Name: Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-25T11:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Impara a isolare e arricchire le cellule staminali tumorali cerebrali (BTIC) mediante citometria a flusso e colture ottimizzate. Questo metodo consente di analizzare l'autorinnovamento e i profili di espressione genica per studiare la patogenesi dei tumori cerebrali.

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Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Istituto Ontario di ricerca sul cancro (OICR), la Terry Fox Foundation e l&#39;American Association of Neurological Surgeons.

1. Cultura del tessuto cerebrale Tumore <ol><li> Aggiungere 200 microlitri Liberase scongelato (Roche Applied Science) a 15 ml di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF-vedi tabella 1) e riporre in bagno d'acqua a 37 ° C. Liberase TM è una miscela di enzimi proteolitici utilizzati per dissociare campioni di tessuto primari, così come tumorspheres coltura. Diversamente Tripsina-EDTA, il metodo Liberase conserva l'antigene di superficie CD133. Per un campione di tessuto di circa 0,5 cm 3, si usa 200 ml di Liberase. Se il tessuto è più piccolo, usiamo 100 ul. </li><li> Portare soluzione di cloruro di ammonio (tecnologie di cellule staminali) a temperatura ambiente. Soluzione del cloruro di ammonio lisa delicatamente le cellule rosse del sangue, con effetto minimo sulle altre cellule. Non contiene un fissativo. </li><li> In sterile cappa di sicurezza biologica, aggiungere 5 ml di aCSF al contenitore del campione, turbine a sciacquare il tessuto, quindi pipettare off. Questo passaggio aiuta a rimuovere globuli rossi (RBC). </li><li> Trasferimento tumore al tessuto cerebrale a una sterile 100 millimetri di Petrish. </li><li> Utilizzando forbici fini o bisturi e pinze, disaggregare tessuto di consistenza liquami. </li><li> Raccogliere il campione con una pipetta 10 ml regolare o pinze e frammenti di trasferimento nella provetta contenente preriscaldata aCSF con Liberase. </li><li> Posto su incubatore-agitatore (30 rpm) e impostare a 37 ° C, per 15 minuti. </li><li> Filtrare il lisato tessuto filtro a 70 micron cella in una provetta da 50 ml Falcon. </li><li> Centrifugare il filtrato fino a 280 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante con attenzione e valutare le dimensioni e il colore del pellet cellulare risultante: pellet, che sono di colore rosa o rosso indicano un crescente numero di globuli rossi. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di PBS. </li><li> Aggiungere una quantità appropriata di soluzione di cloruro di ammonio (4-12 ml) in base alle dimensioni di pellet e la contaminazione dei globuli rossi (soluzione di cloruro di ammonio è molto gentile e maggiori quantità non sono dannose per altre cellule dei globuli rossi). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Spin le cellulegiù a 280 xg per 5 min. </li><li> Risciacquare una volta con 10 ml di PBS sterile. </li><li> Risospendere in 5 ml di mezzo completo NSC (Tabella 2) e trasferimento ad un ultra-bassa attacco 60 piastra di coltura tissutale mm (Corning). Usiamo ultra-low piastre di coltura di legame con le superfici idrogel legati covalentemente che sono idrofili e carica neutra, per ridurre al minimo cellule attaccamento-mediata differenziazione. </li></ol> Per i primi giorni in coltura, non cambiano i mezzi di comunicazione: top-up solo con 1-2 ml supporti in base alle esigenze, quindi continuare a osservare terreni di coltura e il cambiamento quando il colore dei media diventa leggermente gialla. 2. Tumorsphere dissociazione per citometria a flusso <ol><li> Valutare tumorspheres al microscopio: se la dimensione della sfera è&gt; 100 micron, la dissociazione è raccomandato in quanto potrebbe diventare più grandi sfere necrotico al centro. </li><li> Trasferimento cultura a 15 tubo ml. </li><li> Aggiungere 2-3 ml sterile PBS di risciacquare a fondo piatto e aggiungere al tubo conico. </li><li> Centrifugare a 280 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 - 2 ml PBS sterile. </li><li> Aggiungere 10 microlitri Liberase. </li><li> Incubare a 37 ° C bagno d'acqua per 3 minuti. Rimuovere e valutare visivamente la sospensione, se ciuffi più visto, triturare delicatamente con una punta di 1000 microlitri pipetta. </li><li> Qualora invece ciò persiste, incubazione per altri 1-2 min. