Name: Non plasmatici Incollaggio di PDMS Economico per la Fabbricazione di dispositivi microfluidici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:41:54.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Impara un metodo economico per l'incollaggio reversibile di dispositivi microfluidici al vetro senza plasma, usando forze elettrostatiche tra PDMS e vetro. Questa tecnica garantisce una tenuta stagna ideale per colture cellulari.

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Preparazione dei dispositivi Microfluidic per colture cellulari Neuron 1) Pulire Corning No.1 24 mm X 40 diapositive mm di vetro <ul><li> Sonicare i vetrini in un sonicatore bagnomaria per 30 minuti </li><li> Sciacquare i vetrini con il 70% EtOH </li><li> Lavare i vetrini tre volte con dH 2 O </li><li> Diapositive a secco in una cappa di coltura per alcune ore, preferibilmente durante la notte </li></ul> Nota: Abbiamo vassoi di metallo speciale che si carica con le diapositive. I vetrini sono separati individualmente e messi in slot in questo rack di metallo. Possiamo quindi posizionare questi vassoi di metallo di carico in un piatto di vetro che si riempiono di acqua, posto nel bagno sonicatore acqua e ultrasuoni per 30 minuti. Lavaggi successivi si svolgono in questo piatto. 2) Preparazione dei dispositivi PDMS <ul><li> Tagliare lo stampo PDMS dal wafer di silicio, buchi nel cast PDSM e quarto lo </li><li> Pulire i dispositivi di PDMS in primo luogo che soffia gas inerte (argon o azoto) attraverso di loro. Quindi utilizzare Marca 3M Scotch 471 nastro per sollevare i detriti rimanenti </li></ul> Nota: è importante mantenere i dispositivi a faccia in su. Inizialmente, quando abbiamo tagliato il PDMS lontano dal wafer di silicio, lato a contatto con l&#39;ostia è il lato pulito: contiene i canali microfluidica. Cerchiamo di essere attenti come siamo in grado di non danneggiare il dispositivo, e mantenere la faccia pulita verso l&#39;alto finché non siamo pronti per l&#39;incollaggio di plasma. <ul><li> Dispositivi di autoclave in contenitori di plastica </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave, pulita n. 1 vetrini Corning e plasma-treat dispositivi utilizzando un detergente marchio Harrick plasma, <a href="http://www.harrickplasma.com/" target="_blank">www.harrickplasma.com</a> </li><li> Posizionare i dispositivi puliti lato negativo sul vetrino. </li></ul> Il dispositivo è ora al plasma legato al vetrino. 3) Rivestimento Periferiche con poli L-lisina (PLL) <ul><li> PLL è aggiunto a un bene su ogni lato del dispositivo e ha permesso di fluire attraverso nel pozzo prossimo </li></ul> =&gt; 150 ml di PLL per i pozzi di grandi dimensioni e 30 μ l PLL per i pozzi più piccoli. Non ha, per l&#39;esattezza fino a quando i pozzi sono pieni. Nota: Se si guarda un dispositivo vedrete 4 pozzi: ogni due sono collegati. Volete mettere il PLL in un pozzo in modo che il flusso attraverso il dispositivo nel pozzo successivo. <ul><li> Lasciare che il PLL a fluire attraverso il dispositivo per circa 10 minuti e poi aggiungere più PLL per i pozzi di riempirle </li><li> Posizionare i dispositivi contenenti PLL in un incubatore a 37 ° C per un minimo di 4 ore (durante la notte è preferibile) </li><li> Vuoto fuori l&#39;eccesso PLL dopo il trattamento, ma attenzione a non aspirare tutto il liquido dal dispositivo </li></ul> Nota: Se non si desidera