Generazione, purificazione e caratterizzazione di specie DISC1 Cell-invasive Protein

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è quello di generare dischi purificati. Uno aggregato in grado di invadere le cellule riceventi. Con il primo metodo verranno dimostrati due metodi diversi per raggiungere questo obiettivo.

L'asoma che forma la proteina fluorescente del disco uno di fusione è sovraespressa nelle cellule donatrici di neuroblastoma umano NLF. Le celle vengono poi lavate con PBS raccolto e stese senza l'uso di detergenti. Il DNA viene digerito e le zone agricole vengono purificate utilizzando un sistema a gradiente di saccarosio.

Gli agrio purificati con questo metodo hanno una bassa efficienza di invasione cellulare. L'approccio alternativo consiste nell'sovraesprimere gli amminoacidi da 5 98 a 7 85 della proteina ricombinante del disco uno in e coli. Il frammento proteico viene quindi marcato con DITE 5 94, dializzato e purificato utilizzando una matrice NI NTA che rimuove qualsiasi residuo disco multimerico colorante non legato.

Un frammento generato con questo metodo ha un'elevata efficienza di invasione cellulare per valutare l'invasione della cellula ospite. O il disco proteico fluorescente purificato, un risomes o il disco ricombinante marcato. Un frammento viene incubato con le cellule riceventi di interesse.

Il blu Trian viene quindi aggiunto per spegnere la fluorescenza extracellulare e l'invasione viene visualizzata mediante microscopia confocale. Finora, l'aggregazione proteica non è stata una caratteristica riconosciuta delle malattie mentali croniche come la schizofrenia. Dove la proteina interrotta nella schizofrenia è una candidata l'invasività cellulare degli aggregati proteici è una caratteristica distintiva per le malattie di conferma delle proteine.

Qui mostriamo con due metodi che gli aggregati proteici del disco uno sono invasivi delle cellule e quindi che i disturbi correlati al disco uno o le neuropatie del disco uno sono disturbi di conferma delle proteine. I due metodi sono in primo luogo la purificazione di un disco a lunghezza intera, un ASOS da linee cellulari di neuroblastoma e, in secondo luogo, l'espressione di un disco multimerico C terminale. Un frammento in e coli così come la purificazione e l'etichettatura con il colorante fluorescente.

Mentre il primo metodo porta solo a un'invasione cellulare a bassa efficienza di circa lo 0,3% delle cellule che assorbono i microsomi purificati, il frammento proteico ricombinante pur infetta fino al 20% delle cellule esposte. I metodi qui descritti dovrebbero essere trasferibili ad altre proteine in cui la formazione di acrosomi o l'assemblaggio multimerico sono stati dimostrati in modo convincente. In ciascuno dei 10 piatti da 10 centimetri.

Seminare 1,5 volte 10 nelle sei cellule di neuroblastoma umano e LF in un terreno RPMI 1640 integrato e crescere durante la notte. Il giorno successivo, le cellule dovrebbero essere dal 70 all'80% confluenti, etichettare, cinque piastre per la trasfezione con PC, DNA 3.1, MRFP e EGFP, dischi umani a lunghezza intera marcati uno e cinque per la trasfezione con il solo plasmide EGFP. Per ogni piatto da 10 centimetri, unire 15 microgrammi di DNA plasmidico 30 microlitri incontrati e 750 microlitri.

Opti MEM in una provetta da microcentrifuga e incuba a temperatura ambiente per 20 minuti, pipettando su e giù. Quindi, per trasfettare le cellule, aggiungere la soluzione reagente di trasfezione del DNA, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con 5% CO 2 48 ore dopo la trasfezione, monitorare l'espressione del disco uno a lunghezza intera MRFP e confermare la formazione di agrozone al microscopio a fluorescenza. Alcune cellule ospitano una massiccia inclusione proteica fluorescente, come mostrato qui.

Questo protocollo combina un metodo per purificare i corpi di Lewy dal tessuto cerebrale e il protocollo per isolare aggregati più grandi o zone agricole poiché i metodi già esistenti si basano sull'uso di detergenti, l'isolamento di proteine prive di detergenti per l'applicazione in saggi di invasività cellulare è fondamentale. Successivamente, aspirare il lavaggio medio con PBS e aggiungere 400 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi contenenti PBS. Quindi raschiare le cellule e aggiungere un millilitro di sospensione cellulare e 10 perle di ceramica a una provetta di lisi da due millilitri.