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 5 ml di PBS sterile e centrifugazione a 280 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere in 500-1000 microlitri PBS sterile 2 mM EDTA. </li><li> Valutare il numero e la vitalità cellulare con trypan blu. </li><li> Regolare conteggio delle cellule a 1 milione / ml in PBS 2 mM EDTA. </li></ol> 3. Superficie di colorazione <ol><li> Trasferire 100 pl di sospensione di 1x10 6 cellule / ml in provette per test di flusso 12x75 mm. </li><li> Aggiungere la quantità appropriata di anticorpi. Controlli Isotype trovati deve essere utilizzato per ciascunanticorpo (vedi Tabella 3). </li><li> Incubare per 30 min in ghiaccio. </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS 2 mM EDTA a ciascun tubo di flusso. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 4 min, decantare e asciugare. </li><li> Risospendere il pellet in 300 ml di PBS 2 mM EDTA. </li><li> Aggiungere 10 microlitri colorante redditività 7AAD a ciascuna provetta e incubare per almeno 15 minuti in ghiaccio. </li><li> Analizzare tramite citometria a flusso. </li></ol> 4. Flusso di acquisizione e analisi Citometria Le specifiche di acquisizione e analisi dei dati di flusso sono strumento-dipendente. Rappresentativi campioni negativi sono gestiti e le impostazioni dello strumento istituito per Forward (dimensione) e laterale (granularità) dispersione. Questo modello di dispersione permette all'utente finale di visualizzare tutte le celle nel campione, compresi detriti. Una regione è generalmente disegnato intorno alle cellule di interesse. (Figura 4a) Le impostazioni vengono quindi stabiliti per tutti i rivelatori di fluorescenza necessarie per posizionare le cellule negative entro la prima decade di afintensità trama luorescence. Quando più di un colorante o fluorocromo è utilizzato, singoli controlli colorati deve essere eseguito per stabilire valori di compensazione del colore (sottrazione di interferire emissioni di fluorescenza). Quando si esegue cellule vive, un colorante vitalità come 7-AAD (7-Amino-actinomicina D - eccitazione 488/emission 655) viene utilizzata e una seconda regione disegnata per escludere cellule morte (Figura 4b). Entrambe queste regioni sono applicate a qualsiasi ulteriore analisi dei campioni. 5. Auto-rinnovamento Assay Il dosaggio chiave che è molto facilitata dalla crescita clonale sfera è il test in vitro di auto-rinnovamento capacità, il saggio di diluizione limitante. Tumorspheres sono dissociati e distribuiti a diluizioni fino ad una singola cella per pozzetto, e il tasso di formazione sfera successiva più di 7 giorni di coltura viene calcolata. Il giorno 7, la percentuale di pozzetti non contenenti sfere per ciascuna densità di placcatura cella F (0) viene calcolato e tracciaticontro il numero di cellule per pozzetto (x). Il numero di cellule necessario per formare almeno una tumorsphere in ogni pozzetto è determinata dal punto in cui la linea attraversa il livello 0,37 (F = 0 e-x). In una distribuzione di Poisson di cellule, f 0 = 0,37 corrisponde alla diluizione di una cellula per pozzetto, in modo che questo calcolo (il 37% intersecano) riflette la frequenza di cellule staminali clonogeniche nella popolazione di cellula intera (Figura 5). 6. Single Cell RT-PCR Cellule singole a partire da diverse popolazioni sono ordinati per Beckman Coulter MoFlo XDP su siti di reazione su un vetrino AmpliGrid (Beckman Coulter cat # AG480F). Singola cella di RT-PCR viene eseguita utilizzando AmpliGrid singola One Step RT-PCR sistema (Beckman Coulter cat # OAX04515) secondo le specifiche del produttore. Brevemente, una singola cellula è depositato in ogni sito di reazione di una diapositiva AmpliGrid, la presenza di una singola cella in ciascunsito di reazione confermata mediante microscopia. Trascrizione inversa (RT) viene effettuata immediatamente dopo la cernita per evitare che il campione venga compromessa. Il mix RT master è preparato fresco, secondo le istruzioni del kit (Tabella 4). Abbiamo