Name: Colorazione immunoistochimica di B7-H1 (PD-L1) in paraffina incorporate diapositive di tessuto pancreatico Adenocarcinoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Impara la colorazione immunoistochimica di B7-H1 (PD-L1) in sezioni di adenocarcinoma pancreatico incluso in paraffina. Questo metodo consente di visualizzare l'espressione proteica nel microambiente tumorale.

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EB, KMB, e HX contribuiscono allo stesso modo. Questo studio è stato sostenuto dal SPORE NCI in tumori gastrointestinali P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Fondazione Lustgarten, Viragh Foundation, Investigator Award ASCO giovane, NIH CA0090701 5T32-28 Training Grant, Sol Centro pancreatico Goldman Cancer, e della Fondazione Nazionale Pancreas.

B7-H1/PD-L1, un membro della famiglia B7-immune di regolamentazione proteine ​​di superficie cellulare, svolge un ruolo importante nella regolazione negativa di risposte immunitarie mediate da cellule attraverso la sua interazione con il suo recettore, morte programmata-1 (PD -1) 1,2. Sovraespressione di B7-H1 da cellule tumorali è stato osservato in un certo numero di tumori umani, compreso il melanoma, glioblastoma, e carcinomi del polmone, seno, colon, ovaio, e cellule renali, e ha dimostrato di alterare anti-tumorali T- cella immunità 3-8. Recentemente, B7-H1 espressione tessuti adenocarcinoma pancreatico è stato identificato come un potenziale marcatore prognostico 9,10. Inoltre, il blocco di B7-H1 in un modello murino di cancro pancreatico ha dimostrato di produrre una risposta antitumorale 11. Questi dati suggeriscono l&#39;importanza di B7-H1 come un potenziale bersaglio terapeutico. Anti-B7-H1 anticorpi bloccanti sono quindi in fase di sperimentazione in studi clinici per l&#39;uomo piùtumori solidi tra cui il melanoma e tumori del polmone, del colon, rene, stomaco e pancreas 12. Per essere successivamente in grado di identificare i pazienti che beneficeranno B7-H1 di targeting terapie, è fondamentale per indagare la correlazione tra espressione e la localizzazione delle B7-H1 e la risposta del paziente al trattamento con anticorpi B7-H1 blocco. Esaminando l&#39;espressione di B7-H1 in tessuti umani adenocarcinoma pancreatico attraverso immunoistochimica darà una migliore comprensione di come questa co-inibitrice molecola di segnalazione contribuisce alla soppressione dell&#39;immunità antitumorale in microambiente del tumore. L&#39;anticorpo anti-B7-H1 monoclonale (clone 5H1) sviluppato da Chen e colleghi ha dimostrato di produrre risultati affidabili in colorazione criosezioni di più tipi di tessuti neoplastici umani 4,8, ma macchie nei paraffinati diapositive era stata una sfida fino recentemente 13-18. Abbiamo sviluppato la B7-H1 stainiprotocollo ng per le diapositive incluse in paraffina di tessuti adenocarcinoma pancreatico. La B7-H1 protocollo di colorazione qui descritto produce coerente colorazione membranosa e citoplasmatica di B7-H1 con po &#39;di storia. 1. De-parafinization <ol><li> Bake scorre a 55 ° C per 20 min. </li><li> In una cappa chimica, immergere i vetrini in xilolo per 10 min. </li><li> Immergere i vetrini in xilene fresco per 10 minuti. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 min. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al fresco 100% per 5 min. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 5 min. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 80% per 5 min. </li><li> Immergere i vetrini in acqua deionizzata per 5 min. </li></ol> 2. Antigen Retrieval <ol><li> Immergere i vetrini in tampone Tris-EDTA (pH 9,0) e riscaldare in una pentola a pressione a 125 ° C per 30 sec, quindi 90 ° C per 10 sec. </li><li> Lasciare raffreddare i vetrini per 60 min. </li><li> Immergere i vetrini in TBST per 5 min; rEPEal doppio. </li></ol> 3. Colorazione <ol><li> Pulire soluzioni in tutto il tessuto nelle diapositive. Segnare un cerchio intorno al tessuto con una penna idrofobo. </li><li> Porre i vetrini in una camera umida ed evitare l&#39;essiccamento del tessuto sul vetrino durante tutto il processo di colorazione intero. Porre una goccia (circa 200 pl o più per coprire la zona di tessuto completamente) del blocco perossidasi all&#39;interno del cerchio idrofobico sul vetrino ed incubare i vetrini in blocco perossidasi per 5 min. </li><li> Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. </li><li> Porre una goccia di BLOCK ACE tampone di bloccaggio su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti. </li><li> Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. </li><li> Mettere