Lizza le cellule utilizzando tre impulsi a 62° su un omogeneizzatore di lisi 24 pre-cellulare. La forza meccanica del processo può aumentare la temperatura all'interno del campione fino a oltre 37 gradi Celsius. Quindi è necessario prestare attenzione a raffreddare il campione con ghiaccio Dopo la procedura di lisi, dopo aver raffreddato le cellule sul ghiaccio, aggiungere 10 millimolari di cloruro di magnesio 40 unità per millilitro di DNAA e incubare per 60 minuti a 37 gradi Celsius agitando.

Preparare 10 millilitri ciascuno di 80%50% e 20% di saccarosio in peso per volume in PBS. Quindi, in un tubo conico da 15 millilitri, preparare la sfumatura di saccarosio iniziando con due millilitri di saccarosio all'80% seguiti da due millilitri di saccarosio al 50% e due millilitri di saccarosio al 20%. Versare la sfumatura lentamente e fare attenzione a non disturbare gli strati già versati.

Successivamente, sovrapporre il lisato digerito sopra il gradiente e centrifugare per 15 minuti a 1000 volte G a quattro gradi Celsius. Con la rottura, raccogliere con cura l'interfaccia tra lo strato di saccarosio dal 50 all'80% con una pipetta e mescolare con cinque volumi di una centrifuga a provette coniche da 15 millilitri per 15 minuti a 1000 volte G a quattro gradi Celsius. Rimuovere con cautela il surnatante e conservare la zona agricola contenente pellet.

Ripetere il lavaggio altre due volte in questa interfaccia. Le zone Agri sono fluorescenti e possono essere visualizzate al microscopio sotto luce UV dopo l'ultimo lavaggio, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 250-500 microlitri di PBS. Questo pellet contiene le zone agricole depurate.

Aggiungere 10 microlitri di disco MRFP, una sospensione di asoma a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente SHSY cinque cellule Y di neuroblastoma umano. Esprimere costitutivamente il disco solubile GFP un'estremità C su vetrini di vetro sterili e incubare per 48-72 ore dopo l'incubazione. Lavare le cellule tre volte con PBS e spegnere la fluorescenza extracellulare con blu triano allo 0,04% per cinque minuti.

Quindi lavare con PBS per rimuovere il trian blu. Quindi, metti il piatto sul ghiaccio e aggiungi il 4% di PFA e PBS per 10 minuti per fissare le cellule. Quindi lavare una volta con acqua sterile e montare i vetrini coprioggetto su vetrini con oro prolungato con mezzo di montaggio DPI.

Confermare l'assorbimento dell'invasione di esogeno. Zone aggro applicate mediante colocalizzazione con proteine reclutate espresse dalle cellule riceventi nelle immagini di Zack. Questo Zack comprende circa sei micrometri di profondità.

24 immagini scattate a passi di 200 nanometri. La fluorescenza del disco MRFP in una zona agri mostrata in rosso recluta il disco terminale citosolico GFPC. Un frammento mostrato in colocalizzazione verde si presenta come giallo e indica che le zone agri sono entrate nel citosol ricevente e hanno reclutato una proteina precedentemente solubile del disco uno.

In questa parte del protocollo, il disco umano sarà etichettato con DITE 5 94. Questo D consente il monitoraggio diretto della proteina ricombinante senza la necessità di ulteriori colorazioni immunitarie. Iniziare liberando la proteina preparata come descritto nel documento di accompagnamento dal mercaptoetanolo a fascio dializzandola tre volte in due litri di PBS ad una diluizione di uno a 2000.

Successivamente, etichettare un disco da milligrammo, uno con DITE 5 94 IDE, sciogliere un milligrammo per millilitro di proteina in PBS e aggiungere cinque millimolari di TCEP per recuperare i gruppi TH liberi, aggiungere 20 microlitri del colorante disciolto DMF alla reazione e incubare per due ore a temperatura ambiente utilizzando una cassetta per dialisi SLI con un cutoff di peso molecolare di 10, 000. I dalton dializzano la proteina tre volte in PBS con un rapporto di uno a 2000 per due ore ogni volta. Successivamente per aumentare ulteriormente la purezza della proteina marcata.

Viene eseguita una purificazione di affinità basata su tag hiss su una colonna NI NTA. Lavare un millilitro di matrice NI NTA con 10 millilitri. PBS applica quindi la proteina dializzante marcata alla colonna e la lascia scorrere sulla colonna.