usato 0,03 pl di 25 pM primer casuali (Promega) per reazione; 1 ml di miscela principale viene aggiunto al centro di ogni sito di reazione. Questo viene immediatamente rivestito con 5 ml di soluzione di sigillatura (Beckman Coulter cat # OAX04503). Utilizzando un AmpliSpeed ​​diapositiva cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101), vetrini vengono incubati a 25 ° C per 10 min, 42 ° C per 10 min, e 55 ° C per 45 min. Dopo trascrizione inversa, 3 ml di DNasi / RNasi-free acqua viene aggiunta ad ogni sito di reazione, e la miscela in una provetta da PCR (1 tubo / sito). In una piastra di PCR, un volume di reazione di 10 microlitri è utilizzato per la PCR quantitativa: 8 microlitri qPCR Master Mix (5 pl SYBR Green (Quanta), 1 microlitri di acqua, 1 ml di 10 pM avanti e mix primer reverse) più 2 &amp;mu, l della miscela RT. Tempo reale quantificazione, i campioni vengono eseguiti in un cycler BioRad utilizzando il seguente programma: 95 ° C per 10 min, 45 cicli di 95 ° C per 30 sec, 60 ° C per 60 sec, 72 ° C per 60 sec, seguita da 10 min a 72 ° C e analisi della curva di fusione. Valori Ct sono stati determinati utilizzando Opticon Monitor 3 (BioRad). Tre geni possono essere valutati per cella, anche GAPDH come gene housekeeping. L'espressione genica è normalizzato espressione GAPDH, secondo 2-ACT. Almeno una dozzina di singole celle della stessa popolazione della stessa specie può essere usato come biologico replicati per compensare la mancanza di tecnica replicati. 7. Risultati rappresentativi La figura 1 mostra una risonanza magnetica (MRI) di un paziente con un rappresentante GBM. Campioni tumorali cerebrali sono ottenuti da pazienti consenzienti subito dopo l'intervento chirurgico, come approvato dalla Hamilton Health Sciences / McMaster Salute Sciences ricerca Comitato Etico. Una parte di ciascun campione è dato al neuropathologist per la diagnosi clinica di routine. Il campione rimanente viene elaborato come mostrato in Figura 2. Le cellule tumorali, una volta piastrate in mezzi completi staminali neurali cellulari con fattori di crescita, tumorspheres forma come mostrato in Figura 3. Le cellule tumorali sono marcati con marcatori neurali superficie di cellule staminali CD133 e CD15 e analizzate mediante citometria di flusso, come mostrato in Figura 4. Cellule singole a partire da popolazioni diverse per esempio, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- vengono poi ordinati in piastre a 96 pozzetti (Figura 5a) o in diapositive AmpliGrid (Figura 6a). Nella piastra a 96 pozzetti, singole cellule che possiedono la capacità di auto-rinnovamento (ad esempio cellule CD133 +), (figura 5b), possono formare tumorspheres (Figura 5c) seguendo incudi incubazione. A autorinnovamento grafico può essere tracciato (Figura 5d) contando il numero di sfere formate per pozzetto. Singole cellule ordinati nel sito di reazione della slitta Ampligrid (Figura 6a). Gli RNA estratto da cellule singole possono essere retrotrascritto utilizzando il AmpliSpeed ​​Advalytix (Figura 6b). Il cDNA ottenuto viene utilizzato per eseguire in tempo reale RT-PCR (figura 6c). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg"> Figura 1. Immagine di risonanza magnetica (MRI) di un GBM paziente. Risonanza magnetica del cervello di una ragazza di 16 anni con un mese di storia di mal di testa e una storia settimana di vomito, letargia e offuscamento della vista. Sequenza FLAIR assiale mostra una grande bi-emisferica ("farfalla") GBM. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg"> Figura 2. Trattamento del tumore al cervello. Campioni di tumori cerebrali sono obtainato da pazienti consenzienti subito dopo l'intervento chirurgico. Essi sono dissociate meccanicamente come illustrato (a) e sono quindi dissociate enzimaticamente in aCSF con Liberase incubando in un rpm 30 dondolo incubatore a 37 ° C per 15 min (b). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg"> Figura 3. Popolazioni BTIC formare tumorspheres nella cultura. Dissociati cellule tumorali cerebrali placcati in mezzi completi staminali neurali cellulari con fattori di crescita forma tumorspheres. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg"> Figura 4. L'analisi citofluorimetrica delle popolazioni BTIC. (A) in avanti rispetto a proprietà scatter laterali forniscono l'immagine di tutte le cellule, compresi i residui (b) Le cellule che macchiano con il colorante vitalità 7-AAD sono esclusi dall'analisi. (C) La posizione dei quadranti statistici è determinato mediante opportuni controlli Isotype (d) cellule tumorali colorate con superficie markers CD15 e CD133-PE-APC. (D) Moflo cell sorter XDP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg"> Figura 5. Limitando l'analisi di diluizione BTICs rivela la loro capacità di auto-rinnovamento. (A) Cellule di diluizioni differenti sono ordinati in 96 pozzetti contenenti 200 ml di NSC a (b) una singola cellula per pozzetto. (C) Dopo un periodo di 7 giorni di incubazione, si forma un tumorsphere. La morfologia di tumorspheres secondari è identica a quella di tumorspheres primari. (D) La media intercetta x valori possono essere calcolati da limitare l'analisi di diluizione per ciascun sottotipo di tumore per rivelare il numero di cellule necessario per formare almeno una tumorsphere per pozzetto. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg"> Figura 6. Analisi dell'espressione genica di una singola cellula BTICè possibile utilizzando singola cellula RT-PCR tecnologia. (a) cellule singole da una popolazione BTIC possono essere ordinati su vetrini AmpliGrid. (B) sintesi di cDNA viene eseguita su singole cellule su vetrini AmpliGrid utilizzando il AmpliSpeed ​​Advalytix. (C) PCR quantitativa in tempo reale viene eseguita sul cDNA sintetizzato da singole cellule BTIC. <table border="1"><tbody><tr><td> 2M NaCl </td><td> 62 ml </td></tr><tr><td> KCl 1M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> 155 mm NaHCO 3 </td><td> 169 ml </td></tr><tr><td> Glucosio 1M </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,9256 ml </td></tr><tr><td> Purelab Ultra H 2 0 </td><td> 749,84 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1 artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) -. 1.000 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Archivio multimediale basali </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> 480 ml </td></tr><tr><td> N2 supplemento </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 3,0 g </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina (60 mg / ml) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Sopravvivenza neurale fattore-1 (NSF-1) </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Supporto di cellule staminali neurali. Supporto NSC completi (preparato fresco prima dell'uso): Supporti NSC basali + 20 ng / ml EGF (epidermal growth factor) + 20 ng / ml bFGF (fattore di crescita dei fibroblasti) + 10 ng / ml LIF (fattore inibitorio di leucemia) * + 10 microlitri / ml antibiotico-antimicotico * Fattore inibitorio della leucemia (LIF): Questo reagente da Millipore contiene una classe citochina interleuchina 6, una protein che sopprime la differenziazione spontanea delle cellule staminali che promuovono la manutenzione a lungo termine di colture di cellule staminali. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpi </td><td> Fornitore / CAT # </td><td> pl / test (in 100 pl) </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (Isotype controllo) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (Isotype controllo) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Anticorpi di flusso. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume (1 reazione) </td><td> Volume (48 reazione) </td></tr><tr><td> 2x singola cella tampone di reazione RT </td><td> 0,50 pl </td><td> 30,0 pl </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (10 U / pl) </td><td> 0,02 pl </td><td> 1,2 pl </td></tr><tr><td> 5X singola cella RT enhancer </td><td> 0,15 pl </td><td> 9,00 pl </td></tr><tr><td> RT singola cella Enzyme Mix </td><td> 0,04 pl </td><td> 2,4 pl </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> 0,1 pl </td><td> 6,00 pl </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> portare a 1 pl </td><td> portare a 60 pl </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Composizione della miscela RT master per RTPCR singola cella (cat # OAX04515).