introdurre bolle d&#39;aria ai canali o da camera. Solo il vuoto in eccesso PLL nei pozzetti. <ul><li> Aggiungi autoclave dH 2 O ad ogni bene su entrambi i lati del dispositivo, e permette di scorrere alla ben altro per azione capillare </li></ul> La figura 1 è un diagramma di un dispositivo a microfluidi. Notate come il Blue (Soma lato) è collegata e il Rosso (lato assonale) sono collegati. Quando si dice mettere il PLL, o l&#39;acqua o del supporto, su un bene su ogni lato del dispositivo, che cosa si intende, ad esempio, è: Place 150 ul di autoclave dH 2 O in un blu Ebbene posto 150 ml di dH autoclavato 2 0 in un unico Rosso Bene. L&#39;acqua (o PLL, o Media o Celle) fluirà attraverso il dispositivo alla ben altri corrispondenti. <img src="/files/ftp_upload/old/410_2008_8_27_3/410_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="362" height="216" /> Figura 1 Nota: Si prega di notare che, d&#39;ora in poi, quando dico &quot;media luogo, le cellule, l&#39;acqua o PLL nella TOP pozzi&quot;, mi riferisco allo schema di sopra, dove il Soma sarebbe a sinistra e gli assoni crescerà al a destra. <ul><li> Aspirare l&#39;acqua (ancora una volta facendo attenzione a non rimuovere completamente tutto il liquido dal dispositivo), quindi aggiungere altri 150 ml di autoclave dH 2 O a uno dei collegati ogni bene e permettono di fluire attraverso i corrispondenti bene. </li><li> Posizionare il dispositivo contenente dH 2 O in un incubatore a 37 ° C per 1 ora, quindi ripetere la fase di lavaggio di nuovo. Lavare i dispositivi di tre volte con dH 2 O per un&#39;ora ciascuno, che è il totale. </li></ul> Nota: A causa della possibilità che borato dal PLL in grado di assorbire in PDMS, alcuni nel laboratorio di Jeon consigliamo incubando i dispositivi di una notte con autoclave dH 2 O dopo un paio di initial risciacqui veloce. Questo farà sì che tutte le borato libero arbitrio leach fuori del PDMS prima del carico delle cellule. Se questo non viene fatto, ci può essere un rilascio di borato nei media nel corso del tempo, che potrebbe portare a citotossicità. <ul><li> Aggiungi neurali media basale (NBM) con i fattori necessari (glutamax, B27, PenStrep) per i pozzi in alto </li></ul> Nota: I dispositivi possono essere incubato per una notte e placcato con le cellule il giorno dopo, o incubate un minimo di 3 ore con NMB fattori + prima placcatura le cellule. Preparare i neuroni da caricare nel Dispositivi Utilizziamo 18 giorni corteccia vecchio ratto fetale che ci sia acquistare da una società denominata Bit cervello o che è preparato qui nel campus per noi. Noi preferiamo per ottenere il tessuto fresco. <ol><li> Ottenere 1 corteccia cerebrale del feto (2 pezzi di tessuto) conservati in Hibernate E </li><li> Prendete 3 pipette di vetro lunghe e fuoco ogni loro in dimensioni sempre più piccoli utilizzando una lampada ad alcool </li><li> rimuovere i tessuti da Hibernate E con una pipetta di vetro e posto in 2 ml di NMB Fattori + in un tubo sterile 15 ml. </li><li> Triturazione: Usando una pipetta di vetro a bulbo e la corteccia viene passato su e giù per circa 5 a 10 volte. Poi, la pipetta prossimo più piccolo viene usato per pipetta su e giù per il tessuto. Infine, la più piccola pipetta viene usato per pipetta su e giù per il tessuto. Ci piace fare in modo che non ci siano pezzi visibili. Nota: Recentemente, il Laboratorio Jeon ha iniziato