Name: Idrofobo Salt-modificato Nafion per limmobilizzazione degli enzimi e la stabilizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Impara a sintetizzare Nafion modificato idrofobicamente per l'immobilizzazione e la stabilizzazione degli enzimi. Questo metodo biochimico migliora la stabilità delle proteine nei saggi di attività enzimatica.

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Gli autori riconoscono l&#39;Office of Naval Research, consiglio di soia Uniti, e la National Science Foundation per il finanziamento.

1. Modifica del Nafion con sali di ammonio quaternario <ol><li> Agitare una bottiglia del 5% w / v sospensione Nafion vigorosamente per ca. 30 secondi per assicurare che Nafion viene sospeso in soluzione uniforme. </li><li> Pipettare in 2 mL di Nafion ora risospeso in una fiala di vetro (volume fiala può contenere da 2,5 ml a 10 ml). </li><li> Misura di 3 volte in eccesso molare (rispetto a gruppi di acido solfonico nel polimero Nafion) del sale di alchil ammonio bromuro (masse appropriate sono mostrati in Tabella 1) ed aggiungere al flaconcino contenente il 2 mL di Nafion. </li><li> Vortex il flacone a 1500 rpm per 10-15 minuti. </li><li> Versare la soluzione viscosa in un vassoio di plastica di peso che misura ca. 3 x 3 pollici, e utilizzare una pipetta per trasferire i residui della soluzione dal flaconcino al vassoio di pesatura. </li><li> Lasciare evaporare i solventi dal peso barca, lasciando un giallo / marrone, pellicola trasparente sul fondo del vassoio di pesatura (Figura 2). Il tasso di evaporazione del solvente deve essere tale che ci vuole più di 6 ore per evaporare tutto il solvente. Se il solvente evapora troppo velocemente, un bianco, croccante materiale formerà, invece di una pellicola trasparente che indica che la struttura micellare del polimero è stata distrutta, ed è necessario riavviare la procedura. Se evaporazione del solvente è troppo lento, un de-umidificatore può essere necessario, perché troppo lenta evaporazione porta normalmente a uno cattivo gusto, gel arancione ed è necessario riavviare la procedura. Intervalli di temperatura tipici per evaporazione del solvente sono 20 - 37 ° C. Le condizioni effettive di essiccazione sono funzione della temperatura e dell&#39;umidità relativa nella camera, ma è importante che l&#39;essiccazione essendo lento per mantenere struttura micellare, ma non troppo lento per permettere la formazione di gel. </li><li> Riempire il peso barca con 18M Qcm acqua deionizzata (10-20 ml di acqua), coprire e lasciare in immersione per 12-24 ore per rimuovere i sali in eccesso alchil ammonio bromuro e HBr. </li><li&gt; Versare (o pipetta) l&#39;acqua e lavare 3 volte con acqua deionizzata a sufficienza per riempire il cassetto ogni volta. Fare attenzione a non perdere uno dei film polimerico in questa fase. </li><li> Lasciare il vassoio di pesatura per sedersi scoperto fino a che il polimero è completamente asciutta A questo punto, il polimero dovrebbe essere una pellicola trasparente e piuttosto fragili plastica. Anche in questo caso, se l&#39;aria è molto umida, uno de-umidificatore può essere necessario per completare l&#39;evaporazione in modo tempestivo. </li><li> Utilizzando una spatola, rimuovere con cura la pellicola essiccata dal vassoio di pesatura e trasferirlo in una fiala di vetro pulito. </li><li> Aggiungere 2 mL di etanolo e 3 perle di ceramica di miscelazione e miscelare per 4 ore o fino a quando il film polimerico viene completamente ri-sospeso. </li></ol> 2. Immobilizzazione di enzimi in TBAB Nafion-Modified per saggi di attività <ol><li> Per un enzima secco, pesare 1-10 mg dell&#39;enzima in una provetta da 1,5 ml, e aggiungere 1 ml di 100 mM tampone fosfato pH 7 per creare un 1-10 mg / ml di soluzione enzimatica. For un enzima che è in soluzione, utilizzare un acido bicinconinico (BCA) dosaggio 13 per determinare la quantità di proteine, e aggiungere una quantità appropriata di 100 mM tampone fosfato per portare la concentrazione di proteina di 1-10 mg / mL. 1-10 mg mL / in genere corrisponde a 1-50 nanomoli / mL. </li><li> Per 120 microlitri della 1 mg / mL di soluzione