una goccia di soluzione di avidina su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti. </li><li> Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. </li><li> Mettere una goccia di soluzione di biotina su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti. </li><li> Risciacquare slides con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. </li><li> Incubare vetrini con diluizione di 1:1000 topo anti-B7-H1 anticorpo monoclonale (clone 5H1) o un mouse IgG1 κ controllo isotipico in 200 microlitri TBST a 4 ° C per una notte per 22 ore + / - 1 h. La concentrazione finale di anticorpo in TBST è 2,57 mg / ml. </li><li> Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte. </li><li> Incubare vetrini con biotina coniugata ratto anti-topo IgG1 anticorpo secondario ad una concentrazione 1:500 (in 200 ul di soluzione al 2% di siero di capra) per 30 min. </li><li> Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte. </li><li> Una goccia di streptavidina-biotina Complex (deve essere preparata almeno 30 minuti prima dell&#39;uso) su ciascun vetrino e incubare per 15 min. </li><li> Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte. </li><li> Porre una goccia di reagente di amplificazione (diluito 2:1 con TBST) su ogni diapositiva e incubare per 4 min. </li><li> Sciacquare i vetrini con TBST, quindi posto in TBST per 5 min. Ripetere due volte. </li><li> Porre una goccia di streptavidina-HRP in ogni diapositiva e incubare per 15 minuti. </li><li> Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte. </li><li> Una goccia di 3,3-diaminobenzidina (DAB) e substrato cromogeno su ciascun vetrino e sviluppare il colore per 2 min. </li><li> Subito dopo lo sviluppo del colore, lavare i vetrini con DDH 2 O per 1-2 min. </li><li> Incubare vetrini con una goccia di ematossilina per 90 sec. </li><li> Lavare con DDH 2 O per 1-2 min. </li><li> Lavare con acqua corrente e sapone per 1-2 min. </li><li> Lavare con DDH 2 O per 1-2 min. </li></ol> 4. Disidratazione e montaggio <ol><li> Immergere i vetrini in etanolo al 80% per 3 min. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 3 min. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 min. Ripeti. </li><li> Immergere i vetrini in xilene per 5 min. Ripeti. </li><li> Aggiungere una goccia diCytoseal 60 a diapositiva e il luogo del coprioggetto. </li></ol> La Tabella 1 elenca i reagenti utilizzati nelle procedure sopra descritte.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Immunoistochimica del B7-H1 sulla criosezioni è stato riportato in studi precedenti per una varietà di tumori 3,4. Tuttavia, clinici campioni tumorali di solito sono disponibili solo in forma di paraffina-incastonati blocchi. L&#39;anticorpo monoclonale 5H1 è recentemente stato applicato con successo per la colorazione di tessuti inclusi in paraffina tumorali compresi carcinoma renale, carcinoma della cervice, carcinoma della vescica e melanoma 13-18. B7-H1 colorazione su inclusi in paraffina ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> CSA Sistema </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> Comprende i seguenti reagenti di cui al protocollo: blocco perossidasi, streptavidina-biotina complessi, reagenti di amplificazione, streptavidina-HRP, ed il substrato cromogeno DAB e </td></tr><tr><td> Avidina / biotina Blocco Kit </td><td> Vettore </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> Blocco ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> Biotina anti-topo IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> IgG1 di topo K Isotype controllo </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> TBS (Tris-salina tamponata), 10X </td><td> Cellgro </td><td> 46-012-CM </td><td> 10xTBS contiene 80 g / L di NaCl e 24,2 g / L Tirs; Diluito a 1X con ddH2O per lavaggi; </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1379 </td><td> 1 ml aggiunto a 1 L di 1X TBS per fare TBST </td></tr><tr><td> Target Retrieval, 20x </td><td> Celerus Onda </td><td> 014-3000-000 </td><td> Diluito a 1x con DDH 2 O </td></tr><tr><td> Alcool etilico 190 Proof </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> Alcool etilico 200 Proof </td><td> PHARMO-Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xilene </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina </td><td> Richard-Allan scientifico </td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Richard-Allan scientifico </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> Umidità camera </td><td> Sigma </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti e apparecchiature. </td></tr></tbody></table>