a confronto le cellule dal tessuto conservati in Hibernate e alle cellule che sono stati preparati da tessuto inizialmente trattati con tripsina 0,125% nel 50% Ca + + libero e Mg + + libero buffer di dissezione. Il consenso è che il tessuto preparato con tripsina resa cellule più vitali rispetto al tessuto messo inizialmente in Hibernate E. Se non si ha intenzione di utilizzare il tessuto subito, allora avete bisogno di conservare il tessuto in Hibernate E. Se avete intenzione di utilizzare il tessuto subito e vorrei vitalità maggiore, poi trattare il tessuto con tripsina prima della triturazione meccanica come segue: 1) diluire 1 ml 0,25% tripsina (Gibco, Invitrogen) con 1 ml di Ca + + libero Mg + + gratis buffer di dissezione (finale tripsina = 0,125%) in una provetta da 15 ml (mantenere freddo ghiaccio), 2) tessuto posto nel buffer e incubare immediatamente a 37 ° C per 8 minuti, 3) aggiungere 10 ml DMEM/10% FBS per fermare il tripsina reazione e continuare il protocollo di seguito. </li><li> Cellule Centrifugare a 1100 rpm per 1 minuto </li><li> Mezzi di comunicazione aspirato accuratamente fuori il pellet </li><li> Aggiungere 1 ml di NMB fattori + al pellet e ri-sospesa pipettando su e giù </li><li> Passare il risospese cellule flusso per gravità attraverso un filtro per eliminare eventuali grumi (BD Falcon cellula filtro di nylon 40 um) </li><li> Conte e la piastra di cellule: <ul><li> In una provetta per microcentrifuga, aggiungere 60 microlitri NMB + fattori, 20 l di sospensione cellulare, e 20 ml di blu tripano poi mescolare </li><li> Aggiungere circa 10 ml di questa soluzione in un emocitometro e contare le cellule vive (non blu) </li><li> Regolare la concentrazione di 2,5-4,5 x10 6 cellule / ml Nota: In genere ottiene una concentrazione di circa 2,5-4,5 x 106 cellule / ml. a seconda del volume le cellule sono risospese in (di solito da 1 ml + B27/Glutamax/PenStrep percortex NBM). Se il tessuto è stato preparato con tripsina, la resa sarà probabilmente aumentato. </li></ul></li></ol> La placcatura Dispositivi <ol><li> Celle di carico (neuroni primari) in un pozzetto del dispositivo </li><li> Tavola 5 microlitri per dispositivo piccolo e 20 l per dispositivo grande Nota: è possibile carico 10 l di cellule sulla parte superiore del dispositivo e 10 microlitri sul fondo del dispositivo (la metà del volume totale), oppure direttamente tutti i 20 l di cellule nel ben superiore cromosomiche (5 microlitri nel cromosomiche alto ben per i dispositivi di piccole dimensioni). </li><li> Incubare per 10 minuti a 37 ° C in modo da incubatore cellule possono cominciare a collegare </li><li> Aggiungi microlitri circa 150/30 di fattori + NMB in ciascun pozzetto a seconda delle dimensioni dispositivo Nota: I volumi possono variare a seconda dello spessore del PDMS. Tutto ciò che importa è che i pozzi sono pieni. </li></ol> Supplementare Uso le periferiche senza Plasma Incollaggio Senza il trattamento al plasma, Christina Tu, un tecnico, che lo fa con successo ogni settimana senza plasma, dice a caricare solo le cellule subito. Ricordarsi di rimuovere il supporto da entrambi i pozzetti sul lato soma (lato assone non importa se si lascia la media). E &#39;il flusso del fluido che permette alle cellule di entrare nel canale principale. Se si dispone di mezzi di comunicazione nei pozzi, non sarà possibile ottenere il flusso del fluido.