enzimatica, aggiungere 60 ul di alchil ammonio-modificato soluzione di Nafion, e vortex per 10 secondi. (Questa miscela può essere scalato per un gran numero di repliche. Mantenere l&#39;enzima-to-polimero rapporto di soluzione 2:1.) </li><li> Pipettare 60 pl di dell&#39;enzima / polimero soluzione nel fondo 3 distinti 1 cm 2 cuvette, e lasciare asciugare durante la notte. </li></ol> 3. Saggio di immobilizzata NAD-Dependent Enzyme deidrogenasi <ol><li> Per la cuvetta, aggiungere 1,3 ml di 50 mM pirofosfato di sodio (pH 8,8), 1,5 ml di 15 mM NAD (preparati al momento), e 0,1 ml di acqua. </li><li> Posizionare la cuvetta in uno spettrofotometro UV / Vis (cioè Evolut ThermoScientificion 260 Bio e Thermo Spectronic Genesys 20) impostato su una lunghezza d&#39;onda di 340 nm. </li><li> Azzerare lo spettrometro, e quindi aggiungere 0,1 mL di etanolo. Mescolare i reagenti pipettando gentilmente la soluzione su e giù per 5 volte. Per un vuoto, usare 0,1 mL di acqua addizionale, invece del 0,1 mL di etanolo. </li><li> Registrare l&#39;assorbanza a 340 nm a 5 minuti dopo i reagenti sono stati aggiunti alla cuvetta e 20 minuti dopo. Tracciare i due punti di dati per ottenere una pendenza che può essere utilizzato per i calcoli di attività. </li></ol> 4. Saggio di immobilizzati PQQ-dipendenti deidrogenasi <ol><li> Per la cuvetta, aggiungere 1,5 ml di fosfato di sodio (pH 7,3) e 200 pl di 600 uM PMS. </li><li> Posizionare la cuvetta in uno spettrofotometro UV / Vis impostato a una lunghezza d&#39;onda di 600 nm e quindi azzerare il spettrometro. </li><li> Aggiungere 100 pl di 700 microlitri DCIP e 200 pl del substrato di interesse (etanolo, acetaldeide, glicerolo, glucosio, o gliceraldeide), e miscelare i reagenti pipettando gentilmente la soluzion su e giù per 5 volte. Per un vuoto, usare 200 pl di acqua invece del substrato di interesse. </li><li> Registrare l&#39;assorbanza a 600 nm a 5 minuti dopo i reagenti sono stati aggiunti alla cuvetta e 20 minuti dopo. </li></ol> 5. Saggio di glucosio ossidasi immobilizzato <ol><li> Per la cuvetta, aggiungere 2,0 ml di una soluzione contenente 0,2 M p-idrossibenzoico, sodio azide 0,02% (w / v), 128 U perossidasi, 0,3 mM di 4-amminoantipirina, 1 M di fosfato di potassio, e 50 mM di glucosio. Miscelare la soluzione pipettando su e giù 5 volte. </li><li> Posizionare la cuvetta in uno UV / Vis set spettrofotometro ad una lunghezza d&#39;onda di 510 nm. </li><li> Registrare l&#39;assorbanza a 510 nm a 5 minuti dopo i reagenti sono stati aggiunti alla cuvetta e di nuovo a 20 minuti dopo. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi La struttura micellare del polimero Nafion modificata può essere interrotto con l&#39;essiccazione del sale originale / co-polimero fuso film troppo fast. Figura 2 mostra un sale / polimero miscela che è stata essiccata correttamente conseguente pellicola trasparente, marrone chiaro. Un film che asciuga troppo velocemente può provocare opachi, bianchi fiocchi di polimero a causa del fatto che il processo di asciugatura può distruggere la struttura micellare. Una volta che il polimero modificato Nafion e enzima sono stati miscelati e co-espressi sul fondo di una cuvetta, saggi di attività enzimatica può essere utilizzato per valutare la stabilità dell&#39;enzima all&#39;interno del film polimerico. Tabelle 2-4 mostrano i risultati del dosaggio dei due enzimi deidrogenasi e glucosio ossidasi immobilizzata in vari film Nafion modificati, rispettivamente. Nota la maggiore attività degli enzimi che sono immobilizzati contro gli enzimi in soluzione tampone, mostrando che i polimeri modificati Nafion può migliorare l&#39;attività di certi enzimi (chiamati superactivity). Altri enzimi hanno limitazioni di trasporto che riducono la loro attività specifica quando li immobilizzare il polimero (amilasi e cellulasi ad esempio, i cui substrati sono macromolecole piuttosto grandi). <table border="1"><tbody><tr><td> Sale di ammonio quaternario utilizzata </td><td> 3 volte più elevato </td></tr><tr><td> T3A (bromuro di tetrapropilammonio) </td><td> 32,37 mg / ml </td></tr><tr><td> TBAB (bromuro di tetrabutilammonio) </td><td> 