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<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707(1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12, 4565(1992).</li>
<li>Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sorting%3A+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166, 747(1969).</li>
<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495(1975).</li>
<li>Barrett, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+does+not+predict+tumor+growth+potential+in+mouse+models+of+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma.</a> Cancer Cell. 21, 11(2012).</li>
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<li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat. Protoc. 1, 1559(2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il gambo ipotesi cancro cella 10, sulla base di lavoro 21 nella leucemia, cancro al seno e cancro al cervello 11 4,5, suggerisce che solo una frazione relativamente piccola di cellule nel tumore, chiamate cellule staminali tumorali, possiedono la capacità di proliferare e ampiamente auto -rinnovo. La maggior parte delle cellule tumorali perdono la capacità di proliferare e auto-rinnovano come differenziarsi in cellule che diventano la firma fenotipica del tumore. Trovare le cellule chiav...

I tumori cerebrali sono tra i tumori più aggressivi ed eterogenei conosciute negli esseri umani. Anche se la loro diagnosi precoce e la diagnosi sono state facilitate dalla moderna neuro-tecnologia di imaging, ci manca ancora terapie curative per i tumori cerebrali, in particolare per quelli invasivi diffuse, o quelle situate in profondità nel cervello. I tumori cerebrali rappresentano la principale causa di mortalità per cancro nei bambini a causa della loro natura altamente aggressiva e spesso incurabile. Glioblastoma (GBM), il più comune tumore cerebrale primario negli adulti, è uno dei tumori più aggressivi umani, temeva per la sua prognosi uniformemente fatale 1. Questo tumore altamente maligno astrocitari (di grado 4) di solito si verifica negli emisferi cerebrali degli adulti, e può verificarsi anche nei bambini piccoli e neonati. La sua crescita è rapida e infiltrante, e diagnostici caratteristiche patologiche includono pleomorfismo nucleare, la proliferazione microvascolare e necrosi 2,3. Per adults con GBM di recente diagnosi, la sopravvivenza mediana va raramente oltre 12 mesi 1, con le risposte in genere poveri a tutte le modalità terapeutiche. Abbiamo notato che ci sono molte somiglianze funzionali e genetici condivisi da cellule staminali somatiche e cellule tumorali, e che le vie molecolari che regolano lo sviluppo normale del cervello sono spesso alterata nelle cancro. Nell&#39;applicare staminali paradigmi biologia cellulare allo studio dei tumori cerebrali, siamo stati i primi ricercatori a identificare in modo prospettico e purificare una sottopopolazione di cellule di GBM umani che esibivano le proprietà delle cellule staminali di proliferazione, self-renewal e la differenziazione in vitro 4 e in vivo 5. Abbiamo applicato condizioni di coltura e saggi originariamente utilizzate per caratterizzare normali cellule staminali neurali (NSC) in vitro 6,7 a più tumori cerebrali pediatrici e adulti, e arricchito di questi-come le cellule staminali da cellule di ordinamento per la neurale marcatore di superficie delle cellule progenitrici CD133 8 ,9. Il CD133 + frazione di tumore al cervello conteneva cellule che hanno una frequenza molto più elevata di apertura del tumore rispetto al-CD133 frazione in NOD-SCID 5,10 topo cervello. Questo formalmente stabilito che solo un sottoinsieme rara di cellule cerebrali tumorali con caratteristiche di cellule staminali sono tumore avvio, guadagnandosi il nome di &quot;tumore al cervello iniziare cellule&quot; o &quot;BTICs&quot;. L&#39;identificazione romanzo di BTICs fornisce nuove intuizioni tumorigenesi cervello umano, dando un forte sostegno per l&#39;ipotesi delle cellule staminali del cancro 10-13 come base per molti tumori solidi, e stabilisce un nuovo bersaglio cellulare per ulteriori terapie antitumorali efficaci 14-20. Terapie che si concentrano a uccidere la maggior parte del tumore può perdere la rara simil-staminali frazione, permettendo al tumore di continuare a crescere. Terapie che si concentrano a uccidere le cellule staminali tumorali possono fornire un migliore trattamento e la prognosi per i pazienti con tumori cerebrali. Al fine di studiare le popolazioni BTIC, abbiamo affinato la nostra culture protocolli per selezionare specificamente per popolazioni di cellule all&#39;interno di tumori cerebrali umani che possiedono proprietà delle cellule staminali. Privo di siero, cellule staminali neurali (NSC) medie consente il mantenimento di uno stato indifferenziato di cellule staminali, e l&#39;aggiunta del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore inibitorio di leucemia (LIF) consente la proliferazione di multi-potenti, auto-rigenerante, e espandibili tumorspheres umani. Qui, descriviamo i metodi coinvolti nel trattamento dei tumori cerebrali primari e coltura in mezzo NSC per arricchire per le popolazioni BTIC. Abbiamo chiamato il nostro sistema modello sperimentale &quot;isolati di pazienti BTIC&quot; per sottolineare il fatto che queste cellule sono solo in minima parte coltivate in staminali condizioni delle celle alla selezione di popolazioni di cellule staminali. immunolabelling successiva delle popolazioni BTIC di indicatori chiave di cellule staminali, quali CD133 e CD15 e citometria analisi dei flussi è anche descritto. Discutiamo poi l&#39;analisi di diluizione limitante,che aiuta nello studio del self-renewal potenziale di BTICs. Infine, abbiamo esplorare l&#39;analisi di espressione genica delle cellule rare ordinando singole cellule su vetrini AmpliGrid ed eseguendo singola cella RT-PCR. Queste tecniche sono applicabili anche ad altri tumori cerebrali come il medulloblastoma, ependimoma e gliomi pediatrici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> N2 supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Wisent </td><td> 330-050-EL </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> Neural Fattore di sopravvivenza -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Il fattore di crescita epidermico (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Fattore inibitorio della leucemia (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Antibiotico / micotica </td><td> Wisent </td><td> 450-115-EL </td></tr><tr><td> Liberase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Soluzione di cloruro di ammonio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di ordinamento

