Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le cellule che iniziano il tumore cerebrale in vitro. Ciò si ottiene dissociando prima meccanicamente ed enzimaticamente i tumori umani primari e poi coltivandoli in condizioni di coltura libera da siero di cellule staminali. La successiva formazione della sfera viene monitorata per tre-cinque giorni.

Le sfere tumorali vengono quindi nuovamente digerite enzimaticamente e i loro marcatori di superficie vengono valutati mediante citometria a flusso. Il passaggio finale consiste nell'ordinare le cellule desiderate in piastre a 96 pozzetti o vetrini a griglia PL per un'ulteriore caratterizzazione. In definitiva, la capacità di auto-rinnovamento e l'espressione genica differenziale della popolazione selezionata possono essere valutate limitando l'analisi di diluizione e la R-T-P-C-R a singola cellula.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi di massa dei tumori, è che isola in modo prospettico le cellule cerebrali che iniziano il tumore cerebrale o le popolazioni di cellule staminali tumorali. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo applicato le condizioni di coltura originariamente utilizzate per le cellule staminali neurali normali a una varietà di tumori cerebrali umani, e abbiamo scoperto che questo metodo di coltura specificamente selezionato per popolazioni simili a cellule staminali che dimostrano la procedura saranno gli studenti laureati associati di ricerca post-dottorato CHITRA AL, Bran Van Manen e Sarah Nolte, e il nostro tecnico di citometria a flusso Nicole McFarland, tutti del nostro laboratorio Inizia aggiungendo 200 microlitri di liasi di disgelo a 15 millilitri di liquido cerebrospinale artificiale o A CSF, quindi posizionando il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Portare anche la soluzione di cloruro di ammonio a temperatura ambiente in questo momento.

Quindi, a cinque millilitri di A CSF in un contenitore campione di tessuto tumorale cerebrale, agitare il contenitore per risciacquare e poi convogliarlo via dal fluido per rimuovere i globuli rossi. Ora trasferisci il tessuto in una piastra di Petri sterile da 100 millimetri e usa forbici sottili e pinze per disaggregare il tessuto fino a ottenere una consistenza di impasto. Quindi raccogliere il campione utilizzando una pipetta normale da 10 millilitri e una pinza e trasferire i frammenti di tessuto nella provetta contenente il preriscaldatore A CSF.

Con liase, posizionare la provetta su un agitatore per incubatrice a 30 giri/min e 37 gradi Celsius. E poi, dopo 15 minuti, filtrare il lisato tissutale attraverso un colino cellulare micrometrico di sette D in un tubo conico da 50 millilitri. Far girare il filtrato verso il basso per cinque minuti a 280 GS a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere con cura il laccio e valutare le dimensioni e il colore del pellet risultante. Successivamente, risospendere il pellet in un millilitro di PBS e quindi aggiungere una quantità appropriata di soluzione di cloruro di ammonio in base alle dimensioni del pellet e alla contaminazione dei globuli rossi. Quindi, dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, centrifugare le cellule dopo un secondo lavaggio in PBS, risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno completo di cellule staminali neuro e quindi trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri a bassissimo legame per i primi giorni.

Completare le colture con uno o due millilitri di terreno secondo necessità, cambiando il terreno solo quando il colore diventa leggermente giallo. Inizia trasferendo la coltura della sfera tumorale in una provetta conica da 15 millilitri. Aggiungere due o tre millilitri di PBS sterile per risciacquare accuratamente la piastra, quindi aggiungere il lavaggio al tubo dello sphe tumorale.

Dopo aver centrifugato le cellule, rimuovere la laccia e risospendere il pellet in uno o due millilitri di PBS sterile, quindi aggiungere 10 microlitri di liasi. Una sfida di questa tecnica è quella di mantenere la vitalità delle cellule staminali tumorali solide durante l'elaborazione. Qualsiasi manipolazione delle cellule durante la coltura e la sificazione richiede un tocco delicato.

Quindi, incubare la provetta in un bagnomaria a 37 gradi Celsius. Dopo tre minuti, rimuovere e valutare visivamente la sospensione. Se si notano più grumi, utilizzare una punta per pipetta da 1000 microlitri per iterare delicatamente il cluster di cellule.

