Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare le regioni di DNA associate a un particolare RNA non codificante mediante QPCR o sequenziamento ad alto rendimento. Questo viene ottenuto incrociando le cellule per intrappolare in vivo le interazioni native DNA-RNA. Come secondo passaggio, le cellule vengono lisate e sottoposte a sonificazione per solubilizzare il lisato cellulare e frammentare la cromatina in piccoli pezzi.

In seguito, vengono aggiunti oligonucleotidi antisenso biotinilati al lisato cellulare al fine di arricchire in modo specifico i complessi R-N-A-D-N-A di interesse; i risultati ottenuti chiariscono l'identità dei siti genomici legati da RNA non codificanti, basandosi su QPCR o su sequenziamento ad alto rendimento. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'ibridazione in situ R-N-A-D-N-A (FISH), è che chirp consente di ottenere mappe su scala genomica dei siti di legame degli RNA non codificanti con risoluzione prossima alla coppia di basi. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo degli RNA non codificanti, come ad esempio il modo in cui gli RNA roX e le mosche maschio realizzano la compensazione del dosaggio.

Le implicazioni di questa tecnica riguardano il potenziale sviluppo di terapie per malattie legate a NA non codificanti, poiché consente di comprendere meglio come gli RNA non codificanti regolino gli stati della cromatina e l'espressione genica. Per questo esperimento di isolamento della cromatina mediante purificazione dell'RNA, o ChIRP, verranno raccolti 40 milioni di cellule dopo centrifugazione, si decanterà il PBS e si rimuoverà il liquido residuo aspirando con attenzione ad angolo, quindi si staccherà il pellet cellulare battendo delicatamente sul fondo del tubo falcon. Si aggiungerà glutaraldeide al 1% appena preparata, iniziando con un piccolo volume e risospendendo il pellet cellulare, quindi si porterà a volume finale e si capovolgerà per mescolare; si effettuerà il cross-linking per 10 minuti a temperatura ambiente su uno shaker end-to-end o un rotatore. Si bloccherà la reazione di cross-linking aggiungendo un decimo del volume di glicina 1,25 M e si lascerà sullo shaker a temperatura ambiente per cinque minuti; le cellule diventeranno di un colore arancione brillante.

Successivamente centrifugare a 2000 RCF per cinque minuti, versare delicatamente e aspirare il soprannatante, quindi lavare il pellet con 20 millilitri di PBS freddo, centrifugare nuovamente, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet incrociato lavato in PBS freddo. Trasferire ogni millilitro di cellule in una provetta eppendorf e centrifugare a 2000 RCF per tre minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, utilizzare una punta pipetta per rimuovere con attenzione il più possibile del PBS.

Flash, congelare immediatamente tutti i pellet cellulari in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius indefinitamente. Per preparare il lisato cellulare per chirp, scongelare i pellet cellulari congelati e cross-linkati a temperatura ambiente. Battere energicamente per staccare e mescolare il pellet cellulare.

Centrifugare i pellet e utilizzare una punta da 10 microlitri affilata per rimuovere il PBS residuo su una bilancia elettronica con accuratezza di un milligrammo. Pesare la massa di una provetta eppendorf vuota. Pesare ogni pellet e registrarne il peso.

Aggiungere un volume 10 x di buffer di lisi, integrato con inibitore di proteasi PMSF e super ace freschi, in ogni provetta e risospendere il pellet. Il lisato cellulare deve essere trattato immediatamente dopo la sua preparazione. Trasferire non più di 1,5 millilitri di lisato in ciascuna provetta falcon da 15 millilitri e inserire le sonde per la sonica, avvitandole saldamente.

Successivamente, posizionare i tubi in un bio-ruptor e sottoporli a sonificazione a quattro gradi Celsius alla massima potenza, con intervalli di impulsi di 30 secondi accesi e 45 secondi spenti. Controllare il lisato ogni 30 minuti. Continuare la sonificazione fino a quando il lisato cellulare non risulta più torbido.

Questo processo può richiedere da 30 minuti a quattro ore, a seconda del numero di provette, del volume del campione, della temperatura del bagno e della durata della sonificazione. Quando il lisato diventa limpido, trasferire cinque microlitri in una nuova provetta einor. Aggiungere il buffer per DNA proteasi K e la proteasi K, vortexare per mescolare, centrifugare brevemente e incubare per 45 minuti a 50 gradi Celsius, dopo aver estratto il DNA con un kit di purificazione per PCR.

Verificare la dimensione del DNA su un gel all'1% di agarosio. La maggior parte della striscia di DNA dovrebbe avere una dimensione compresa tra 100 e 500 paia di basi, indicando una sonica completa. Centrifugare aliquote da un millilitro dei campioni sonificati a 16.100 RCF per 10 minuti a quattro gradi Celsius, trasferire il soprannatante in nuove provette Eppendorf e congelare rapidamente in azoto liquido per iniziare la procedura per il disgelo dei tubi ChIRP; portare i tubi di cromatina a temperatura ambiente per un campione ChIRP tipico.

Utilizzando un millilitro di lisato, prelevare 10 microlitri per l'input di RNA e 10 microlitri per l'input di DNA e posizionarli in provette einor. Mantenere sul ghiaccio fino a ulteriore uso. Trasferire un millilitro di ogni campione di cromatina in una provetta falcon da 15 millilitri.