colorazione immunoistochimica di b7-h1 (pd-l1) in paraffina incorporate diapositive di tessuto pancreatico adenocarcinoma

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, un membro della famiglia B7-immune di regolamentazione proteine ​​di superficie cellulare, svolge un ruolo importante nella regolazione negativa di risposte immunitarie mediate da cellule attraverso la sua interazione con il suo recettore, morte programmata-1 (PD -1) 1,2. Sovraespressione di B7-H1 da cellule tumorali è stato osservato in un certo numero di tumori umani, compreso il melanoma, glioblastoma, e carcinomi del polmone, seno, colon, ovaio, e cellule renali, e ha dimostrato di alterare anti-tumorali T- cella immunità 3-8. Recentemente, B7-H1 espressione tessuti adenocarcinoma pancreatico è stato identificato come un potenziale marcatore prognostico 9,10. Inoltre, il blocco di B7-H1 in un modello murino di cancro pancreatico ha dimostrato di produrre una risposta antitumorale 11. Questi dati suggeriscono l&#39;importanza di B7-H1 come un potenziale bersaglio terapeutico. Anti-B7-H1 anticorpi bloccanti sono quindi in fase di sperimentazione in studi clinici per il mulgestire più tumori umani solidi tra cui il melanoma e tumori del polmone, del colon, rene, stomaco e pancreas 12. Per essere successivamente in grado di identificare i pazienti che beneficeranno B7-H1 di targeting terapie, è fondamentale per indagare la correlazione tra espressione e la localizzazione delle B7-H1 e la risposta del paziente al trattamento con anticorpi B7-H1 blocco. Esaminando l&#39;espressione di B7-H1 in tessuti umani adenocarcinoma pancreatico attraverso immunoistochimica darà una migliore comprensione di come questa co-inibitrice molecola di segnalazione contribuisce alla soppressione dell&#39;immunità antitumorale in microambiente del tumore. L&#39;anticorpo anti-B7-H1 monoclonale (clone 5H1) sviluppato da Chen e colleghi ha dimostrato di produrre risultati affidabili in colorazione criosezioni di più tipi di tessuti neoplastici umani 4,8, ma macchie nei paraffinati diapositive era stata una sfida fino recentemente 13-18. Abbiamo devfuggita la B7-H1 protocollo di colorazione per le diapositive incluse in paraffina di tessuti adenocarcinoma pancreatico. La B7-H1 protocollo di colorazione qui descritto produce coerente colorazione membranosa e citoplasmatica di B7-H1 con po &#39;di storia.

Un successo colorazione immunoistochimica di B7-H1 dimostrerà l&#39;espressione eterogenea di B7-H1 (marrone segnali di sviluppo di colore DAB) in adenocarcinoma pancreatico. Alcune cellule pancreatiche adenocarcinoma hanno espressione prevalentemente membranosa B7-H1 (Figura 1A), mentre altri hanno espressione sia prevalentemente citoplasmatica di B7-H1 o espressione poco B7-H1 (figure 2 e 3). Epitelio dotto pancreatico normale esprime poco B7-H1 (Figura 4). Colorazion...

B7-H1 (PD-L1) e il suo legame al PD-1 forniscono una maggiore tumore segnale indotto immunosoppressiva nel microambiente del tumore. Una tecnica di colorazione immunoistochimica per caratterizzare l&#39;espressione e la localizzazione di B7-H1 in adenocarcinoma pancreatico è descritto qui.

