Impianto di un bracciale carotidea per innescare Shear-stress aterosclerosi indotta in topi

L'obiettivo generale di questa procedura è impiantare un modificatore dello stress di taglio attorno a una delle due arterie carotidi comuni in un modello murino di aterosclerosi. Questo viene realizzato tagliando innanzitutto le due metà longitudinali del modificatore dello stress di taglio dal polieterechetone stampato. Successivamente, viene aperto il collo del topo sperimentale ed esposta una delle due arterie carotidi comuni.

Due semigusci a manicotto vengono quindi posizionati attorno alle due arterie carotidi comuni e i semigusci vengono interconnessi, utilizzando un filo chirurgico per formare il lume interno conico del manicotto funzionale. Infine, il collo dell'animale viene chiuso. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano parametri di flusso alterati e, mentre lo stress di taglio, che alla fine provoca la formazione di placche aterosclerotiche a monte e a valle del manicotto.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla formazione delle placche aterosclerotiche, può essere applicato anche ad altre domande relative alla disfunzione endoteliale e all'infiammazione vascolare. Il modificatore dello sforzo di taglio è costituito da due metà longitudinali di un cilindro con un lume a forma di cono.

Le semigusci sono realizzati in polieterchetone termoplastico e ogni stampo contiene semigusci di diverse dimensioni, che variano da 150 micrometri a 300 micrometri. Per preparare il modificatore di stress di taglio da utilizzare sotto un microscopio chirurgico, tenere il semiguscio del manicotto con pinze smussate e utilizzare un bisturi affilato per tagliarlo delicatamente dallo stampo. Posizionare il precursore del semiguscio su una piastra piana e non scivolosa.

Fissarla con pinze a punta smussata e tagliarla esattamente lungo l'incisione preformata. Per rimuovere l'estremità chiusa, eliminare delicatamente eventuali bordi taglienti residui. Conservare le mezze coperture classificate per dimensione in etanolo al 70%.

Per la procedura di impianto della cuffia. Iniziare con topi knock-out per APOE di 10 settimane di età che pesano almeno 20 grammi. Indossare camice chirurgico, mascherina, cuffia e guanti sterili.

Sterilizzare gli strumenti per 30 secondi in un sterilizzatore a perline, quindi posizionarli su un foglio sterile opaco. Anestetizzare il topo con fluorina al 3%, verificando la profondità dell'anestesia mediante pinzatura del dito del piede. Rimuovere i peli tra la mandibola e lo sterno applicando un agente depilatorio oppure utilizzando un rasoio elettrico fine.

Posizionare il topo su una piastra chirurgica riscaldata in posizione supina. Applicare quindi una pomata oftalmica a base di vitamina A per prevenire l'essiccamento degli occhi. Se si utilizza isoflurano, posizionare lo spazio del roditore in una maschera e somministrare il 2% di isoflurano.

Fissare con del nastro adesivo il pavimento e le zampe posteriori e posizionare la maschera facciale. Avere a portata di mano il manicotto precedentemente preparato, le semiguscie di diverse dimensioni e un pezzo lungo 2,5 centimetri di sutura di seta da sei ohm per collegare le semiguscie nel sito di occlusione carotidea. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi che mostrano la dissezione dell'arteria carotidea nella posizione definita contribuiscono a ridurre al minimo la manipolazione dei tessuti.

Inoltre, desidero sottolineare che il posizionamento corretto e l'adattamento della cuffia rappresentano il passaggio più importante per ottenere risultati riproducibili. A tal fine, abbiamo definito una posizione anatomica precisa come sito di impianto. Inoltre, il corretto adattamento della cuffia è facilitato da una scanalatura sulla superficie esterna della cuffia, costituita da semigusci, che funge da guida per il filo di collegamento.

