Idrofobo Salt-modificato Nafion per l'immobilizzazione degli enzimi e la stabilizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare un polimero micellare per l'immobilizzazione e la stabilizzazione di enzimi. Per realizzare questo obiettivo, innanzitutto mescolare la sospensione di neon con il sale bromuro di ciale ammonio e vortexare la miscela al fine di scambiare la forma protonata di nafion con sali di ammonio. Il secondo passaggio consiste nell'essiccare il polimero ottenuto versando la miscela in una barchetta per evaporazione e lasciando evaporare i solventi.

Successivamente, immergere il polimero in acqua deionizzata per 12-24 ore per rimuovere il sale in eccesso. Dopo l'estrazione del sale, risciacquare il polimero con acqua e quindi lasciarlo asciugare completamente per evaporazione. L'ultimo passaggio consiste nel trasferire il polimero in un vial pulito e risospendere il polimero in un solvente per l'utilizzo nell'immobilizzazione enzimatica. Alla fine, questo polimero per l'immobilizzazione enzimatica viene utilizzato per migliorare la stabilità degli enzimi nei saggi di attività.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché la procedura sembra estremamente semplice, ma il processo di essiccazione è fondamentale per la fabbricazione di un polimero funzionale. A dimostrare la procedura sarà Shu, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare la procedura di modifica del nafion con sali di ammonio di Nerium, misurare un eccesso molare triplo rispetto ai gruppi acidi solfonici presenti sul polimero di nafion, utilizzando il sale di bromuro di alchilammonio.

Trasferire il sale di bromuro di alchilammonio in un vial di vetro energeticamente. Agitare un flacone di sospensione al 5% peso in volume di nafion per circa 30 secondi per assicurare una sospensione uniforme del nafion in soluzione. Pipettare due millilitri del nafion ora risospeso e aggiungerli al vial di vetro contenente il sale di bromuro di ammonio AGU.

Vortexare il vial a 900 giri/min per 10-15 minuti. Successivamente, versare la soluzione viscosa in un contenitore di pesatura in plastica e utilizzare una pipetta per trasferire qualsiasi soluzione residua dal vial al contenitore di pesatura. In questo esempio, il contenitore viene parzialmente coperto e lasciato sul banco del laboratorio per permettere ai solventi di evaporare completamente dal contenitore di pesatura a un tasso di evaporazione che richiede più di sei ore.

L'evaporazione completa di tutto il solvente al giusto tasso di evaporazione dovrebbe lasciare un film trasparente giallo o marrone sul fondo della capsula di pesata, come mostrato qui. Se il solvente evapora troppo rapidamente, si formerà un materiale crostoso o cristallino invece di un film trasparente, indicando che la struttura micellare del polimero è stata distrutta. Se l'evaporazione del solvente è troppo lenta o se il sale di ammonio reagisce per troppo tempo assorbendo troppa umidità, si formerà un gel arancione appiccicoso o un materiale cristallino bianco.

In entrambi i casi, la procedura deve essere riavviata. Dopo che tutto il solvente è evaporato al tasso di evaporazione appropriato, riempire il vassoio di pesatura con 10-20 millilitri di acqua deionizzata da 18 megaohm per centimetro, coprire e lasciare in ammollo per 12-24 ore per rimuovere i sali in eccesso di bromuro di alchilammonio e HBr. Dopo 12-24 ore, pipettare l'acqua e aggiungere acqua deionizzata in quantità sufficiente a riempire il vassoio. Prestare attenzione a pipettare sempre allontanandosi dal film polimerico per evitare di perderne parte.

Sciacquare complessivamente per tre volte dopo gli sciacqui. Lasciare il vassoio di pesatura scoperto fino a quando il polimero non sarà completamente asciutto. Quando sarà completamente asciutto, il polimero dovrà essere un film plastico trasparente e leggermente fragile.

Al contrario, i polimeri che non sono stati essiccati correttamente avranno un aspetto molto diverso dopo l'estrazione del sale, come mostrato qui. Utilizzando una spatola, rimuovere con attenzione il film essiccato dal vassoio della bilancia e trasferirlo in un vial di vetro pulito. Aggiungere due millilitri di etanolo e tre sfere ceramiche per la miscelazione e sottoporre a vortex per quattro ore o fino a quando il film polimerico non è completamente risospeso.

La soluzione modificata con ammonio alchilico è ora pronta per essere utilizzata nell'immobilizzazione enzimatica. Se l'enzima da immobilizzare è un enzima secco, pesare un milligrammo di enzima in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere un millilitro di tampone fosfato a cento millimoli e pH 7 per ottenere una soluzione enzimatica da un milligrammo per millilitro. Trasferire 120 microlitri della soluzione enzimatica da un milligrammo per millilitro in un nuovo tubo.

Aggiungere 60 microlitri della soluzione di nafion modificato con ammonio ALK e vortexare per 10 secondi. Il rapporto tra enzima e soluzione polimerica deve essere mantenuto di due a uno, qualora questa miscela debba essere aumentata per un elevato numero di repliche. Infine, pipettare 60 microlitri della soluzione enzima-polimero sul fondo di ciascuna delle tre cuvette separate da un centimetro quadrato e lasciarle asciugare tutta la notte.