39,19 mg / ml </td></tr><tr><td> TPAB (bromuro tetrapentilammonio) </td><td> 46,01 mg / ml </td></tr><tr><td> TEHA (bromuro triethylhexylammonium) </td><td> 32,37 mg / ml </td></tr><tr><td> TMHA (bromuro trimethylhexylammonium) </td><td> 27,25 mg / ml </td></tr><tr><td> TMOA (bromuro trimethyloctylammonium) </td><td> 30,66 mg / ml </td></tr><tr><td> TMDA (bromuro trimethyldecylammonium) </td><td> 34,07 mg / ml </td></tr><tr><td> TMDDA (bromuro trimethyldodecylammonium) </td><td> 37,48 mg / ml </td></tr><tr><td> TMTDA (bromuro trimethyltetradecylammonium) </td><td&gt; 40,89 mg / ml </td></tr><tr><td> TMHDA (bromuro trimetilesadecilammonio) </td><td> 44,31 mg / ml </td></tr><tr><td> TMODA (bromuro trimetilesadecilammonio) </td><td> 47,71 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Importi di tetra-alchil sali di ammonio da utilizzare per Nafion polimero modifica. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di Nafion </td><td> L&#39;attività enzimatica (U / g) </td></tr><tr><td> Buffer (no polimero) </td><td> 16,63 ± 8,11 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 9,25 ± 2,21 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 3,23 ± 2,92 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 3,93 ± 3,33 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 4,19 ± 1,04 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 3,51 ± 1,11 </td></tr><tr><td> TMDA </td><td> 8,00 ± 4,53 </td></tr><tr><td> TMHA </td><td> 1,68 ± 1,39 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 4,83 ± 0,99 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 10,45 ± 3,20 </td></tr></tbody></table> Tabella 2 NAD-dipendente attività glucosio deidrogenasi immobilizzato in Nafion selezionati polimeri modificati (nota: attività immobilizzata è una funzione iniziale di attività specifica dell&#39;enzima).. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di Nafion </td><td> L&#39;attività enzimatica (mU / g) </td></tr><tr><td> Buffer (no polimero) </td><td> 7,18 ± 0,51 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 70,1 ± 0,5 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 133 ± 6 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 244 ± 4 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 221 ± 6 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 1,78 ± 0,63 </td></tr><tr><td> TMDA </td><td> 206 ±5 </td></tr><tr><td> TEHA </td><td> 40,1 ± 50,6 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 0 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 1,45 ± 0,06 </td></tr></tbody></table> Tabella 3 PQQ dipendente dalla attività glucosio deidrogenasi immobilizzato in Nafion selezionati polimeri modificati (nota: attività immobilizzata è una funzione iniziale di attività specifica dell&#39;enzima).. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di Nafion </td><td> L&#39;attività enzimatica (U / g) </td></tr><tr><td> Buffer (no polimero) </td><td> 103,61 ± 3,15 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 19,93 ± 10,10 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 247,25 ± 12,49 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 152,27 ± 5,29 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 262,05 ± 6,26 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 129,18 ± 2,31 </td></tr&gt; <tr><td> TMDA </td><td> 141,23 ± 1,97 </td></tr><tr><td> TMHA </td><td> 131,75 ± 2,89 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 132,50 ± 1,18 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 136,50 ± 0,96 </td></tr></tbody></table> . Rappresentativa Tabella 4 attività specifica glucosio ossidasi immobilizzata in Nafion selezionati polimeri modificati (nota: attività immobilizzata è una funzione iniziale di attività specifica dell&#39;enzima). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di incorporazione TBAB Nafion in polimero e il successivo utilizzo in immobilizzazione degli enzimi. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografia ottica di un primo atto co-cast film di Nafion e TBAB. Lenta asciugatura produce un pellicola trasparente, marrone chiaro copre la bottom del vassoio di pesatura.

