Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare le regioni del DNA associate a uno specifico RNA non codificante utilizzando la QPCR o il sequenziamento ad alto rendimento. Ciò si ottiene reticolando le cellule per intrappolare le interazioni native D-N-A-R-N-A in vivo. In una seconda fase, le cellule vengono lisate e sottoposte a sonicazione per solubilizzare il lisato cellulare e la cromatina pura in piccoli frammenti.

Successivamente, oligo antisenso biotinilati vengono aggiunti al lisato cellulare al fine di arricchire in modo specifico per i complessi R-N-A-D-N-A di interesse, si ottengono risultati che chiariscono l'identità di siti genomici legati all'RNA non codificante basati su QPCR o sequenziamento ad alto rendimento. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come R-N-A-D-N-A FISH, è che il chirp consente mappe dell'intero genoma di siti di legame dell'RNA non codificante a risoluzioni vicine alla coppia di basi. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo dell'RNA non codificante, come ad esempio come le rocce, gli RNA e i moscerini maschi raggiungono la compensazione del dosaggio.

Le implicazioni di questa tecnica, l'estensione verso le terapie di malattie non codificanti NA correlate perché permette di comprendere meglio come l'RNA non codificante regola gli stati della cromatina e l'espressione genica. Per questo isolamento della cromatina mediante purificazione dell'RNA o esperimento chirp, 40 milioni di cellule verranno raccolte dopo la centrifugazione, travasando il PBS e rimuovendo il liquido rimanente aspirando con cura ad un angolo rimosso il pellet cellulare picchiettando il fondo del tubo di Falcon. Aggiungere l'1% di glutaraldeide appena preparato, iniziando con un piccolo volume e risospendere il pellet cellulare, rabboccare fino al massimo volume, quindi invertire per mescolare la reticolazione per 10 minuti a temperatura ambiente su uno shaker o un rotatore end-to-end, spegnere la reazione di reticolazione con un decimo volume di glicina molare da 1,25 e lasciare su uno shaker a temperatura ambiente per cinque minuti, Le celle diventeranno arancioni brillanti.

Centrifugare quindi a 2000 RCF per cinque minuti, decantare e aspirare il surnatante e lavare nuovamente il pellet con 20 millilitri di centrifuga PBS refrigerata, aspirare il surnatante e risospendere il palato reticolato lavato con PBS refrigerato. Trasferire ogni millilitro di cellule in una provetta einor e centrifugare a 2000 RCF per tre minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, utilizzare una punta per pipetta per rimuovere con cura la quantità di PBS più possibile.

Flash, congelare tutti i pellet cellulari in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius a tempo indeterminato. Per preparare il lisato cellulare per il chirp, scongelare i pellet di cellule reticolate congelati a temperatura ambiente. Toccare con forza per rimuovere e mescolare il pellet della cella.

Centrifugare i pellet e utilizzare una punta affilata da 10 microlitri per rimuovere eventuali residui di PBS su una bilancia elettronica con una precisione di un milligrammo. Strappare la massa di un tubo einor vuoto. Pesare ogni pellet e registrarne il peso.

Aggiungere 10 x volume di tampone di lisi integrato con un nuovo inibitore della proteasi PMSF e super ace in ciascuna provetta e risospendere il pellet. Il lisato cellulare deve essere mangiato immediatamente dopo la sua preparazione. Trasferire non più di 1,5 millilitri di lisato in ogni provetta da 15 millilitri e inserire le sonde di sonicazione avvitandole saldamente.

Quindi posizionare le valvole in una biorottura, sonicare a quattro gradi Celsius all'impostazione più alta con intervalli di impulsi di 30 secondi su 45 secondi. Controllare il lisato ogni 30 minuti. Continuare la sonicazione fino a quando il lisato cellulare non è più torbido.

Questo può richiedere da 30 minuti a quattro ore a seconda del numero di provette, del volume del campione, della temperatura del bagno e del periodo di tempo di sonicazione. Quando il lisato diventa limpido, trasferisci cinque microlitri in una provetta einor fresca. Aggiungere il tampone DNA proteasi K e il vortice di proteasi K per mescolare e centrifugare, incubare brevemente per 45 minuti a 50 gradi Celsius dopo aver estratto il DNA con un kit di purificazione PCR.

Controlla la dimensione del DNA su un gel all'1%aros. La maggior parte dello striscio di DNA dovrebbe essere composto da 100 a 500 paia di basi, indicando una centrifuga di sonicazione completa. Aliquote da un millilitro di campioni sonicati a 16, 100 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius, trasferire il surnatante in provette einor fresche e congelare in azoto liquido per iniziare la procedura per le provette di scongelamento chirp di cromatina a temperatura ambiente per un tipico campione chirp.

Utilizzando un millilitro di lisato, rimuovere 10 microlitri per l'input di RNA e 10 microlitri per l'input di DNA e metterli in provette eorin. Tenete il ghiaccio fino a un ulteriore momento. Utilizzare trasferire un millilitro di ciascun campione di cromatina in una provetta di falco da 15 millilitri.