La stabilità dell'enzima all'interno del film polimerico può quindi essere valutata mediante saggi di attività enzimatica come dimostrato. Per iniziare questo saggio, aggiungere i seguenti reagenti nel tubo a saggio rivestito con il polimero nafion modificato e l'enzima deidrogenasi dipendente da NAD: 1,3 millilitri di pirofosfato di sodio 50 millimolare, 1,5 millilitri di nicotinamide adenina dinucleotide 15 millimolare appena preparata o NAD e 0,1 millilitri di acqua.

Posizionare il vial in uno spettrofotometro UV-visibile impostato alla lunghezza d'onda di 340 nanometri. Aggiungere 0,1 millilitri di etanolo nel vial e mescolare i reagenti pipettando delicatamente la soluzione su e giù per cinque volte; per il bianco, utilizzare 0,1 millilitri di acqua aggiuntiva al posto di 0,1 millilitri di etanolo. Cinque minuti dopo l'aggiunta dei reagenti al vial, registrare l'assorbanza a 340 nanometri.

Registrare nuovamente l'assorbanza 20 minuti dopo l'aggiunta dei reagenti al matraccio tarato; questi due punti dati verranno riportati su un grafico per ottenere una pendenza utilizzabile nei calcoli dell'attività per determinare l'attività enzimatica specifica della pq immobilizzata. Pipettare questi reagenti nel matraccio tarato contenente il polimero di nafion modificato e la deidrogenasi dipendente da PQQ. 1,5 millilitri di fosfato di sodio e 200 microlitri di solfato di fenazina metile (PMS) a 600 micromolare.

Posizionare il vete in uno spettrofotometro UV-visibile impostato alla lunghezza d'onda di 600 nanometri e azzerare lo strumento. Aggiungere 100 microlitri di una miscela composta da 700 microlitri di cloruro di endemolo o DCIP e 200 microlitri del substrato di interesse. Mescolare i reagenti pipettando delicatamente la soluzione su e giù per cinque volte per ottenere un bianco.

Utilizzare 200 microlitri di acqua al posto del substrato di interesse. Cinque minuti dopo l'aggiunta dei reagenti, registrare l'assorbanza a 600 nanometri.

Registrare nuovamente l'assorbanza 20 minuti dopo l'aggiunta dei reagenti per iniziare il saggio. Aggiungere al Q VET co-capolato con il polimero di nafion modificato e glucosio ossidasi. Due millilitri di una soluzione contenente i seguenti componenti: acido para-idrossibenzoico 0,2 molare, azoturo di sodio 0,02%, perossidasi 128 unità, 4-amminoantipirina 0,3 millimolare, fosfato di potassio uno molare e glucosio 50 millimolari.

Mescolare la soluzione aspirando e dispensando cinque volte con la pipetta. Posizionare la provetta Q in uno spettrofotometro UV-visibile impostato alla lunghezza d'onda di 510 nanometri. Cinque minuti dopo l'aggiunta dei reagenti alla provetta qve.

Registrare l'assorbanza a 510 nanometri. Successivamente, registrare nuovamente l'assorbanza a 20 minuti dall'aggiunta dei reagenti. Questa tabella mostra i risultati del saggio dell'attività della glucosio deidrogenasi dipendente da NAD immobilizzata e di polimeri di nafion modificati selezionati.

È stato osservato che la glucosio deidrogenasi dipendente dal NAD immobilizzata presentava un'attività specifica inferiore rispetto all'enzima in soluzione tampone. Ciò è dovuto al fatto che le membrane polimeriche riducono il trasporto di molecole grandi; sebbene il glucosio, il substrato per il saggio, sia di piccole dimensioni, il coenzima NAD deve diffondere all'interno e all'esterno della membrana. Per la deidrogenasi dipendente dal NAD, la limitazione al trasporto causata dall'immobilizzazione nel polimero riduce l'attività enzimatica osservata.

La tabella successiva mostra i risultati dei saggi sull'attività della deidrogenasi del glucosio dipendente da PQQ immobilizzata su diversi polimeri di nafion modificati. È importante osservare qui l'attività maggiore degli enzimi immobilizzati sulla maggior parte dei film di nafion rispetto agli enzimi in soluzione tampone. Poiché la deidrogenasi del glucosio dipendente da PQQ è una proteina associata alla membrana, il nafion modificato idrofobico fornisce un ambiente simile alla membrana, più idoneo del tampone a stabilizzare l'enzima attivo dipendente da PQQ, aumentandone così l'attività.

Infine, i risultati rappresentativi del saggio sull'attività specifica della glucosio ossidasi. Nel presente tavolo sono riportati i polimeri di nafion immobilizzati e modificati selezionati. I saggi enzimatici effettuati per ciascun polimero con ciascuno dei tre enzimi mostrano che le tendenze nell'attività specifica relativa, rispetto all'enzima in soluzione, dipendono dal sistema enzimatico.

Di conseguenza, il polimero esatto necessario per ciascun enzima deve essere ottimizzato. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il passaggio di essiccazione è cruciale per questa particolare procedura.