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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Nel procedimento descritto, tetra-alchil ammonio vengono utilizzati per modificare Nafion commerciale per creare micellari polimeri che possono essere utilizzati per immobilizzare e stabilizzare gli enzimi. I saggi descritti nella procedura mostrano che il polimero può essere utilizzato per immobilizzare un&#39;ampia varietà di enzimi con un&#39;elevata ritenzione di attività. Se l&#39;enzima di interesse ha una attività molto bassa o è impuro, una più alta concentrazione può essere richiesta e non devono inficiare il p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Nafion </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 70160 </td></tr><tr><td> Tetra alchilammonio bromuro di sali </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Alcool deidrogenasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3263 </td></tr><tr><td> Nicotinammide adenin dinucleotide (NAD) </td><td> SIGMA-Aldrich </td><td> N7004 </td></tr><tr><td> Pirofosfato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8010 </td></tr><tr><td> Fenazina metosolfato (PMS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9625 </td></tr><tr><td> 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) </td><td> SigMA-Aldrich </td><td> D1878 </td></tr><tr><td> Glucosio ossidasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7141 </td></tr><tr><td> 4-idrossibenzoico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 240141 </td></tr><tr><td> Sodio azide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8032 </td></tr><tr><td> Perossidasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8375 </td></tr><tr><td> 4-aminoantipirina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 06800 </td></tr><tr><td> UV / Vis Spettrofotometro </td><td> Thermo </td><td> Evolution 260 Bio o Spectronic Genesys 20 </td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bilancia analitica </td><td></td><td></td></tr></tbody></taBLE&gt;

idrofobo salt-modificato nafion per l&#39;immobilizzazione degli enzimi e la stabilizzazione

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Negli ultimi dieci anni, c&#39;è stata una ricchezza di domanda di enzimi immobilizzati e stabilizzati tra biocatalisi, biosensori, e le cellule di biocarburanti. 1-3 In maggior parte delle applicazioni bioelectrochemical, enzimi o organuli sono immobilizzati su una superficie dell&#39;elettrodo con l&#39;utilizzo di un certo tipo di matrice polimerica. Questa impalcatura polimero dovrebbe tenere gli enzimi stabile e consentire la facile diffusione delle molecole e ioni in e fuori dalla matrice. La maggior parte dei polimeri utilizzati per questo tipo di immobilizzazione sono basati su poliammine o polialcoli - polimeri che imitano l&#39;ambiente naturale degli enzimi che incapsulano e stabilizzare l&#39;enzima mediante idrogeno o legame ionico. Un altro metodo per stabilizzare gli enzimi comporta l&#39;uso di micelle, che contengono regioni idrofobiche che può incapsulare e stabilizzare gli enzimi. 4,5 In particolare, il gruppo Minteer ha sviluppato un polimero basato su micellare Nafion commercialmente disponibili. 6,7 Nafionsi è un polimero che permette micellare del canale assistita diffusione di protoni e altri cationi piccoli, ma le micelle e canali sono estremamente piccoli e il polimero è molto acido solfonico dovuto catene laterali acide, il che è sfavorevole per l&#39;immobilizzazione degli enzimi. Tuttavia, quando Nafion viene miscelato con un eccesso di idrofobi sali di alchilammonio quali tetrabutilammonio bromuro (TBAB), i cationi di ammonio quaternario sostituire i protoni e gli ioni diventano contatore ai gruppi solfonato sulle catene laterali polimeriche (Figura 1). Questo crea delle micelle e canali all&#39;interno del polimero che consentono la diffusione di grandi substrati e ioni che sono necessari per la funzione enzimatica come nicotinammide adenin dinucleotide (NAD). Questo polimero Nafion modificato è stato usato per immobilizzare vari tipi di enzimi e mitocondri per l&#39;uso in biosensori e cellule biocarburanti. 