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Tumori cerebrali sono in genere costituito da cellule morfologicamente diverse che esprimono una varietà di marcatori neurali lignaggio. Solo una frazione relativamente piccola di cellule nel tumore con proprietà staminali, chiamate cellule tumorali cerebrali avvio (BTICs), possiedono una capacità di differenziare lungo linee multiple, auto-rinnovano, e avviare tumori in vivo. Abbiamo applicato condizioni di coltura in origine usati per le normali cellule staminali neurali (NSC) a una varietà di tumori del cervello umano e ha scoperto che questo metodo cultura seleziona appositamente per stelo tipo popolazioni. Terreno privo di siero (NSC) consente il mantenimento di uno stato indifferenziato di cellule staminali, e l&#39;aggiunta di EGF e bFGF permette la proliferazione di multi-potente, auto-rinnovano, e tumorspheres espandibili. Per caratterizzare ulteriormente popolazione BTIC ciascun tumore, valutiamo marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso. Possiamo anche ordinare le popolazioni di interesse per caratteriz più specifichezione. Autorinnovamento saggi vengono eseguiti su singole BTICs filtrate in piastre a 96 pozzetti, la formazione di tumorspheres dopo l&#39;incubazione a 37 ° C indica la presenza di uno stelo o di cellule staminali. Il numero di cellule multiple di una particolare popolazione può anche essere ordinati in diversi pozzetti per limitare l&#39;analisi di diluizione, per analizzare la capacità di auto-rinnovamento. Possiamo anche studiare l&#39;espressione genica differenziale all&#39;interno di una popolazione cellulare particolare utilizzando singola cella RT-PCR. I protocolli seguenti descrivono le procedure per la dissociazione e la coltura di campioni umani primari per arricchire per popolazioni BTIC, così come la dissociazione di tumorspheres. Sono inclusi anche i protocolli per la colorazione per citometria a flusso o smistamento, self-renewal saggi, e singola cellula RT-PCR.