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Qui abbiamo dimostrato come utilizzare il dispositivo a microfluidi neurone senza bisogno di un pulitore di plasma. Ci riferiamo a questo legame che non plasmatici.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Reagente</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 con agente indurente. Si prega di consultare Dow Corning per trovare un fornitore nelle vicinanze</td></tr><tr><td>Cornig No. 1 Cover Glass</td><td>Cover Glass</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Disponibile tramite Fisher Scientific, numero di catalogo Fish 12-531D</td></tr><tr><td>B27</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 è un supplemento proprietario disponibile tramite Invitrogen nella loro linea Gibco di reagenti per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax è disponibile tramite Invitrogen nella loro linea Gibco di reagenti per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Piatto di Petri da 60 mm</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>I piatti di Petri sterili in polistirene da 60 mm vengono utilizzati per alloggiare il dispositivo fissato al vetro.</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon da 50 ml</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Disponibile tramite il numero di catalogo Fisher Scientific 14-959-49A</td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon da 15 ml</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Disponibile tramite il numero di catalogo Fisher Scientific 14-959-70C</td></tr></tbody></table>

non plasmatici incollaggio di pdms economico per la fabbricazione di dispositivi microfluidici

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In questo video ci dimostra come utilizzare il dispositivo a microfluidi neurone senza legame plasma. In alcuni casi può essere desiderabile ai dispositivi reversibilmente legame con il n ° Corning 1 bicchiere di copertura. Questo potrebbe essere dovuto, forse, di un detergente plasma non essere disponibile. In altri casi, può essere desiderabile per rimuovere il dispositivo dal vetro dopo la coltura di neuroni per alcuni tipi di microscopia o per immunostaining, anche se non è necessario rimuovere il dispositivo per immunostaining poiché i neuroni possono essere macchiati nel dispositivo. Alcuni ricercatori, tuttavia, preferiscono ancora per rimuovere il dispositivo. In questo caso, il legame reversibile del dispositivo al vetro di copertura lo rende possibile. Ci sono alcuni svantaggi non plasmatici legame dei dispositivi che si forma non così stretti di un sigillo. In alcuni casi, gli assoni possono crescere sotto i solchi piuttosto che attraverso di loro. Inoltre, poiché il vetro e PDMS sono idrofobiche, i liquidi non facilmente inserire il dispositivo che rende necessario a volte la forza dei media e altri reagenti nel dispositivo. Liquidi entrerà nel dispositivo tramite un&#39;azione capillare, ma ci vuole molto più tempo rispetto a dispositivi che sono stati incollati al plasma. Il pulitore plasma crea temporaneo accuse idrofilo sul vetro e dispositivi che facilitano il flusso di liquidi attraverso il dispositivo dopo l&#39;incollaggio in pochi secondi. Per i dispositivi legati non al plasma, il flusso di liquido attraverso i dispositivi richiede diversi minuti. E &#39;anche importante notare che i dispositivi da utilizzare con i plasma di incollaggio devono essere sterilizzati prima, mentre i dispositivi trattati al plasma non hanno bisogno di essere sterilizzati prima dell&#39;uso, perché il più pulito al plasma li sterilizzare.

In questo video ci dimostra come utilizzare il dispositivo a microfluidi neurone senza legame plasma.

Non plasmatici Incollaggio di PDMS Economico per la Fabbricazione di dispositivi microfluidici

In questo video, dimostriamo come utilizzare il dispositivo microfluidico per neuroni senza ricorrere al bonding al plasma. In alcuni casi potrebbe essere desiderabile eseguire un bonding reversibile...