8-12 Questo documento descrive una nuova procedura per effettuare questo microfonoellar membrana polimerica immobilizzazione degli enzimi in grado di stabilizzare gli enzimi. La sintesi della membrana micellare immobilizzazione dell&#39;enzima, la procedura per immobilizzare gli enzimi all&#39;interno della membrana, e saggi per studiare le attività enzimatica specifica dell&#39;enzima immobilizzato sono riportate di seguito.

Questo articolo descrive la procedura di sintesi di un enzima modificato in modo idrofobo membrana Nafion immobilizzazione e come immobilizzare proteine ​​e / o enzimi all&#39;interno della membrana e verificare la loro attività specifica.

Idrofobo Salt-modificato Nafion per l&#39;immobilizzazione degli enzimi e la stabilizzazione

Nell'ultimo decennio, si è riscontrata una vasta gamma di applicazioni per gli enzimi immobilizzati e stabilizzati, tra cui la biocatalisi, i biosensori e i biocarburanti...

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare un polimero micellare per l'immobilizzazione e la stabilizzazione di enzimi. Per realizzare questo obiettivo, innanzitutto mescolare la sospensione di neon con il sale bromuro di ciale ammonio e vortexare la miscela al fine di scambiare la forma protonata di nafion con sali di ammonio. Il secondo passaggio consiste nell'essiccare il polimero ottenuto versando la miscela in una barchetta per evaporazione e lasciando evaporare i solventi.Successivamente, immergere il polimero in acqua deionizzata per 12-24 ore per rimuovere il sale in eccesso. Dopo l'estrazione del sale, risciacquare il polimero con acqua e quindi lasciarlo asciugare completamente per evaporazione. L'ultimo passaggio consiste nel trasferire il polimero in un vial pulito e risospendere il polimero in un solvente per l'utilizzo nell'immobilizzazione enzimatica. Alla fine, questo polimero per l'immobilizzazione enzimatica viene utilizzato per migliorare la stabilità degli enzimi nei saggi di attività.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché la procedura sembra estremamente semplice, ma il processo di essiccazione è fondamentale per la fabbricazione di un polimero funzionale. A dimostrare la procedura sarà Shu, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare la procedura di modifica del nafion con sali di ammonio di Nerium, misurare un eccesso molare triplo rispetto ai gruppi acidi solfonici presenti sul polimero di nafion, utilizzando il sale di bromuro di alchilammonio.Trasferire il sale di bromuro di alchilammonio in un vial di vetro energeticamente. Agitare un flacone di sospensione al 5% peso in volume di nafion per circa 30 secondi per assicurare una sospensione uniforme del nafion in soluzione. Pipettare due millilitri del nafion ora risospeso e aggiungerli al vial di vetro contenente il sale di bromuro di ammonio AGU.Vortexare il vial a 900 giri/min per 10-15 minuti. Successivamente, versare la soluzione viscosa in un contenitore di pesatura in plastica e utilizzare una pipetta per trasferire qualsiasi soluzione residua dal vial al contenitore di pesatura. In questo esempio, il contenitore viene parzialmente coperto e lasciato sul banco del laboratorio per permettere ai solventi di evaporare completamente dal contenitore di pesatura a un tasso di evaporazione che richiede più di sei ore.L'evaporazione completa di tutto il solvente al