Efficienti di produzione Parvovirus ricombinante con l'aiuto delle Adenovirus sistemi derivati

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre virus parvo ricombinanti, o rec PVS, ad alti titoli mantenendone la qualità e riducendo i tempi e i costi di produzione. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando una scorta iniziale di virus rec PV mediante trasfezione di cellule HEC 293T con plasmidi rec PV, insieme a un vettore derivato dal virus adenovirus di tipo 5. Poiché l'introduzione di elementi genomici di ad nelle cellule HEC 293T aumenta la produzione di rec PVS di oltre dieci volte.

Rispetto ai protocolli esistenti, è stato generato un nuovo helper AD VP che contiene gli elementi genomici adenovirali necessari per potenziare la produzione di parvovirus ricombinante, nonché l'unità genica VP del parvovirus. Il passo successivo consiste nella produzione e nella purificazione di questo nuovo helper AD VP VP secondo protocolli standard.

L'ultimo passaggio di questa procedura consiste nell'amplificare i PVS ricombinanti mediante infezione concomitante delle cellule NB324K con i virus PV ricombinante e AD-ADP. L'efficienza di produzione del PV ricombinante migliora di oltre 100 volte con questa strategia, che può essere utilizzata esclusivamente una volta prodotta una piccola quantità di PVS ricombinanti tramite trasfezione. Infine, per la titolazione dei ceppi virali prodotti si utilizza una PCR quantitativa in tempo reale oppure un saggio di trasduzione.

Inoltre, viene eseguito un saggio delle placche per confermare che non siano stati generati virus competenti per la replicazione indesiderati durante il processo produttivo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la produzione classica di parvovirus ricombinanti mediante plasmide, nell'atto e nelle cellule trattate, è che una volta prodotte le scorte iniziali di parvovirus ricombinante con l'aiuto della proteina VP dell'adenovirus, la nostra produzione dipenderà interamente dall'infezione virale. Ciò permette l'uso di cellule NBK, che sono ottime produttrici di parvovirus, ma non sono transfezionabili.

In questo modo, è possibile amplificare i virus ricombinanti e aumentare la quantità di virus infettivi di oltre 100 volte, riducendo il tempo e il costo di produzione. A illustrare la procedura sarà Barbara Loic, responsabile dell'Unità di Produzione Virale, che ha sviluppato insieme a noi questo nuovo protocollo. Speriamo che questo video vi sia piaciuto e vi auguriamo buona fortuna nei vostri esperimenti.

È necessaria la produzione di parvovirus ricombinante o rec PV mediante trasfezione per ottenere la quantità minima di rec PVS da utilizzare come inoculo nella successiva produzione di rec PVS mediante infezione. È richiesto un laboratorio di livello di sicurezza biologica due per la produzione di rec PVS un giorno prima del seme di trasfezione. 2 milioni di cellule HEC 2 9 3 T in una piastra da 10 centimetri per ottenere una confluenza cellulare del 50%.

Il giorno della trasfezione, coltivare le cellule in 10 millilitri di DMEM integrato con 10% di FBS, L-glutammina, penicillina e streptomicina, e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera con 5% di anidride carbonica e 92% di umidità. Il giorno della trasfezione, preparare una miscela per la produzione del virus in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere i seguenti reagenti in un rapporto molare di uno a due a uno: tre microgrammi di vettore PV ricombinante contenente il transgene di interesse.

Six microgrammi del vettore P-C-M-V-V-P contenente l'unità del gene della capsidica del parvovirus e otto microgrammi del plasmide helper derivato dall'adenovirus. Pxx sei diluire la miscela di plasmidi con mezzo privo di siero fino a 850 microlitri per ottenere una concentrazione finale di 20 nanogrammi per microlitro. Successivamente, aggiungere 42,5 microlitri del reagente di trasfezione FU gene HD in un rapporto di 2,5 a uno tra reagente FU gene e DNA.

Attenzione a non far toccare il reagente del gene FU alle pareti del tubo; vortexare delicatamente per cinque-dieci secondi, quindi incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia alle cellule. Agitare delicatamente la piastra per distribuire in modo uniforme la miscela.

Incubare la piastra per 72 ore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica e umidità al 92%. Durante questo periodo, le particelle di parvovirus progenie si formano dai plasmidi del parvovirus per consentire il raccolto del virus. Prima, raschiare le cellule insieme al loro mezzo, quindi aspirare e trasferire la sospensione dalla piastra in un tubo di plastica da 15 millilitri.

Centrifugare il tubo a 250 G per cinque minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il 95% del soprannatante, lasciando circa 0,5 millilitri. Vortexare delicatamente il tubo per risospendere il pellet nel soprannatante residuo e trasferire in un tubo einor da 1,5 millilitri.

Congelare la sospensione in un bagno di azoto liquido, quindi scongelare in acqua calda a 37 gradi Celsius. Vortexare il tubo vigorosamente per 15 secondi. Ripetere il ciclo di congelamento-scongelamento altre due volte.

Centrifugare il tubo a 16.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, raccogliere il soprannatante in un tubo nuovo. Il soprannatante a questo stadio contiene l'estratto virale grezzo, che può essere utilizzato come inocolo per la produzione di rec PVS mediante infezione. Aumento della potenza virale.

