata.Prima di eseguire la procedura di estrazione del DNA, ispezionare anche le piastre per determinare se alcune pozzette contengono notevolmente meno acqua rispetto alla media; aggiungere acqua distillata con una pipetta nelle pozzette che richiedono ulteriore acqua. Successivamente, pipettare 25 microlitri di soluzione di TRISS 500 millimolari e EDTA 50 millimolari in ciascuna pozzetta della piastra radici. Quindi sigillare le pozzette delle piastre radici utilizzando una pellicola di sigillatura termica e una macchina per la termosaldatura.Posizionare le piastre sigillate con le radici sulla macchina Geno Grinder con l'estremità sigillata delle piastre rivolta verso il basso. Agitare le piastre nel Geno Grinder per tre minuti e mezzo a 1.350 colpi al minuto. Trasferire le piastre in una centrifuga dotata di portapiastre per micropiastre e centrifugare per 10 minuti a 3.500 giri al minuto a quattro gradi Celsius per formare il pellet del tessuto radicale polverizzato.Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 20 microlitri di sopranatante da ciascun pozzetto della piastra delle radici a una nuova piastra da 96 pozzetti contenente 80 microlitri di acqua milli Q in ogni pozzetto. Questo estratto diluito contiene DNA genomico che può essere utilizzato direttamente nella reazione di PCR per il genotipaggio secondo protocolli standard. Una volta identificato il genotipo di ciascun piantino, rimuovere le piastre dei piantini dallo stoccaggio in condizioni di freddo e preparare vasi con una miscela di terreno satura d'acqua utilizzando aria pressurizzata e un tubo di gomma; applicare una leggera pressione d'aria sul piccolo foro nel pozzetto della piastra dei piantini per far fuoriuscire il tappo di agar e il piantino dalla piastra, posizionandoli sul banco del laboratorio.Praticare un piccolo foro delle dimensioni del tappo di agar nel terreno. Quindi posizionare il tappo di agar nel terreno e compattare il terreno umido intorno al tappo di agar per fissare la piantina nel terreno. Collocare le piantine trapiantate sotto luce a una temperatura compresa tra 18 e 22 gradi Celsius.Coprire ogni vaso con un coperchio di plastica per i primi due giorni dopo il trapianto. Successivamente, rimuovere il coperchio e coltivare la pianta in condizioni di crescita standard. Questa immagine illustra piantine di Arabidopsis coltivate nella fontana Ice Cap per due settimane e pronte per il prelievo del tessuto.Ciascuno dei due pozzetti contiene un giovane esemplare di arabidopsis. Questa vista laterale degli stessi due pozzetti della piastra radicale mostra le radici avvolte attorno alla superficie interna dei pozzetti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per elaborare fino a 40 piastre icecap nell'arco di una giornata lavorativa di otto ore.Questo consente a un singolo scienziato di produrre preparati di DNA da oltre 3.800 piantine singole in un solo giorno. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di trasferire subito le piastre con le piantine nella fontana di ghiaccio non appena le piantine germinano. Controllare le piastre ogni giorno per non perdere il momento giusto per il trasferimento. Buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.

Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana

Spesso è necessario valutare la potenziale citotossicità di un insieme di composti sulle cellule coltivate. Qui, descriviamo una strategia per lo screening affidabile dei composti tossici in un formato di 96 pozze.

Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Una delicata macchina di caricamento touch-force è costruita da spazzole per capelli umani, bracci robotici e un controller. Le spazzole per capelli sono azionate da bracci robotici installati sulla macchina e si muovono periodicamente per applicare la forza tocco sulle piante. La forza dei tocchi di capelli guidati da macchine è paragonabile a quella dei tocchi applicati manualmente.

Un protocollo dello schermo mutante di segnalazione della forza di manodopera e ripetibile per lo studio della Thigmomorphogenesis di un modello di arabidopsis thaliana

Questo documento descrive due metodi per quantificare le risposte della difesa nell'Arabidopsis thaliana in seguito all'esposizione agli elicitori immunitari: il scoppio ossidativo transitorio e l'inibizione della crescita delle piantine.

Modellazione-Triggered Ossidative Burst e Seedling Growth Assays in Arabidopsis thaliana

Il saggio sull'alluvione delle piantine facilita lo screening rapido delle adesioni di pomodoro selvatico per la resistenza al batterio delle siringhe Pseudomonas. Questo test, utilizzato in combinazione con il test della crescita batterica delle piantine, può aiutare a caratterizzare ulteriormente la resistenza sottostante al batterio e può essere utilizzato per lo screening delle popolazioni di mappatura per determinare la base genetica della resistenza.

Identificazione ad alto contenuto di velocità effettiva della resistenza a Pseudomonas syringae pv. Pomodoro nel pomodoro utilizzando Seedling Flood Assay

Tradurre la purificazione dell'affinità di ribosomi (TRAP) offre la possibilità di sezionare programmi di sviluppo con una minima elaborazione di organi e tessuti. Il protocollo produce RNA di alta qualità da cellule mirate con una sottounità ribosomica denominata GFP (Proteina fluorescente verde). Gli strumenti di analisi a valle, come qRT-PCR o RNA-seq, rivelano profili di espressione specifici del tessuto e del tipo di cellula.

Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

In questo articolo, descriviamo uno strumento avanzato progettato per il monitoraggio della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi di de-eziolamento delle piantine di Arabidopsis . La nuova metodologia fornisce immagini non invasive in tempo reale della fluorescenza della clorofilla ad alta risoluzione spaziale e temporale.

Test non invasivo per la determinazione della cinetica della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi della deeziolazione dell'Arabidopsis

Scopri il metodo Ice-Cap per la genotipizzazione ad alto rendimento di Arabidopsis thaliana e pomodoro in piastre da 96 pozzetti. Questa tecnica consente di isolare tessuti radicali per l'estrazione del DNA in modo rapido e non distruttivo.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione (Video) | JoVE Journal

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

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