giusto tasso di evaporazione dovrebbe lasciare un film trasparente giallo o marrone sul fondo della capsula di pesata, come mostrato qui. Se il solvente evapora troppo rapidamente, si formerà un materiale crostoso o cristallino invece di un film trasparente, indicando che la struttura micellare del polimero è stata distrutta. Se l'evaporazione del solvente è troppo lenta o se il sale di ammonio reagisce per troppo tempo assorbendo troppa umidità, si formerà un gel arancione appiccicoso o un materiale cristallino bianco.In entrambi i casi, la procedura deve essere riavviata. Dopo che tutto il solvente è evaporato al tasso di evaporazione appropriato, riempire il vassoio di pesatura con 10-20 millilitri di acqua deionizzata da 18 megaohm per centimetro, coprire e lasciare in ammollo per 12-24 ore per rimuovere i sali in eccesso di bromuro di alchilammonio e HBr. Dopo 12-24 ore, pipettare l'acqua e aggiungere acqua deionizzata in quantità sufficiente a riempire il vassoio. Prestare attenzione a pipettare sempre allontanandosi dal film polimerico per evitare di perderne parte.Sciacquare complessivamente per tre volte dopo gli sciacqui. Lasciare il vassoio di pesatura scoperto fino a quando il polimero non sarà completamente asciutto. Quando sarà completamente asciutto, il polimero dovrà essere un film plastico trasparente e leggermente fragile.Al contrario, i polimeri che non sono stati essiccati correttamente avranno un aspetto molto diverso dopo l'estrazione del sale, come mostrato qui. Utilizzando una spatola, rimuovere con attenzione il film essiccato dal vassoio della bilancia e trasferirlo in un vial di vetro pulito. Aggiungere due millilitri di etanolo e tre sfere ceramiche per la miscelazione e sottoporre a vortex per quattro ore o fino a quando il film polimerico non è completamente risospeso.La soluzione modificata con ammonio alchilico è ora pronta per essere utilizzata nell'immobilizzazione enzimatica. Se l'enzima da immobilizzare è un enzima secco, pesare un milligrammo di enzima in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere un millilitro di tampone fosfato a cento millimoli e pH 7 per ottenere una soluzione enzimatica da un milligrammo per millilitro. Trasferire 120 microlitri della soluzione enzimatica da un milligrammo per millilitro in un nuovo tubo.Aggiungere 60 microlitri della soluzione di nafion modificato con ammonio ALK e vortexare per 10 secondi. Il rapporto tra enzima e soluzione polimerica deve essere mantenuto di due a uno, qualora questa miscela debba essere aumentata per un elevato numero di repliche. Infine, pipettare 60 microlitri della soluzione enzima-polimero sul fondo di ciascuna delle tre cuvette separate da un centimetro quadrato e lasciarle asciugare tutta la notte.La stabilità dell'enzima all'interno del film polimerico può quindi essere valutata mediante saggi di attività enzimatica come dimostrato. Per iniziare questo saggio, aggiungere i seguenti reagenti nel tubo a saggio rivestito con il polimero nafion modificato e l'enzima deidrogenasi dipendente da NAD: 1,3 millilitri di pirofosfato di sodio 50 millimolare, 1,5 millilitri di nicotinamide adenina dinucleotide 15 millimolare appena preparata o NAD e 0,1 millilitri di acqua.Posizionare il vial in uno spettrofotometro UV-visibile impostato alla lunghezza d'onda di 340 nanometri. Aggiungere 0,1 millilitri di etanolo nel vial e mescolare i reagenti pipettando delicatamente la soluzione su e giù per cinque volte; per il bianco, utilizzare 0,1 millilitri di acqua aggiuntiva al posto di 0,1 millilitri di etanolo. Cinque minuti dopo l'aggiunta dei reagenti al vial, registrare l'assorbanza a 340 nanometri.Registrare nuovamente l'assorbanza 20 minuti dopo l'aggiunta dei reagenti al matraccio tarato; questi