Colorazione immunoistochimica di B7-H1 (PD-L1) in paraffina incorporate diapositive di tessuto pancreatico Adenocarcinoma

B7-H1/PD-L1, un membro della famiglia B7 di proteine di superficie cellulare immunoregolatrici, svolge un ruolo importante nella regolazione negativa della risposta cellulo-mediata...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare tecniche di colorazione immunoistochimica per valutare l'espressione di B seven H one PD L one su sezioni di paraffina di tessuto di adenocarcinoma pancreatico umano. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo la paraffina e reidratando le sezioni di tessuto tagliate. Il secondo passaggio della procedura è il recupero dell'antigene, che prevede l'uso di una pentola a pressione per colorare il tessuto.Una procedura di colorazione con anticorpi è seguita da passaggi di amplificazione del segnale e sviluppo del colore con DAB. I passaggi finali consistono nella disidratazione e nel montaggio del tessuto. Una volta completato.La microscopia e l'analisi delle immagini possono essere utilizzate per visualizzare B sette H uno di membrana e citoplasmatica. Questo approccio può aiutare a rispondere a domande fondamentali nello studio di un carcinoma endocrino del pancreas, fornendo una comprensione più approfondita del modo in cui B sette uno BTL uno contribuisce alla soppressione dell'immunità anti-tumorale nel microambiente tumorale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colorazione su sezioni criostatiche, è che è stata ottimizzata per l'uso di sezioni di tessuto in paraffina, che sono spesso più facilmente disponibili e più agevolmente conservabili.La colorazione affidabile con anticorpi su vetrini non è possibile senza prima rimuovere la paraffina. Per preparare i vetrini con tessuti inclusi in paraffina, riscaldare innanzitutto i vetrini a 55 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, in una cappa chimica, si utilizza una serie di sette bagni chimici per rimuovere la paraffina: immergere dapprima i vetrini nel xilene per 10 minuti.Successivamente, immergere i vetrini in un secondo bagno di xilene fresco per 10 minuti. In terzo luogo, immergere i vetrini in etanolo al 100% per cinque minuti. In quarto luogo, immergere nuovamente i vetrini in etanolo fresco al 100% per cinque minuti.Quinto, immergere i vetrini in etanolo al 95% per cinque minuti. Sesto, immergere i vetrini in etanolo all'80% per cinque minuti. Infine, lavare i vetrini con acqua deionizzata per cinque minuti.Dopo aver rimosso la paraffina, è necessario esporre l'antigene. Immergere innanzitutto i vetrini nel tampone Tris EDTA. Riscaldare quindi i vetrini in un'autoclave con un programma a due passaggi.Prima, riscaldarli a 125 gradi Celsius per 30 secondi. Secondo, a 90 gradi Celsius per 10 secondi. Lasciare quindi i vetrini da parte a raffreddare fino alla temperatura ambiente.Dopo aver lasciato raffreddare i vetrini per un'ora, lavarli due volte con TBST, cinque minuti per ogni bagno. I vetrini possono ora essere colorati singolarmente. Iniziare asciugando delicatamente con un tampone la soluzione TBST intorno al tessuto, quindi tracciare un cerchio intorno al tessuto con una penna idrofobica.Durante tutta la procedura, evitare l'essiccazione del tessuto mantenendo i vetrini in una camera umidificata. Quando non vengono sottoposti a bagno, posizionare una goccia di blocco della perossidasi all'interno del cerchio idrofobo sul vetrino. Attendere cinque minuti e risciacquare via la perossidasi con TBST.Quindi immergere i vetrini in TBST per cinque minuti. Rimuovere i vetrini dalla soluzione e scuotere delicatamente per eliminare l'eccesso di TBST. Posizionare ora una goccia di buffer bloccante CE su ciascun vetrino e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.Pulire i vetrini con un risciacquo e un bagno di cinque minuti in TBST. Successivamente, applicare una goccia di soluzione Vidan su ogni vetrino e attendere 15 minuti. Rimuovere l'AVADON con lo stesso risciacquo e regime di bagno