Lentamente la soluzione perderà una parte del suo colore blu a causa del legame della proteina alla matrice NTA, il colorante libero non marcato rimarrà nel flusso attraverso. Una volta inserita la soluzione proteica. La colonna, lavare la colonna tre volte con 20 millilitri di PBS per eluire la proteina, aggiungere due millilitri di PBS contenente 500 millimolari di ole alla colonna.

Impostare la valvola a bassa velocità ed eluire goccia a goccia monitorando la banda colorata sulla colonna N NI NTA. Per essere accennato, questa frazione colorata dell'eluato contiene una proteina ricombinante marcata, trasferisce l'EIT in una cassetta per dialisi SLI e dializza l'EIT tre volte a 10 millimolari di NAPI a una diluizione da uno a 2000 per due ore ciascuno in due litri dopo la dialisi. Spingere l'EIT attraverso un filtro a siringa sterile da 0,45 micrometri, quindi aliquotare in cinque campioni da 100 microlitri e congelare in azoto liquido.

La quantità totale di proteine dovrebbe essere compresa tra 0,5 e un microgrammo per millilitro in ogni aliquota da 100 microlitri. Per valutare l'invasività della proteina, aggiungere un terreno contenente da cinque a 10 microgrammi per millilitro marcato con disco ricombinante, una proteina a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente cellule di neuroblastoma umano SH, SY, cinque Y riceventi. Esprimendo costitutivamente il disco di marcatura GFP solubile, un'estremità C su vetrini di vetro sterile, incubare per 48-72 ore.

Spegnere, fissare la fluorescenza extracellulare e montare le cellule come fatto per le cellule trattate con la zona agri confermano l'invasione della proteina ricombinante applicata esogenamente da Zack Imaging. Quando la proteina marcata viene assorbita, viene rilevata all'interno del perimetro delle cellule riceventi nelle immagini generate dalla microscopia confocale. Questo Zack comprende circa cinque micrometri di profondità a 24 passi di 220 nanometri.

Qui, il disco ricombinante, un frammento da 5 98 a 7 85, mostrato in rosso, viene assorbito dalle cellule riceventi che esprimono il C terminale solubile GFP, un disco marcato in verde, per determinare l'invasività del disco. Le zone agro di un aggregato proteico costituite da MRFP marcate a lunghezza intera sono state purificate da cellule NLF e applicate a cinque cellule Y SH SY riceventi, come descritto in questa foto, come mostrato qui. Un acrosoma del disco marcato A-M-R-F-P ha invaso un neuroblastoma umano SH SY, cinque cellule Y che esprimono GFP solubile, disco terminale C marcato uno.

Inoltre, l'asoma del disco uno marcato con MRFP è stato in grado di reclutare il disco uno marcato con GFP solubile in aggregati insolubili per determinare l'invasività del disco ricombinante marcato con luce DIA, è stato applicato a cellule di neuroblastoma SH SY cinque Y che esprimono il disco GFP solubile uno, come mostrato qui. Le mutere proteiche del disco uno ricombinante mostrate in rosso hanno invaso la cellula ricevente I punti gialli indicano un reclutamento di GFP solubile marcato C disco terminale uno in aggregati etichettati disco uno ricombinante espresso e purificato da E coli era anche invasivo per i neuroni in vivo quando la proteina multimerica è stata iniettata stereotassicamente nella corteccia prefrontale mediale di un ratto. L'imaging di Zack conferma la presenza di una proteina ricombinante del disco uno nel neurone corticale di ratto colorato con un anticorpo contro i nuclei neuronali.

Vi abbiamo appena mostrato due metodi per generare aggregati del primo disco per studiare l'invasione cellulare. Utilizzando uno di questi metodi, possiamo studiare gli effetti cellulari dell'assorbimento degli aggregati del disco uno senza le variabili potenzialmente confondenti dell'espressione genica ricombinante mediante trasfezione di DNA estraneo. Queste tecniche possono essere applicate per studiare gli effetti biologici della patologia della proteina del disco uno in vitro nelle cellule e in vivo mediante inoculazione intracerebrale o altra somministrazione in modelli animali.

Siamo fiduciosi che queste tecniche possano essere trasferite anche ad altri aggregati proteici eventualmente con lievi modifiche al protocollo adottato per ogni particolare proteina. Quando si esegue questa procedura, assicurarsi di dedicare del tempo all'analisi diligente delle immagini di microscopia confocale.