due punti dati verranno riportati su un grafico per ottenere una pendenza utilizzabile nei calcoli dell'attività per determinare l'attività enzimatica specifica della pq immobilizzata. Pipettare questi reagenti nel matraccio tarato contenente il polimero di nafion modificato e la deidrogenasi dipendente da PQQ. 1,5 millilitri di fosfato di sodio e 200 microlitri di solfato di fenazina metile (PMS) a 600 micromolare.Posizionare il vete in uno spettrofotometro UV-visibile impostato alla lunghezza d'onda di 600 nanometri e azzerare lo strumento. Aggiungere 100 microlitri di una miscela composta da 700 microlitri di cloruro di endemolo o DCIP e 200 microlitri del substrato di interesse. Mescolare i reagenti pipettando delicatamente la soluzione su e giù per cinque volte per ottenere un bianco.Utilizzare 200 microlitri di acqua al posto del substrato di interesse. Cinque minuti dopo l'aggiunta dei reagenti, registrare l'assorbanza a 600 nanometri.Registrare nuovamente l'assorbanza 20 minuti dopo l'aggiunta dei reagenti per iniziare il saggio. Aggiungere al Q VET co-capolato con il polimero di nafion modificato e glucosio ossidasi. Due millilitri di una soluzione contenente i seguenti componenti: acido para-idrossibenzoico 0,2 molare, azoturo di sodio 0,02%, perossidasi 128 unità, 4-amminoantipirina 0,3 millimolare, fosfato di potassio uno molare e glucosio 50 millimolari.Mescolare la soluzione aspirando e dispensando cinque volte con la pipetta. Posizionare la provetta Q in uno spettrofotometro UV-visibile impostato alla lunghezza d'onda di 510 nanometri. Cinque minuti dopo l'aggiunta dei reagenti alla provetta qve.Registrare l'assorbanza a 510 nanometri. Successivamente, registrare nuovamente l'assorbanza a 20 minuti dall'aggiunta dei reagenti. Questa tabella mostra i risultati del saggio dell'attività della glucosio deidrogenasi dipendente da NAD immobilizzata e di polimeri di nafion modificati selezionati.È stato osservato che la glucosio deidrogenasi dipendente dal NAD immobilizzata presentava un'attività specifica inferiore rispetto all'enzima in soluzione tampone. Ciò è dovuto al fatto che le membrane polimeriche riducono il trasporto di molecole grandi; sebbene il glucosio, il substrato per il saggio, sia di piccole dimensioni, il coenzima NAD deve diffondere all'interno e all'esterno della membrana. Per la deidrogenasi dipendente dal NAD, la limitazione al trasporto causata dall'immobilizzazione nel polimero riduce l'attività enzimatica osservata.La tabella successiva mostra i risultati dei saggi sull'attività della deidrogenasi del glucosio dipendente da PQQ immobilizzata su diversi polimeri di nafion modificati. È importante osservare qui l'attività maggiore degli enzimi immobilizzati sulla maggior parte dei film di nafion rispetto agli enzimi in soluzione tampone. Poiché la deidrogenasi del glucosio dipendente da PQQ è una proteina associata alla membrana, il nafion modificato idrofobico fornisce un ambiente simile alla membrana, più idoneo del tampone a stabilizzare l'enzima attivo dipendente da PQQ, aumentandone così l'attività.Infine, i risultati rappresentativi del saggio sull'attività specifica della glucosio ossidasi. Nel presente tavolo sono riportati i polimeri di nafion immobilizzati e modificati selezionati. I saggi enzimatici effettuati per ciascun polimero con ciascuno dei tre enzimi mostrano che le tendenze nell'attività specifica relativa, rispetto all'enzima in soluzione, dipendono dal sistema enzimatico.Di conseguenza, il polimero esatto necessario per ciascun enzima deve essere ottimizzato. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il passaggio di essiccazione è cruciale per questa particolare procedura.

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