Disinfettare la cute con una generosa quantità di Betadine. Utilizzare forbici piccole e affilate per aprire la cute e la fascia sottostante del collo mediante un'incisione mediale di quattro-cinque millimetri a partire dalla sommità dello sterno, dilatare l'apertura, spostare lateralmente la ghiandola parotide destra e inserire espansori per esporre l'area chirurgica. Successivamente, effettuare una dissezione ottusa verso l'interno appena a sinistra della trachea, nel punto in cui il muscolo sterno-mastoideo destro incrocia il muscolo omoioideo destro, al fine di individuare l'arteria carotide comune destra pulsante.

Utilizzando pinzette molto fini, angolate o curve, dissezionare l'arteria carotide comune destra rimuovendo delicatamente il tessuto connettivo circostante. Separare l'arteria carotide dal nervo vago, l'oggetto bianco e filamentoso che corre direttamente lungo l'arteria carotide.

Poiché questo passaggio è necessario per esporre completamente il vaso, prestare attenzione a non danneggiare né il nervo vago né un ramo della giugulare interna destra, che è anch'esso in stretta vicinanza con la carotide. Per scegliere la dimensione corretta della cuffia, confrontare il diametro dell'arteria carotidea esposta con il diametro interno della cuffia, delle semigusci; la larghezza massima della luce della cuffia deve corrispondere al diametro esterno della carotide. Successivamente, inserire con attenzione la punta della pinza sotto l'arteria carotidea.

Aprire la pinza. Far passare il pezzo di sutura di seta da sei oh sotto l'arteria e formare un cappio; tra il cappio e la carotide, posizionare una semiguscio sotto la carotide, in modo che il lato con il restringimento maggiore sia rivolto a valle. Posizionare il secondo semiguscio all'interno del cappio, sopra l'arteria carotidea.

Stringere delicatamente il cappio della sutura e fissare il filo. In questo modo si forma il modificatore funzionale di stress di taglio. Per un posizionamento preciso della cuffia, è essenziale che la sutura si trovi esattamente all'interno della scanalatura preformata sulla superficie esterna della cuffia.

La costrizione conica dell'arteria dovrebbe ora essere chiaramente visibile. La cuffia deve essere sempre posizionata intorno a una delle due arterie carotidi comuni di un animale, e il lato controlaterale funge da controllo. Qui è visibile la forma conica della cavità interna.

Questa forma conica è essenziale per stabilire le tre regioni con dinamiche di flusso distinte. Riposizionare la ghiandola parotide destra nella sua posizione originale. Approssimare e chiudere la cute utilizzando una piccola quantità di punti di sutura in poliprolina 6-0 oppure clip per ferite.

Iniettare una singola dose di cinque milligrammi per chilogrammo di carprofene per via sottocutanea per fornire un trattamento antidolorifico profilattico e posizionare il topo in una camera riscaldata fino al suo recupero. Se l'animale mostra segni di malessere il giorno successivo, somministrare una seconda dose di analgesia. Tipici profili di stress di taglio indotti dal gesso, calcolati a partire da misurazioni Doppler e dalle corrispondenti velocità di flusso basate sulla velocità in contrasto di fase.

Le immagini di risonanza magnetica mostrano che, quando la cuffia è impiantata in un topo knockout per POE a cui viene somministrato una dieta di tipo occidentale, le alterate dinamiche del flusso provocano un deposito di placche aterosclerotiche indotto da stress di taglio a monte della costrizione conica. Uno stress di taglio laminare basso porta allo sviluppo massivo di placche aterosclerotiche con fenotipo più vulnerabile, caratterizzate da nuclei lipidici vicini alla lume centrale, ricoperti soltanto da una sottile capsula fibrosa.

La cavità interna conica della cuffia provoca un aumento della velocità del flusso. In questa zona immediatamente a valle del restringimento, si osserva quasi nessun deposito di placca. L'immediata dilatazione dell'arteria determina una zona di vortici e di parametri di flusso oscillatori, che causa uno sviluppo di placca meno esteso e di un fenotipo più stabile.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come posizionare correttamente un modificatore dello stress di taglio attorno all'arteria carotide comune di un topo.