Ora lavare le cellule in cinque millilitri di PBS sterile e poi, dopo aver rimosso il surnatante S, risospendere il pellet in 500-1000 microlitri di PBS sterile più due millimolari di EDTA. Infine, dopo aver valutato il numero di cellule e la vitalità utilizzando il blu Trian, regolare la conta cellulare a 1 milione di cellule per millilitro in PBS più EDTA. Inizia trasferendo 100 microlitri di sospensione cellulare per test in singoli tubi di flusso da 12 x 75 millimetri.

Dopo aver aggiunto gli anticorpi appropriati, incubare i campioni su ghiaccio per 30 minuti, quindi lavare via gli anticorpi non legati in due millilitri di PBS più EDTA per provetta. Ora decantare la soluzione di lavaggio, tamponare i tubi e poi risospendere i pellet cellulari in altri 300 microlitri di PBS più EDTA. Quindi aggiungere 10 microlitri dei sette coloranti vitali A a D in ogni tubo.

Dopo aver incubato le provette per almeno 15 minuti sul ghiaccio, le cellule sono pronte per l'analisi citofluorimetrica. Dopo aver utilizzato il campione di controllo negativo per regolare i parametri di dispersione diretta e laterale, disegnare una regione attorno alle celle di interesse simile a quella mostrata in questo grafico rappresentativo in alto. Se necessario, regolare la tensione sui rivelatori di fluorescenza utilizzati per posizionare le celle negative entro le prime due decenni.

Quindi, utilizzare il colorante di vitalità sette A a d per creare una seconda regione per l'esclusione delle cellule morte simile alla regione mostrata in questo grafico rappresentativo in alto. Quindi applicare sia il cancello di dispersione che quello di cellule vive a tutti i grafici di fluorescenza e utilizzare i controlli colorati singoli per sottrarre qualsiasi sovrapposizione spettrale. Infine, eseguire gli esempi.

Iniziare il saggio di diluizione limitante ordinando le cellule dissociate a diluizione variabile in una singola cellula per pozzetto in pozzetti individuali di una piastra da 96 pozzetti contenente 200 microlitri di NSC media che le neurosfere di solito si formano in un periodo di sette giorni e il tasso di successiva formazione della sfera negli ultimi sette giorni in coltura può essere calcolato per una singola cellula R-T-P-C-R. Dopo aver selezionato le singole cellule delle popolazioni di interesse sui siti di reazione di un vetrino a griglia ampia, aggiungere un microlitro di master mix al centro di ciascun sito di reazione, quindi rivestire immediatamente ogni sito con cinque microlitri di soluzione a soffitto. Quindi, utilizzando un ciclatore per vetrini ad alta velocità, incubare il vetrino per tre cicli di temperatura.

Dopo la trascrizione inversa, aggiungere tre microlitri di acqua priva di rase di DN a in ciascun sito di reazione. Quindi trasferire l'intera miscela da ciascun sito di reazione in singole provette per PCR. Infine, per la quantificazione in tempo reale, eseguire i campioni su un ciclatore BioRad.

Questa prima figura mostra una risonanza magnetica di un paziente rappresentativo con glioblastoma. Le cellule tumorali dissociate possono essere marcate con i marcatori delle cellule staminali della superficie neurale, CD 1, 33 e CD 15, e analizzate mediante citometria a flusso, come mostrato in questo dot plot rappresentativo. Qui viene mostrato il grafico di amplificazione per la reazione rappresentativa R-T-P-C-R a singola cellula.

I valori CT ottenuti da tale grafico possono essere utilizzati per calcolare i livelli di espressione relativi dei geni di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come dissociare enzimaticamente e coltivare il tessuto tumorale cerebrale primario per arricchirlo per le popolazioni di cellule staminali. Saprai anche come studiare la capacità di auto-rinnovamento e l'espressione genica differenziale di popolazioni di cellule staminali selezionate eseguendo analisi di diluizione limitante o R-T-P-C-R a singola cellula.