in TBST.Ora applicare la biotina. Attendere cinque minuti e lavare nuovamente i vetrini con TBST. Successivamente, incubare i vetrini con una diluizione di anticorpo monoclonale murino o con un anticorpo di controllo.In TBST, lasciare che l'anticorpo si coniughi a quattro gradi Celsius per 22 ore. Il giorno successivo, lavare i vetrini con TBST tre volte come in precedenza. Ogni lavaggio comprende un risciacquo A-T-B-S-T e un bagno di cinque minuti.Questo regime di lavaggio triplo viene ripetuto più volte successivamente durante la rimozione dell'anticorpo primario. Preparare la soluzione del complesso STR titina Bio ITIN. Deve essere preparata almeno 30 minuti prima dell'uso.Ora incubare i vetrini con l'anticorpo secondario di capra anti-US coniugato con biotina in soluzione di siero di capra per 30 minuti. Durante questa incubazione, seguire le istruzioni del kit DACO per preparare la soluzione cromogenica di substrato DAB. La soluzione può essere conservata a quattro gradi al buio per un massimo di otto ore.Dopo l'incubazione, eseguire il lavaggio triplo con TBST. Successivamente, aggiungere una goccia di complesso strippin biotina su ciascun vetrino, incubare i vetrini per 15 minuti e quindi lavarli tre volte con TBST.Successivamente, applicare una goccia di reagente di amplificazione su ogni vetrino. Attendere quattro minuti e lavare i vetrini tre volte con TBST. Dopo aver rimosso il reagente di amplificazione, aggiungere una goccia di streptavidina HRP su ogni vetrino e incubare per 15 minuti.Eseguire un ulteriore lavaggio triplo con TBST prima di proseguire. Ora segue il passaggio più delicato della procedura. Aggiungere una goccia di cromogeno del substrato DAB con perossido di idrogeno su un vetrino e iniziare a osservare lo sviluppo del colore, il substrato DAB.Il tempo di sviluppo del cromogeno è tipicamente di due minuti, ma monitoriamo regolarmente lo sviluppo al microscopio per garantire una colorazione ottimale. Con fondo minimo ad ogni ciclo di colorazione, includiamo un vetrino da un lotto precedente e un vetrino di tonsilla come controlli positivi. Al termine, lavare immediatamente il vetrino in acqua, non in TBST.Incubare il vetrino con una goccia di ematina per 90 secondi. Lavare immediatamente il vetrino con acqua distillata deionizzata, seguita da acqua di rubinetto con sapone e quindi da ulteriore acqua DD. Questo completa la procedura di colorazione.Dopo aver colorato tutti i vetrini, utilizzare una serie di etanolo per disidratarli prima del montaggio. Primo, immergere i vetrini in etanolo al 80% per tre minuti. Secondo, immergere i vetrini in etanolo al 95% per tre minuti.Per il terzo e il quarto bagno, immergere i vetrini in etanolo al 100% per cinque minuti. Per il quinto e il sesto, immergere i vetrini in xilene per cinque minuti. Infine, aggiungere una goccia per ogni campione su ciascun vetrino e applicare delicatamente un coprioggetti.I vetrini sono ora pronti per la colorazione immunohistochimica al microscopio con B seven H one, che ha dimostrato un'espressione eterogenea di B seven H one nel carcinoma adenocarcinoma del pancreas. Essi appaiono marroni con lo sviluppo del colore DAB. Alcune cellule del carcinoma adenocarcinoma del pancreas mostrano un'espressione prevalentemente membranosa di B seven H one, mentre altre presentano un'espressione prevalentemente citoplasmatica di B seven H one oppure una scarsa espressione di B seven H one. L'epitelio duttale pancreatico normale ha mostrato una debole colorazione per B seven H one. L'uso di un anticorpo di controllo isotopico IgG1 kappa di topo al posto dell'anticorpo anti B seven H one ha prodotto una colorazione di fondo molto ridotta. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in sette ore, distribuite in due giorni con un'incubazione notturna di 22 ore, se eseguita correttamente dopo questo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare il segnale B sette H uno PD L uno in altre neoplasie.

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