L&#39;identificazione delle cellule tumorali del cervello avvio (BTICs), le cellule rare all&#39;interno di una proprietà eterogenee di cellule staminali tumorali che possiedono, fornisce nuove intuizioni patogenesi umana tumore al cervello. Abbiamo affinato specifiche condizioni di coltura per arricchire per BTICs, e noi abitualmente uso citometria a flusso per arricchire ulteriormente queste popolazioni. Autorinnovamento saggi e analisi trascritto di singola cellula RT-PCR può successivamente essere eseguita su queste cellule isolate.

Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

I tumori cerebrali sono tipicamente composti da cellule morfologicamente diverse che esprimono una varietà di marcatori della linea neurale. Solo una frazione relativamente piccola...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le cellule che iniziano il tumore cerebrale in vitro. Ciò si ottiene dissociando prima meccanicamente ed enzimaticamente i tumori umani primari e poi coltivandoli in condizioni di coltura libera da siero di cellule staminali. La successiva formazione della sfera viene monitorata per tre-cinque giorni.Le sfere tumorali vengono quindi nuovamente digerite enzimaticamente e i loro marcatori di superficie vengono valutati mediante citometria a flusso. Il passaggio finale consiste nell'ordinare le cellule desiderate in piastre a 96 pozzetti o vetrini a griglia PL per un'ulteriore caratterizzazione. In definitiva, la capacità di auto-rinnovamento e l'espressione genica differenziale della popolazione selezionata possono essere valutate limitando l'analisi di diluizione e la R-T-P-C-R a singola cellula.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi di massa dei tumori, è che isola in modo prospettico le cellule cerebrali che iniziano il tumore cerebrale o le popolazioni di cellule staminali tumorali. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo applicato le condizioni di coltura originariame

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Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.

Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

Questo protocollo video viene illustrato un nuovo metodo per la generazione e la successiva purificazione delle cellule progenitrici neuronali da una fonte rinnovabile di cellule staminali neuronali (NSC) sulla base della loro fisico (granularità e dimensione interna) e proprietà di fluorescenza usando citometria di flusso tecnologia.

Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Questo protocollo video dimostra l'applicazione del colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) per l'identificazione e la separazione di differenti sottopopolazioni di cellule di glioblastoma umano basati sulla frequenza di divisione cellulare.

Identificazione e isolamento di Slow-divisione delle cellule nel glioblastoma umano per mezzo di Carboxy fluoresceina succinimidile Ester (CFSE)

In questo rapporto, descriviamo un protocollo per isolare popolazioni altamente purificate di leucociti che infiltrano i tumori. Questo protocollo è stato adattato dal Miltenyi Biotech protocollo per migliorare la resa e la purezza per isolare cellule dal tessuto tumorale complessa.

Isolamento di cellule immunitarie di tumori primari

Il video dimostra l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il tumore dal cervello di un topo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica. Segue la centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere le cellule immunitarie per ulteriori analisi.

Isolamento delle cellule immunitarie infiltranti il tumore da un cervello murino

In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come...

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

Riportiamo un metodo basato sul Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) per isolare le cellule staminali neurali (NSC) e la loro progenie dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello del topo adulto. Applicato a topi transgenici FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), consente lo studio della progressione del ciclo cellulare mediante imaging dal vivo.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Un protocollo di screening efficiente è presentato per l'identificazione di piccole molecole che promuovono astroglial differenziazione in cellule staminali di glioblastoma (artigiano). Il dosaggio è basato su un reporter di differenziazione di cellule staminali per cui l'espressione della GFP avanzata (eGFP) è guidato da promotore umano di GFAP.

Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma

L'eterogeneità intratumorale è una caratteristica intrinseca dei tumori, compresi i gliomi. Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente che utilizza una combinazione di tamponi e centrifugazione a gradiente per isolare singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati per studi di sequenziamento di RNA a nucleo singolo e ATAC.

Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

Impara a isolare e arricchire le cellule staminali tumorali cerebrali (BTIC) mediante citometria a flusso e colture ottimizzate. Questo metodo consente di analizzare l'autorinnovamento e i profili di espressione genica per studiare la patogenesi dei tumori cerebrali.

Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

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