I laboratori che eseguono regolarmente fotolitografia e litografia morbida dispongono solitamente di quello che viene definito un pulitore al plasma. Un pulitore al plasma è dotato di una bobina elettrica, che genera un gas parzialmente ionizzato composto da elettroni, ioni, atomi e molecole neutri. Il plasma crea specie reattive sulla superficie del vetro e del dispositivo, che, quando vengono accostati, formano un legame permanente.Il plasma rende inoltre idrofila la superficie del dispositivo, facilitando l'aggiunta di liquidi. In alcuni casi, tuttavia, un legame permanente e irreversibile non è desiderabile. Inoltre, molti laboratori non dispongono di un pulitore al plasma.Per affrontare questa problematica, oggi verrà dimostrata una procedura di legame reversibile e non covalente del dispositivo neurale al vetrino, basata sulle forze elettrostatiche tra il PDMS e il vetro, che formano un'aderenza impermeabile e adatta alla coltura cellulare. Vorrei presentarvi Kiana Lee. Sarà lei a eseguire le dimostrazioni oggi.Vetrini Corning numero 1 di 24 millimetri per 40 millimetri vengono puliti utilizzando un bagno ad ultrasuoni con acqua. I vetrini vengono posizionati su un supporto in acciaio inossidabile, che viene quindi inserito in un contenitore di vetro riempito con acqua deionizzata. Il contenitore di vetro viene poi collocato nel bagno ad ultrasuoni.I vetrini sono quindi sottoposti a sonica per 30 minuti. Dopo la sonicazione, l'acqua deionizzata viene rimossa dal contenitore di vetro. Il 70% di etanolo viene aggiunto nel contenitore di vetro con i vetrini, che viene quindi portato all'interno di un armadio a sicurezza biologica standard per mantenerli sterili.Dopo aver sciacquato con etanolo al 70%, il supporto in acciaio inox viene rimosso dal contenitore di vetro e le lamelle di vetro vengono lasciate asciugare completamente per diverse ore o durante la notte. Successivamente, all'interno della cappa a sicurezza biologica, le lamelle di vetro vengono rivestite con PLL immergendole in un contenitore riempito con soluzione di PLL. Le lamelle di vetro vengono lasciate in ammollo nella soluzione di PLL per un minimo di tre ore o durante la notte.Dopo il rivestimento con PLL, il liquido di PLL viene rimosso dalla piastra e quindi i vetrini vengono accuratamente risciacquati con acqua deionizzata. Dopo aver risciacquato più volte il vetrino rivestito con PLL con acqua, la piastra viene riempita d'acqua e i vetrini vengono lasciati in ammollo per diverse ore. Dopo essere stati in ammollo per diverse ore in acqua deionizzata, l'acqua viene aspirata dalla piastra.Le lamelle di vetro verranno risciacquate rapidamente, quindi rimossi dalla vaschetta e posizionati su un supporto in acciaio inossidabile, dove saranno lasciati asciugare tutta la notte. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, i dispositivi per neuroni vengono introdotti nella cappa e risciacquati accuratamente con etanolo al 70% per sterilizzarli. L'eccesso di etanolo viene quindi aspirato dal dispositivo. I dispositivi vengono quindi lasciati asciugare tutta la notte nella cappa a sicurezza biologica il giorno successivo.Questo dispositivo sterile per neuroni viene semplicemente posizionato sulla superficie pulita, sterile e trattata con PLL del vetrino. Il PDMS forma con il vetro un sigillo reversibile impermeabile ai liquidi. Il dispositivo viene fissato al vetro applicando una leggera pressione, quindi vengono immediatamente aggiunte le cellule o il mezzo.Aspettare troppo a lungo prima di aggiungere il mezzo o le cellule al dispositivo dopo il montaggio può rendere più difficile l'ingresso del liquido nel dispositivo. È importante notare che il liquido non entra con facilità nei dispositivi non trattati al plasma con la stessa rapidità dei dispositivi trattati al plasma. I dispositivi trattati al plasma sono inizialmente idrofili e subito dopo il trattamento al plasma i liquidi fluiscono facilmente all'interno del dispositivo idrofilo, mentre il flusso attraverso i dispositivi non legati al plasma è molto più lento.In alcuni casi, potrebbe essere necessario utilizzare una pipetta per forzare il liquido all'interno del dispositivo. In questo video, abbiamo mostrato come effettuare il bonding non al plasma del dispositivo neuronale al vetrino. Questo è un metodo efficiente ed economico per legare in modo reversibile il PDMS alle superfici di vetro.Speriamo che questo video ti sia stato utile e informativo. Questo è tutto dal John Lab. Grazie per aver guardato.

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