Aggiungere due millilitri di buffer di ibridazione a ciascuna provetta. Successivamente, scongelare le sonde a temperatura ambiente. Questi oligonucleotidi biotinilati in tiling sono etichettati in base alla loro posizione lungo l'RNA e suddivisi in due pool.

Il pool pari contiene tutte le sonde con numeri pari. E il pool dispari contiene le sonde con numeri dispari. Tutti gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando entrambi i pool, che fungono da controlli interni l'uno per l'altro.

Uno degli aspetti più complessi del protocollo vero e proprio è che tutti i passaggi di ibridazione e lavaggio devono essere eseguiti a 37 gradi. Per garantire una temperatura sperimentale costante, eseguire tutti i passaggi all'interno o vicino a un forno di ibridazione. Aggiungere il volume appropriato di sonde a tubi specifici. Mescolare accuratamente e incubare a 37 gradi per quattro ore con agitazione; 20 minuti prima del completamento dell'ibridazione.

Preparare le perle magnetiche C una. Utilizzare 100 microlitri per 100 pico moli di sonde. Lavare con un millilitro di buffer di lisi non integrato tre volte, usando il magnete Dyna mag due strip per separare le perle dal buffer.

Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle nel volume originale di buffer di lisi e aggiungere PMSF e inibitore delle proteasi freschi. Al termine della reazione di ibridazione di quattro ore, aggiungere 100 microlitri di perle a ciascun tubo e mescolare. Incubare bene a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione, quindi lavare le perle con un millilitro di buffer di lavaggio preriscaldato a 37 gradi Celsius nel primo lavaggio.

Utilizzare una striscia magnetica Dyna Mag 15 per separare le perle, decantare e risospendere in un millilitro di buffer di lavaggio, quindi trasferire in una provetta EOR da 1,5 millilitri. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione per cinque minuti nei lavaggi successivi, centrifugare ogni provetta in una minicentrifuga e posizionare il campione su una striscia magnetica Dyna Mag 2 per un minuto, quindi decantare il campione. Rimuovere eventuali gocce con un fazzoletto Kim e risospendere in un millilitro.

Sciacquare con tampone, incubare a 37 gradi Celsius con agitazione per cinque minuti. Ripetere per un totale di cinque lavaggi; all'ultimo lavaggio, risospendere. Sospendere bene le perle, rimuovere 100 microlitri e metterli da parte per l'isolamento dell'RNA; riservare 900 microlitri per la frazione di DNA.

Posizionare tutte le provette sulla striscia magnetica per provette DynaMag e rimuovere il buffer di lavaggio. Dopo una breve centrifugazione, posizionare nuovamente la provetta sulla striscia magnetica utilizzando una punta da pipetta da 10 microlitri affilata. Rimuovere completamente il buffer di lavaggio residuo da ciascuna provetta.

Le frazioni di RNA e DNA vengono successivamente isolate dai campioni ChIRP per la quantificazione e il sequenziamento. Questa figura mostra l'arricchimento della telomerasi umana, dell'RNA o di Turk nelle cellule HELOC rispetto a GA dh. Un RNA cellulare abbondante utilizzato come controllo negativo.

La maggior parte dell'RNA Turk presente nella cellula, circa l'88%, è stata precipitata mediante chirp, mentre solo lo 0,46% dell'RNA GA DH è stato recuperato, dimostrando un fattore di arricchimento di circa 200 volte. Sonde non specifiche, come quelle dirette contro l'RNA LAC Z, che normalmente non è espresso nelle cellule di mammifero, possono essere utilizzate come ulteriori controlli negativi. Le regioni di DNA che si prevede si leghino all'obiettivo. Gli RNA non codificanti lunghi sono tipicamente arricchiti rispetto alle regioni negative quando misurati mediante QPCR.

Questa figura mostra la validazione mediante qPCR di quattro siti legati da hot air in fibroblasti primari di prepuzio umano, determinati eseguendo chirp SSE nella stessa linea cellulare, mentre i siti di DNA Turk e GA DH fungono da regioni di controllo negativo. Sia i set di sonde pari che dispari hanno prodotto un arricchimento comparabile dei siti legati da hot air attesi rispetto alle regioni negative. Un tratto distintivo dei veri siti di legame di RNA non codificanti lunghi.

Una mappa globale dei siti di legame degli RNA non codificanti lunghi può essere ottenuta mediante sequenziamento ad alto rendimento del DNA arricchito con chirp, come illustrato da questi dati relativi all'RNA non codificante lungo trla Rocks due, noto per interagire con il cromosoma X in un modo necessario per la compensazione del dosaggio. I campioni pari e dispari sono stati sequenziati separatamente e i loro rumori unici sono stati eliminati per produrre un tracciato di segnali sovrapposti, in cui ogni picco indica un forte sito di legame di Rocks due. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale adottare una corretta tecnica priva di RNasi.

Altri metodi, come il dot blotting proteico, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quali proteine interagiscono con l'RNA non codificante di interesse dopo il suo sviluppo. CHI ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA per mappare l'interazione dell'RNA in cellule in coltura e tessuti fissati.