Aggiungere due millilitri di tampone di ibridazione a ciascuna provetta. Quindi, scongelare le sonde a temperatura ambiente. Questi oligo di piastrellatura biotinilati sono marcati in base alla loro posizione lungo l'RNA e separati in due pool.

Il pool pari contiene tutte le sonde con numeri pari. E il pool dispari contiene sonde con numeri dispari. Tutti gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando entrambi i pool che fungono da controlli interni l'uno per l'altro.

Uno degli aspetti più impegnativi del protocollo vero e proprio è che tutte le fasi di ibridazione e lavaggio devono essere eseguite a 37 gradi. Per garantire una temperatura sperimentale costante, eseguire tutti i passaggi all'interno o in prossimità di un forno di abitazione, aggiungere il volume appropriato di sonde a tubi specifici. Mescolare bene, incubare a 37 gradi per quattro ore agitando 20 minuti prima che l'ibridazione sia completa.

Preparare le perline magnetiche Cone. Utilizzare 100 microlitri per 100 moli di pico. Lavare tre volte con un millilitro di tampone di lisi integrato utilizzando il magnete a due strisce Dyna mag per separare le perle dal tampone.

Dopo il lavaggio finale, sospendere nuovamente le perle nel volume originale del tampone di lisi e integrare con superin fresh PMSF e inibitore della proteasi. Al termine della reazione di ibridazione di quattro ore, aggiungere 100 microlitri di perle a ciascuna miscela di provette. Incubare bene a 37 gradi Celsius per 30 minuti agitando le perle di lavaggio con un millilitro di tampone di lavaggio, preriscaldare a 37 gradi Celsius al primo lavaggio.

Utilizzare una striscia magnetica dyna mag 15 per separare le perline, travasare e risospendere in un millilitro di tampone di lavaggio, trasferire in un tubo EOR da 1,5 millilitri. Incubare a 37 gradi Celsius agitando per cinque minuti nei lavaggi successivi, centrifugare ogni provetta in una mini centrifuga e posizionare il campione su una striscia magnetica dyna mag due per un minuto di decantazione. Pulisci eventuali gocce con una salvietta Kim e risospendi in un millilitro.

Lavare il tampone, incubare a 37 gradi Celsius agitando per cinque minuti. Ripetere per un totale di cinque lavaggi all'ultimo lavaggio Resus. Sospendere bene le perle, rimuovere 100 microlitri e mettere da parte per l'isolamento dell'RNA, riservare 900 microlitri per la frazione di DNA.

Posizionare tutti i tubi sulla striscia magnetica del tubo dyna mag e rimuovere il tampone di lavaggio. Dopo una breve centrifuga, posizionare nuovamente la provetta sulla striscia magnetica con una punta affilata da 10 microlitri. Rimuovere completamente il tampone di lavaggio rimanente da ciascun tubo.

Le frazioni di RNA e DNA vengono successivamente isolate dai campioni chirp per la quantificazione e il sequenziamento. Questa figura mostra l'arricchimento di telomerasi umana, RNA o Turk da cellule HELOC rispetto a GA dh. Un abbondante RNA cellulare che funge da controllo negativo.

La maggior parte dell'RNA turco presente nella cellula, circa l'88%, è stato abbattuto eseguendo il chirp, mentre solo lo 0,46% dell'RNA GH DH è stato recuperato dimostrando un fattore di arricchimento di circa 200 volte Le sonde non specifiche come le sonde mirate a LAC ZRNA, che di solito non è espresso nelle cellule di mammifero, possono essere utilizzate come ulteriori controlli negativi. Ci si aspetta che le regioni del DNA leghino il bersaglio. Gli RNA lunghi non codificanti sono tipicamente arricchiti su regioni negative quando misurati mediante QPCR.

Questa figura mostra la convalida QPCR di quattro siti legati all'aria calda nei fibroblasti primari del prepuzio umano, determinata eseguendo chirp SSE nella stessa linea cellulare, mentre i siti di DNA DH di Turk e GA fungono da regioni di controllo negativo. Sia i set di sonde pari che quelli dispari hanno prodotto un arricchimento comparabile dei siti legati all'aria calda previsti rispetto alle regioni negative. Un segno distintivo dei veri siti di legame dell'RNA lungo non codificante.

Una mappa globale dei lunghi siti di legame dell'RNA non codificante può essere ottenuta mediante sequenziamento ad alto rendimento del DNA arricchito con chirp, come illustrato da questi dati del trla long non-coating RNA Rocks two, che è noto per interagire con il cromosoma X in un modo che è necessario per la compensazione del dosaggio. Sia i campioni pari che quelli dispari sono stati sequenziati separatamente e i loro rumori unici sono stati eliminati per produrre una traccia di segnali sovrapposti in cui ogni picco indica una forte vista di rocce che si legano durante il tentativo di questa procedura. È importante esercitare la corretta tecnica priva di RNA Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il protein do blotting, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali proteine interagiscono con il DRNA non clinico di interesse dopo il suo sviluppo. CHI ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA per mappare l'aact RN nelle cellule di coltura e nei tessuti fissati.