Le replicazioni dipendono da fattori cellulari espressi nelle cellule in proliferazione. Pertanto, è fondamentale che le cellule utilizzate per la produzione del virus ricombinante siano in condizioni ottimali e seminate a una densità appropriata, come illustrato in questo protocollo. Un giorno prima dell'infezione, seminare 10 milioni di cellule MB 204K in un’unità T175 per ottenere una confluenza cellulare compresa tra il 60 e l'80% nel giorno successivo.

Preparare un secondo flacone contenente lo stesso numero di cellule come controllo. Ogni flacone T 1 75 deve avere 20 millilitri di MEM come volume finale, integrati con 5% FBS, L-glutammina, penicillina e streptomicina, al mattino del giorno dell'infezione. Preparare una miscela virale in un tubo di plastica da due millilitri.

Aggiungere questi reagenti. AGGIUNGERE VP helper. Aggiungere una molteplicità di infezione di 10 rec PVS a un MOI di 0,5 e MEM fino a 1,5 millilitri.

Applicare l'intera miscela virale a uno dei flaconi T 1 75. Incubare il flacone per due ore a 37 gradi Celsius, 92% di umidità e 5% di anidride carbonica, agitando delicatamente ogni 15 minuti. Incubare ulteriormente per 20-24 ore a 37 gradi Celsius, 92% di umidità e 5% di anidride carbonica.

Dopo 20-24 ore, sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco e incubare il matraccio nelle stesse condizioni per 48 ore come indicazione di una produzione virale efficiente. Nel matraccio contenente cellule infettate dal virus dovrebbero essere osservati chiari segni di citotossicità. A partire da 36-48 ore dopo l'infezione, dopo 48 ore, aspirare e trasferire il sopranatante del mezzo dal matraccio in un tubo da centrifuga da 50 millilitri.

Lavare le cellule due volte con 1,5 millilitri di PBS, quindi aggiungere la tripsina e incubare gli occhi per tre-cinque minuti. Successivamente, aggiungere la sospensione cellulare al mezzo rimosso e centrifugare le cellule insieme al sopranatante a 5.000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Eliminare il sopranatante e aggiungere un millilitro di tampone TE al pellet cellulare. Vortexare delicatamente il tubo per risospendere le cellule. Successivamente, congelare la sospensione cellulare in un bagno di azoto liquido e scongelare in acqua calda a 37 gradi Celsius.

Vortexare vigorosamente il tubo per 15 secondi. Ripetere il ciclo di congelamento e scongelamento per tre volte. Successivamente, trattare la sospensione cellulare con la Ben Nase nucleasi per 30 minuti a 37 gradi Celsius al fine di digerire il DNA genomico cellulare e il DNA virale non impacchettato.

Dopo 30 minuti, centrifugare il tubo a 5.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Infine, raccogliere il soprannatante in un tubo nuovo. A questo stadio, il soprannatante contiene un estratto virale grezzo.

I rendimenti tipici di rec PV GFP prodotti seguendo questo protocollo dovrebbero essere nell'intervallo da uno a dieci volte dieci alla ottava unità infettiva virale. Un esempio di stimolazione della produzione di rec PV mediante un plasmide basato su adenovirus è mostrato qui. Estratti grezzi di virus contenenti PHH uno GFP erect PV che porta il gene GFP con o senza.

Il plasmide PXX basato su adenovirus è stato applicato a cellule indicatrici NBK, come osservato in queste microfotografie; è presente un numero maggiore di cellule positive per GFP in presenza di PXX sei. Quando sono stati eseguiti saggi di trasduzione GFP, si è ottenuto un chiaro aumento nella produzione di PV ricombinante in presenza di Pxx sei. La produzione è aumentata da 0,3 unità di trasduzione GFP, o TU per cellula, ottenute con protocolli convenzionali, a circa cinque TU per cellula ottenuti con questo protocollo.

I risultati del saggio di trasduzione GFP indicano che i geni E2a, E4 e RNA VA dell'adenovirus contenuti nel PXX6 sono in grado di potenziare la produzione di parvovirus. Questa figura successiva mostra un esempio rappresentativo della produzione di PV ricombinante mediante infezione. Le cellule NB324K sono state infettate con il virus helper ADP purificato e successivamente superinfettate con uno dei due parvovirus ricombinanti.

Per determinare i titoli virali, sono stati utilizzati estratti cellulari grezzi mediante un saggio di trasduzione che ha mostrato come l'aiuto del VP del AD aumentasse ulteriormente la produzione del PV ricombinante fino a oltre 70 T per cellula. Infine, lotti virali prodotti in presenza o in assenza del ADP sono stati analizzati per il loro contenuto di particelle virali competentemente replicative mediante un saggio di placche su cellule indicatrici MB tre 20 4K. I risultati indicano che l'aiuto del ADP potenzia la produzione del PV ricombinante senza aumentare la presenza di particelle virali indesiderabili capaci di replicazione dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica consente agli scienziati nel campo della terapia genica e del cancro di aumentare ulteriormente la produzione di virus ricombinanti ad alta potenza. Utilizzando varianti di bioreattori, è possibile ottenere grandi quantità necessarie in un contesto clinico.